Summary
Protokollen opsummerer bedste praksis for at minimere mikrobiel biobyrde i et renrumsmiljø og inkluderer strategier som miljøovervågning, procesovervågning og produktsterilitetstest. Det er relevant for fremstillings- og testfaciliteter, der skal opfylde gældende standarder for god vævspraksis og gældende standarder for god fremstillingspraksis.
Abstract
Et velvalideret og holistisk program, der inkorporerer robust beklædning, rengøring, miljøovervågning og personaleovervågningsforanstaltninger, er afgørende for at minimere den mikrobielle biobyrde i produktionssuiter til cellulær terapi og de tilsvarende testlaboratorier for at sikre, at faciliteterne fungerer i en tilstand af kontrol. Sikring af produktsikkerhed via kvalitetskontrolforanstaltninger, såsom sterilitetstest, er et lovkrav for både minimalt manipulerede (afsnit 361) og mere end minimalt manipulerede (afsnit 351) humane celler, væv og cellulære og vævsbaserede produkter (HCT / P'er). I denne video giver vi en trinvis vejledning til, hvordan du udvikler og inkorporerer den bedste aseptiske praksis for drift i et renrumsmiljø, herunder beklædning, rengøring, iscenesættelse af materialer, miljøovervågning, procesovervågning og produktsterilitetstest ved hjælp af direkte podning, leveret af United States Pharmacopeia (USP<71>) og National Institutes of Health (NIH) Alternative Sterility Testing Method. Denne protokol er tænkt som referencevejledning for virksomheder, der forventes at opfylde gældende god vævspraksis (cGTP) og nuværende god fremstillingspraksis (cGMP).
Introduction
Implementering af et stærkt mikrobielt overvågningsprogram gennem miljøovervågning (EM), procesovervågning og produktsterilitetstest er et lovkrav til nuværende god vævspraksis (cGTP) og nuværende god fremstillingspraksis (cGMP) i cellulære terapilaboratorier1. Derudover forventer United States Food and Drug Administration (FDA), at laboratoriet, der udfører kvalitetskontrol (QC) test af produktet, også bør anvende faciliteter og kontroller, der kan sammenlignes med dem, der anvendes til aseptiske påfyldningsoperationer2.
Denne protokol har fire hovedafsnit: 1) Aseptisk praksis, herunder personalebeklædning, rengøring og iscenesættelse af materialer; 2) EM, herunder levedygtige luft- og overfladekulturer og ikke-levedygtig partikelluftovervågning 3) procesovervågning, herunder bundfældningsplader og handsketaptagning med fingerspidser, og 4) produktsterilitetstest via den kompendiale United States Pharmacopeia (USP) <71> metode3 eller NIH Alternative Sterility Testing Method4. Når de anvendes sammen, kan disse foranstaltninger være en effektiv metode til at sikre, at et anlæg forbliver i en tilstand af kontrol.
De teknikker, der beskrives her, er ikke nye; Imidlertid mangler de nuværende standarder fra regulatorer og faglige organisationer detaljer, hvilket har ført til fravær af mikrobiel overvågning eller implementering af ikke-standardiseret praksis, især i akademiske centre, hvor on-site produktion og produktsterilitetstest dukker op med en hurtig hastighed 1,5,6 . Denne protokol kan bruges som vejledning til at oprette et mikrobielt overvågnings- og kontrolprogram, der opfylder lovkrav, når det bruges sammen med slutbrugervalidering og risikovurderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aseptisk praksis
- Personalebeklædning til et renrum
BEMÆRK: Denne procedure er baseret på indledende beklædning i et uklassificeret rum efterfulgt af adgang til et International Organization for Standardization (ISO) 8-område og derefter et ISO7-område. Denne procedure er relevant for laboratorier, der forsøger at konvertere eksisterende rum til en renrumsfunktion. Ideelt set ville al indledende beklædning forekomme i et ISO8-klassificeret rum (ikke i et uklassificeret rum).- Fastgør løst hår. Vask hænder, og skift til scrubs (langærmede skrubbetoppe og skrubbebukser i fuld længde foretrækkes). Saml og skift til renrumssko med skoovertræk på.
- Desinficer hænderne ved hjælp af en alkoholbaseret hånddesinfektionsmiddel først og derefter igen mellem hvert af følgende trin: iført ikke-sterile handsker og derefter et skægbetræk (for enhver mængde synligt ansigtshår), hvis det er relevant. Don en ikke-steril bouffant, og dæk underarmene med ikke-sterile ærmer, hvis langærmede skrubbetoppe ikke er blevet brugt.
- Fjern skoovertrækkene, træd på den klæbrige måtte foran ISO8-forrumsdøren med hver fod, efter at skodækslet er fjernet. Sørg for, at hele foden kommer i kontakt med den klæbrige måtte inden indtræden. Kassér skoovertrækkene, og dekontaminer handskerne og dørhåndtaget med 70% steril isopropylalkohol (sIPA). Gå ind i ISO8-forrummet.
- Saml en steril hætte, steril ansigtsmaske, sterile overalls, sterile bagagerumsbetræk og sikkerhedsbriller. Dekontaminer handskerne med 70% sIPA. Tag sikkerhedsbriller på, og iscenesæt materialerne på en ren overflade i henhold til trin 1.5.
- Tag et nyt par ikke-sterile skoovertræk på over de dedikerede renrumssko, og træd op på den tarvelige måtte foran det sekundære forrum. Sørg for, at hele hver fod kommer i kontakt med den klæbrige måtte. Dekontaminer handskerne med 70% sIPA. Saml de iscenesatte beklædningsforsyninger, og gå ind i det sekundære ISO7-forrum, der forbliver på den beskidte side af afgrænsningslinjen.
- Don den sterile hætte og den sterile overall, rør kun indersiden af beklædningsmaterialet og sørg for, at hættens hals er gemt inde i oversiden for at skabe en komplet forsegling. Tag de sekundære sterile støvlebetræk på. Dekontaminer handskerne med 70% sIPA mellem hvert påklædningstrin.
- Kontroller, at beklædningen er taget korrekt på, dekontaminer handskerne med 70% sIPA, og indtast ISO7-rummet.
BEMÆRK: Kontroller regelmæssigt beklædningsmaterialet for integritet. Hvis du er kompromitteret, skal du straks forlade renrummet og klæde dig på igen.
- Donning for et biologisk sikkerhedsskab (BSC)
- Kjole i henhold til trin 1.1 ovenfor med disse yderligere fremgangsmåder.
- Saml sterile handsker og sterile ærmer. Rengør BSC i henhold til trin 1.4, og iscenesæt materialerne i henhold til trin 1.5. Dekontaminer handskerne med 70% sIPA.
- Tag sterile ærmer på aseptisk over overallen ved hjælp af tommelfingerstropper, hvis de er til stede. Tag sterile handsker på over eksisterende handsker, og sørg for, at handskens manchet strækker sig over det sterile ærme. Dekontaminer handskerne med 70% sIPA mellem hvert trin. Indtast BSC.
BEMÆRK: Kontroller regelmæssigt beklædningsmaterialet for integritet. Hvis du er kompromitteret, skal du straks forlade renrummet og klæde dig på igen.
- Aftagning af beklædningsmaterialerne
- Gå ud af BSC, og fjern forsigtigt det øverste par handsker og sterile ærmer. Dekontaminer de indvendige handsker med 70% sIPA.
- Gå ind i det sekundære og derefter primære forrum, og vent på, at døren lukker helt mellem hvert trin. Fjern materialerne i følgende rækkefølge: ydre sterile bagagerumsbetræk, overall, hætte og ansigtsmaske.
- Gå ud af det primære forrum, og fjern den ikke-sterile beklædning.
BEMÆRK: Rækkefølgen af fjernelse i det uklassificerede rum er ikke vigtig; De indre ikke-sterile skoovertræk bør dog forblive på renrumskoene til opbevaring i ikke-klassificerede rum. - Desinficer hænderne ved hjælp af en alkoholbaseret håndrenser, og vend tilbage til gadetøj.
- Rengøring af renrumsoverflader og BSC
- Saml en håndholdt rengøringsmoppe, eller få en ren serviet med lavt fnugindhold. Hvis du bruger en serviet med lavt fnugindhold, skal du folde kluden i kvarte og rotere mellem hver overflade. Mæt moppehovedet eller servietten med lavt fnugindhold med et godkendt desinfektionsmiddel.
- Arbejd bagfra og forfra (eller top til bund), rengør BSC ved hjælp af overlappende klude i følgende rækkefølge: HEPA-diffusorgrillen (toppen af BSC), BSC's bagvæg, begge sidevægge på BSC, rammen og arbejdsfladen. Til sidst tørres rammen af BSC med 70% sIPA for at fjerne eventuelle resterende desinfektionsmidler. Se figur 1 for et typisk BSC-rengøringsmønster.
- Iscenesættelse af materialer og udstyr i klassificerede miljøer
- Dekontaminere (dvs. fase) alle materialer, der kræver overførsel fra et ikke-klassificeret eller lavere klassificeret område til et højere klassificeret område (f.eks. fra et ISO8- til ISO7-rum) for at minimere overførslen af mikrober. Overførsel af materialer mellem områder med samme ISO-klassifikationsniveau kræver ikke iscenesættelse.
BEMÆRK: Hvis materialerne er blevet terminalsteriliseret og er i flere poser, skal du fjerne den ydre pose / pose og flytte materialet ind i det klassificerede rum; Aftørring af den indvendige taske/pose er ikke påkrævet. - Få en serviet med lavt fnugindhold, og fold kluden i kvarte for at rotere til en ren side, når kluden bliver snavset. Mæt servietten med 70% sIPA eller et godkendt desinfektionsmiddel.
- Tør ydersiden af materialet/udstyret af overlappende servietter. Sørg for, at alle områder af emnet tørres af, herunder indersiden af emballagetætninger, der kan trækkes fra hinanden, og kroge/fordybninger på udstyret og andre uregelmæssigt formede forsyninger. For udstyr på hjul skal du sikre dig, at hele hjulet er blevet tørret af under iscenesættelsesprocessen (udstyret skal muligvis vippes forsigtigt for at gøre det muligt at dreje hjulene).
- Dekontaminere (dvs. fase) alle materialer, der kræver overførsel fra et ikke-klassificeret eller lavere klassificeret område til et højere klassificeret område (f.eks. fra et ISO8- til ISO7-rum) for at minimere overførslen af mikrober. Overførsel af materialer mellem områder med samme ISO-klassifikationsniveau kræver ikke iscenesættelse.
Figur 1: Eksempel på et BSC-rengøringsmønster. Arbejd bagfra og forfra (eller top til bund), rengør BSC ved hjælp af overlappende klude i følgende rækkefølge: HEPA-diffusorgrillen (toppen af BSC), BSC's bagvæg, begge sidevægge på BSC, rammen og arbejdsfladen. Til sidst tørres rammen af BSC med 70% sIPA for at fjerne eventuelle resterende desinfektionsmidler. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Miljøovervågning (EM)
- Levedygtig overfladeprøvetagning
- Sæt de nødvendige materialer til prøveudtagningssessionen i henhold til trin 1.5, og klæd dig ind i det klassificerede rum i henhold til afsnit 1.
BEMÆRK: Overfladeprøvetagningen skal udføres før luftprøvetagningen på et nærmere angivet sted. Hvis du bruger flere plader til overfladeprøve af et område, skal du ikke prøve nøjagtigt det samme sted. Brug kun kontaktplader til at prøve flade overflader for at sikre fuld kontakt og for at undgå potentiel skade på agaren. - Saml og mærk en tryptisk sojaagar med lecithinase og tween (TSALT) plade og en Sabouraud dextroseagar med lecithinase og tween (SABLT) plade for hvert prøveudtagningssted. Hold bunden af pladen med den ene hånd, fjern låget aseptisk, pas på ikke at røre ved den hævede agaroverflade.
- Berør den hævede agar på overfladen, der udtages, og sørg for, at hele overfladen er i kontakt, og tryk fast på pladen. Lad pladen være i kontakt med overfladen i mindst 5 sekunder.
- KRITISK: Flyt ikke pladen sideværts over overfladen, der prøvetages, da dette kan sprede potentiel vækst over overfladearealet, hvilket gør opløsningen af individuelle kolonier vanskelig. Udøv ikke overdreven kraft på kontaktpladen under prøveudtagningen, da agaroverfladen kan revne.
- Udskift dækslet aseptisk, pas på ikke at røre ved den hævede agaroverflade. Lås dækslet på plads, hvis kontaktpladen har et låsesystem. Rengør prøveudtagningsområdet med 70% sIPA for at fjerne eventuelt resterende medium fra overfladen. Pladerne pakkes løst i poser, og kulturerne inkuberes som beskrevet i tabel 1. Figur 2 viser et repræsentativt billede, der viser væksten af tre kolonidannende enheder (CFU'er) med to forskellige kolonimorfologier på en TSALT-overfladeprøvetagningsplade. Figur 3 viser kontaminering af en TSALT-plade med vækst på kanten af pladen, hvilket skyldes dårlig aseptisk teknik under prøveindsamlingen.
- Sæt de nødvendige materialer til prøveudtagningssessionen i henhold til trin 1.5, og klæd dig ind i det klassificerede rum i henhold til afsnit 1.
- Levedygtig luftprøvetagning
- Sæt de nødvendige materialer til prøveudtagningssessionen i henhold til trin 1.5, og klæd dig ind i det klassificerede rum i henhold til afsnit 1.
- Saml og mærk en tryptisk sojaagarplade (TSA) og en Sabouraud dextroseagarplade (SAB) for hvert prøveudtagningssted. Klargør luftprøveudtageren ved aseptisk at fjerne prøvetagningshovedet ved kun at gribe fat i yderkanten for at undgå kontaminering af hovedet.
- Hold prøveudtagningshovedet i den ene hånd, og anbring substratet aseptisk i pladeholderen på prøveudtageren. Hvis der er en stang, der er længere end de andre, skal du først indsætte mediet mod den længere stang og derefter skubbe pladen ned i de resterende ben for at fastgøre pladen.
- Fjern pladelåget aseptisk, og anbring det på en rengjort overflade af vejen, indtil prøveudtagningen er afsluttet. Udskift og fastgør prøveudtagningshovedet aseptisk, og tag kun fat i yderkanten for at undgå kontaminering af hovedet. Gentag trin 2.2.2-2.2.4 for det resterende medium, hvis der anvendes en flerhovedet luftprøveudtager.
- Luftprøveudtageren anbringes på prøveudtagningsstedet med prøveudtagningshovederne vendt i den fremherskende retning af luftstrømmens bevægelse. Sørg for, at udstødningen fra den ikke-levedygtige luftprøveudtager (hvis prøveudtagningen samtidig) ikke forstyrrer den levedygtige prøveudtager. Sørg for, at luftprøveudtageren er indstillet til de validerede indstillinger, og start prøvetagningscyklussen.
- Når prøveudtagningscyklussen er afsluttet, fjernes prøveudtagningshovedet aseptisk fra prøveudtageren ved kun at gribe fat i yderkanten for at undgå kontaminering af hovedet. Hold prøveudtagningshovedet i den ene hånd, og sæt agarpladens låg aseptisk på igen. Fjern pladen fra pladeholderen. Pladerne pakkes løst i poser, og kulturerne inkuberes som beskrevet i tabel 1.
- Desinficer prøveudtagningshovedet og området omkring pladeholderen med 70% sIPA. Fastgør prøveudtagningshovedet aseptisk, og tag kun fat i yderkanten. Trin 2.2.6 og trin 2.2.7 gentages for det resterende substrat, hvis der anvendes en flerhovedet luftprøveudtager.
BEMÆRK: Figur 4 viser en TSA-prøvetagningskultur for aktiv luft med vækst forårsaget af et forurenet prøvetagningshoved. Omvendt viser figur 5 en TSA-aktiv luftprøvetagningskultur uden vækst. Luftpåvirkningsindrykninger fra prøveudtagningshovedet kan ses på billedet.
- Ikke-levedygtig prøveudtagning
- Udfør en nulkontrol af laserpartikeltælleren før prøveudtagningsaktiviteterne for hver brugsdag. Det isokinetiske hoved fastgøres til partikeltællerens prøvetagningsport, enten direkte eller fastgjort til en slangelængde efter behov for prøveudtagningsstedet.
- Hvis der anvendes slanger, skal du bruge en kort længde, fordi slanger >1 m lange kan forårsage problemer med at tælle partikler på ≥1 μm og kan også føre til unødvendige bøjninger i røret. Sørg for, at partikeltælleren er indstillet til de validerede indstillinger. Det anbefales at indstille en forsinkelse på ca. 30 s for at tillade udgang fra prøveudtagningsområdet for at undgå afbrydelse af luftstrømmen under prøveudtagningen.
- Laserpartikeltællerens isokinetiske hoved anbringes på prøvetagningsstedet med det isokinetiske hoved vendt ind i den fremherskende retning af luftstrømmens bevægelse. Sørg for, at udstødningen fra den levedygtige luftprøveudtager (hvis prøveudtagningen samtidig) ikke forstyrrer den ikke-levedygtige prøveudtager. For områder, hvor luftstrømmen ikke er ensrettet, eller luftstrømsmønsteret er ukendt, skal du sikre dig, at det isokinetiske hoved vender lodret opad.
BEMÆRK: Hvis rotationsdesinfektionsmiddel eller 70% sIPA er blevet aerosoliseret i nærheden af luftprøveudtageren, skal du vente mindst 5 minutter, før prøveudtagningscyklussen påbegyndes. - Start prøvetagningscyklussen, og gå langsomt ud af prøvetagningsområdet for at undgå at forstyrre luftstrømmen.
KRITISK: Aerosoliser ikke væsker i nærheden af luftprøveudtageren under en prøvetagningscyklus, da dette vil medføre høje ikke-levedygtige tal. - Når prøveudtagningen er afsluttet, hentes laserpartikeltælleren. Registrer det gennemsnitlige partikeltal for 0,5 μm. Nogle faciliteter kan også spore og trende 5,0 μm.
- Gentag trin 2.3.3-2.3.6 for det næste prøveudtagningssted. Hvis du bevæger dig mellem rum eller BSC'er, skal du tørre ydersiden af den ikke-levedygtige partikelprøveudtager med 70% sIPA eller et godkendt desinfektionsmiddel. Undgå at få desinfektionsmiddel inde i det isokinetiske hoved, da dette kan føre til unøjagtige partikeltal.
| Kategori | Medie | Kulturforhold | Kultur observation | Resultater | ||||||
| Miljøovervågning | TSA (levedygtig luft) | 30 °C-35 °C, luft, i mindst 3 dage | Afslutning af inkubation | QA-gruppen for hvert anlæg bør fastsætte varslings- og aktionsgrænser for hver prøveudtagningstype og -placering. Aktionsgrænser for levedygtige prøver baseret på ISO-klassificering kan styres ved hjælp af PIC/S 009-16 (bilag) 18 og ISO-14644-1 7. Aktionsgrænser for ikke-levedygtige luftprøver er typisk sat til en procentdel af ISO-grænsen (f.eks. 99%). Varslingsgrænser for levedygtige prøver er typisk sat til en procentdel af aktionsgrænsen eller ISO-grænsen (f.eks. 95%). Se PDA TR-13 og USP<1116> for flere detaljer vedrørende etablering af alarm- og handlingsniveauer og validering af udvalgte dyrkningsforhold 8,9. | ||||||
| SAB (levedygtig luft) | 20 °C-25 °C, luft, i mindst 7 dage | |||||||||
| TSALT (levedygtig overflade) | 30 °C-35 °C, luft, i mindst 3 dage | Repræsentative billeder af EM-plader er vist i figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5. | ||||||||
| SABLT (levedygtig overflade) | 20 °C-25 °C, luft, i mindst 7 dage | |||||||||
| Overvågning af processer | TSA (bundfældningsplade) | 30 °C-35 °C, luft, i mindst 3 dage | Kun til orientering. Giver nyttige oplysninger i tilfælde af en OOS-undersøgelse som reaktion på en mislykket produktsterilitetstest. | |||||||
| SAB (bundfældningsplade) | 20 °C-25 °C, luft, i mindst 7 dage | Se figur 6 for et eksempel på en positiv bundfældningsplade. | ||||||||
| Handskede fingerspids prøveudtagning | TSALT | 30 °C-35 °C, luft, i mindst 48 timer dage efterfulgt af 20 °C-25 °C i mindst 5 dage 19. | Acceptkriterierne for GFS er <1 CFU/plade (dvs. ingen vækst) i henhold til PIC/S 009-16 (bilag) 18. Acceptkriterierne kan ændres efter facilitets-QA's skøn. | |||||||
| Test af produktets sterilitet | TSB (USP<71>) | 20 °C-25 °C, luft, i mindst 14 dage | Periodisk i hele inkubationsperioden (dag 3, 5, 7 og 14) | Ingen vækst. | ||||||
| FTM (USP<71>) | 30 °C-35 °C, luft, i mindst 14 dage | |||||||||
| iFA+ (NIH-metoden) | 30 °C-35 °C, luft, i mindst 14 dage | Automatisk overvågning ved hjælp af BacT/ALERT Dual-T-instrumentet. Visuel kontrol af hver flaske ved inkubationens afslutning for skimmelkugler anbefales kraftigt. | Se figur 8 for et eksempel på synlige formkugler, der ikke automatisk blev registreret af BacT/ALERT. | |||||||
| iFN+ (NIH-metode) | ||||||||||
| SAB (NIH-metoden) | 20 °C-25 °C i mindst 14 dage | Periodisk i hele inkubationsperioden (dag 3, 5, 7 og 14) | ||||||||
Tabel 1: Sammenfatning af de anbefalede dyrkningsbetingelser og forventede resultater. De kulturbetingelser, der beskrives her, er anbefalinger baseret på et valideret program, der anvendes på NIH. Hver slutbruger skal validere deres eget mikrobiologiske testprogram. De mikrobielle kontrol- og teststrategier kan variere mellem institutter afhængigt af variabler, herunder facilitetsdesign, facilitetsflora og produktrisikoklassificering.
Figur 2: Vækst på TSALT-pladen. TSALT-overfladeprøvetagningspladen, der viser tre CFU'er med to forskellige kolonimorfologier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forurening af TSALT-pladen under indsamling. TSALT-overfladekulturen, der viser en enkelt koloni på kanten af pladen, hvilket tyder på dårlig aseptisk håndtering under prøveudtagningsprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Dyrkning opnået ved hjælp af et prøvetagningshoved for forurenet luft. Eksempel på en TSA-aktiv luftprøvetagningskultur, der viser >100 kolonidannende enheder (CFU) af blandede morfologier. Vækstmønsteret indikerer kontaminering af prøvetagningshovedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Ingen vækst på en TSA aktiv levedygtig luftplade. TSA aktiv levedygtig luftplade, der ikke illustrerer nogen vækst efter inkubation. Indrykninger fra det aktive luftprøvetagningshoved kan ses på billedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Overvågning af processer
- Aflejringsplader (passiv luftovervågning)
- Placer mærkede TSA- og SAB-plader i nærheden af arbejdsområdet, men i et område, der ikke forstyrrer testen. Dokumentér starttidspunktet for prøveudtagningen, og åbn begge plader aseptisk, og placer lågene på en ren overflade i BSC væk fra arbejdsområdet.
- Bundfældningspladerne kan være åbne i højst 4 timer for at forhindre, at agaren tørrer ud. Luk lågene på pladerne ved afslutningen af behandlingen. Pladerne pakkes løst i poser, og kulturerne inkuberes som beskrevet i tabel 1. Figur 6 viser en enkelt koloniforurening på en TSA-luftbundfældningsplade.
- Prøveudtagning af handskefingerspidser (GFS)
- Få to mærkede TSALT-plader. Fjern låget på en plade aseptisk, og anbring det på en ren arbejdsflade væk fra prøveudtagningsområdet.
- Rul forsigtigt puden på hver finger og tommelfingeren på den ene hånd på pladens overflade (figur 7). Tag prøver af det største overfladeareal af hver finger/tommelfinger i stedet for spidsen. Brug tilstrækkelig kraft til at lave små fordybninger på agaren uden at revne agaroverfladen.
- Sæt låget tilbage på pladen aseptisk, og gentag trin 3.2.2 for den anden side. Desinficer hænderne med 70% sIPA ved afslutningen af prøveudtagningen. Pladerne pakkes løst i poser, og kulturerne inkuberes som beskrevet i tabel 1.
Figur 6: Vækst på en TSA-luftbundfældningsplade. En TSA-luftbundfældningsplade, der illustrerer en enkelt koloni af et forurenende stof, der dyrkes under passiv luftprocesovervågning i BSC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Prøveudtagning af handskefingerspidser. Den korrekte metode til at tage behandskede fingerspidsprøver ved hjælp af det største overfladeareal (eller pude) af hver finger/tommelfinger er vist til venstre. Den forkerte proces, hvor kun fingerspidsen er samplet, vises til højre. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Sterilitetstest ved direkte produktpodning
- Direkte podning efter USP<71>
- Få en mærket tryptisk sojabouillon (TSB) flaske og en mærket flydende thioglykolat medium (FTM) flaske for hver indsendt testartikel. Til testsessionen opnås en TSALT og en SABLT til levedygtig overfladeprøveudtagning, en TSA og en SAB-plade til bundfældningsplader og to TSALT-plader til GFS.
- Kjole til arbejde inde i BSC i henhold til trin 1.2. Rengør BSC i henhold til trin 1.4. Indsæt materialerne i BSC i henhold til trin 1.5. Udfør kontaktprøveudtagning af det kritiske arbejdsområde i henhold til trin 2.1, og tør overfladen af med 70% sIPA efter prøveudtagning. Forbered TSA- og SAB-bundfældningspladerne nær arbejdsområdet i henhold til trin 3.1.
- Hent testartiklen og de tilhørende TSB- og FTM-flasker. Hvis TSB- og FTM-flaskerne har en septum, skal du fjerne beskyttelseshætterne fra hver flaske og tørre septum af med en steril alkoholserviet. Hvis TSB- og FTM-flaskerne har en skruetop, skal du løsne hætten fra flaskerne (men fjern ikke hætten).
- Vortex testartiklen for at sikre en homogen suspension. Pod flaskerne med det validerede volumen af testartiklen (op til 10 ml/flaske) ved hjælp af en steril sprøjte og en kanyle (til septumhætter) eller en pipettor (til skruelåg).
- Efter podning tørres septum af med en steril alkoholserviet, og der indsættes en steril udluftningsenhed for at muliggøre luftudveksling under inkubation. For flasker med skruetop skal du lukke flasken, men lade hætten være 1/4 til 1/2 omgang løs for at muliggøre luftudveksling under inkubation. Gentag trin 4.1.3-4.1.5 for hver testartikel, der skal testes i den pågældende session.
- Luk TSA- og SAB-bundfældningspladerne aseptisk, og dokumentér sluttidspunktet for prøveudtagningen. Udfør GFS i henhold til trin 3.2, tør handskerne af med 70% sIPA efter prøveudtagning. Pladerne pakkes løst i poser, og kulturerne inkuberes som beskrevet i tabel 1.
- Overfør alle testmaterialerne ud af BSC'en, og rengør BSC i henhold til trin 1.4.
- Direkte podning efter NIH Alternative Sterility Testing Method
- Få en mærket i FA +, en mærket iFN + og en SAB-plade for hver testartikel. Til testsessionen opnås en TSALT og en SABLT til levedygtig overfladeprøveudtagning, en TSA og en SAB-plade til bundfældningsplader og to TSALT-plader til GFS.
- Kjole til arbejde inde i BSC i henhold til trin 1.2. Rengør BSC i henhold til trin 1.4. Indsæt materialerne i BSC i henhold til trin 1.5. Udfør kontaktprøveudtagning af det kritiske arbejdsområde i henhold til trin 2.1, og tør overfladen af med 70% sIPA efter prøveudtagning. Forbered TSA- og SAB-bundfældningspladerne nær arbejdsområdet i henhold til trin 3.1.
- Hent testartiklen og den tilhørende i FA+, iFN+ og SAB-plade. Fjern beskyttelseshætterne fra flaskernei FA+ og iFN+, og tør skillevæggen af med en steril alkoholserviet.
- Vortex testartiklen for at sikre en homogen suspension. Pod flaskerne med det validerede volumen af testartiklen (op til 10 ml/flaske) med en steril sprøjte og kanyle. Tør septum af med en steril alkoholserviet efter podning. Inkuber flaskerne på BacT/ALERT Dual-T-instrumentet som beskrevet i tabel 1.
- Ved hjælp af en pipetter podes SAB-pladen med den validerede mængde af testartiklen (højst 500 μL/plade) og streg til isolering med en steril sløjfe. Lad stå i 10 minutter for at sikre, at prøven ikke løber på pladelåget, når den vendes på hovedet til inkubation. Hver SAB-plade, der er podet med testartiklen, anbringes i en plastikpose, bindes løst og inkuberes som beskrevet i tabel 1.
- Luk TSA- og SAB-bundfældningspladerne aseptisk, og dokumentér sluttidspunktet for prøveudtagningen. Udfør GFS som beskrevet i trin 3.2, og tør handskerne af med 70% sIPA efter prøveudtagning. Pladerne pakkes løst i poser, og kulturerne inkuberes som beskrevet i tabel 1. Visuel inspektion af BacT/ALERT-flaskerne ved afslutningen af inkubationsperioden er afgørende for at detektere formkugler, der muligvis ikke er blevet opdaget af instrumentet (figur 8).
- Overfør alle testmaterialerne ud af BSC'en, og rengør BSC i henhold til trin 1.4.
Figur 8: Vækst af skimmelsvamp, der ikke kunne detekteres af BacT/ALERT. Eksempel på skimmelkugler, synlige for det blotte øje, der ikke automatisk blev registreret af BacT/ALERT-systemet. Baseret på disse resultater anbefaler vi terminal visuel inspektion af alle BacT / ALERT-flasker og tilsætning af SAB-pladen til svampekultur ved hjælp af NIH Alternative Sterility Testing Method. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forventede resultater er beskrevet i tabel 1. EM-dataene bør gennemgås og følges op med en passende undersøgelse og reaktion på handling, alarm eller ISO-grænseudsving. Hvis der sker en udsving for ikke-levedygtige partikler, skal man fortsætte i henhold til ISO 14644-bilag A, se A.5.57. Hvis udsvinget kan tilskrives en umiddelbart identificerbar unormal forekomst, skal de oprindelige prøvetagningsresultater dokumenteres, der skal tilføjes en bemærkning om at se bort fra de oprindelige resultater, og der skal gives en detaljeret beskrivelse af den unormale forekomst. Der kan udtages endnu en prøve på det pågældende sted. Hvis udsvinget ikke kan tilskrives en umiddelbart identificerbar unormal hændelse, dokumenteres prøveudtagningsresultatet. Udtag endnu et sæt ikke-levedygtige prøver på det pågældende sted umiddelbart efter at have identificeret resultatet uden for specifikationen (OOS). Dette kan bruges som en del af undersøgelsen. I henhold til ISO 14644-bilag A, afsnit A.5.6, skal OOS-resultatet undersøges, og den identificerede grundårsag skal afhjælpes.
En mislykket produktsterilitetstest vil resultere i turbiditet af USP<71>kulturen eller vækst i BacT/ALERT-flaskerne og/eller SAB-pladen (figur 8). Organismen bør identificeres på artsniveau, og der bør udføres passende følsomhedstest, hvis det er klinisk begrundet. Testlaboratoriet bør gennemføre en undersøgelse for at afgøre, om OOS-resultatet er gyldigt, eller om der var nogen potentiel laboratoriefejl, der kan have bidraget til OOS. Testning af retentionsprøven anbefales kraftigt. Beslutningen om at tilbageholde eller frigive produktet til infusion skal træffes af patientens kliniske plejeteam og af produktions-, mikrobiologi-, infektionssygdomme-, kvalitetssikrings- og regulatoriske anliggender. For HCT/P'er, der allerede kan være infunderet baseret på indledende procestest, skal patienten overvåges nøje, og der skal indsendes en hændelsesrapport til det relevante lægemiddelorgan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske områder i denne protokol, herunder vedligeholdelse af aseptisk teknik og ensrettet luftstrøm i renrum og BSC'erne. Bedste praksis omfatter at bevæge sig langsomt og bevidst for at minimere turbulens. Aseptiske manipulationer skal udføres fra siden af produktet, ikke ovenfra. Lukket systembehandling og anvendelse af terminalt steriliserede råmaterialer anbefales. At tale i kritiske områder og læne sig mod vægge eller udstyr bør undgås. På samme måde bør unødvendig berøring af ikke-sterile genstande og opsamling af nedfaldne genstande undgås, indtil den sterile behandling er afsluttet. Materialerne i BSC skal arrangeres for at forhindre blokering af luftstrømmen og for at opretholde ensrettet bevægelse fra ren til snavset. Operatørens bevægelse ind og ud af BSC bør minimeres. Dokumentationen af alle aktiviteter, herunder lotnumre, udløbsdatoer, kalibreringsdatoer, start-/stoptider og testpersonale for alle materialer, udstyr og processer inden for en prøveudtagnings- eller testsession er også kritisk.
EM-proceduren beskrevet her er afhængig af manuel inkubation og kolonitælling. Udformningen af et EM-program er efter slutbrugerens skøn. Prøveudtagningsstederne og testhyppigheden skal styres af PDA's tekniske rapport 13 8 og begrundes med en risikovurdering, der omfatter laboratoriearbejdsgangen, produktnærheden, stedets kritiske karakter, varighed og antallet af medarbejdere for hvert arbejdsgangstrin8. Et typisk EM-program bør omfatte de samlede luftpartikler (0,5 μm ikke-levedygtige partikler), levedygtig luftprøveudtagning (1.000 L) og levedygtig overfladeprøvetagning indsamlet under dynamiske forhold med en frekvens baseret på produktrisiko og historiske tendenser. Ugentlig prøveudtagning anbefales generelt for nye anlæg, indtil der er etableret tilstrækkelige datatendenser. Generel vejledning for EM og kulturforhold findes i tabel 1 og i USP<1116>9; andre har dog evalueret forskellige dyrkningsbetingelser, såsom medium, der kun var begrænset til TSA / TSALT, og forskellige inkubationstemperaturer, herunder dobbelt temperatur10,11. Automatiserede EM-instrumenter, der kombinerer inkubation med kimtællingspladeaflæsning, anvendes almindeligvis på det farmaceutiske marked som hurtige metoder 8,12. Det valgte EM-program skal valideres og afhænger typisk af anlæggets flora, inkubatorkapacitet, testvolumen og personalekapacitet. Desuden bør et etableret EM-program have en aktiv livscyklus med relevante justeringer af indsamlingsstederne, testhyppighed og/eller alarm-/handlingsgrænser baseret på en årlig gennemgang og en datadrevet risikovurdering8. Større ændringer i EM-tendenser kan udløse revurdering af rengøringsprogrammet. Desinfektionsmidler skal valideres via en desinfektionsmiddeleffektivitetsundersøgelse ved hjælp af repræsentative materialeoverflader mod facilitetsflora i den foreskrevne kontakttid, som beskrevet i USP<1072>13. Typiske desinfektionsmidler kan omfatte Vesphene III (kontakttid: 10 min), LpH III (kontakttid: 10 min) og et sporicid middel såsom Peridox RTU (kontakttid: 5 min). For bedste praksis skal desinfektionsmidler skiftes månedligt, og stikkontakter, mekaniske forbindelser og arbejdsflader, der er under udstyr i BSC, skal rengøres rutinemæssigt.
Det mindste produktvolumen, der skal testes for sterilitet, er defineret i USP<71>3 og er baseret på det samlede slutproduktvolumen. Desværre blev USP<71> oprindeligt designet til sterile lægemiddelprodukter og anerkendes som uegnet til produkter med kort holdbarhed på grund af den langsomme behandlingstid og det høje produkttestvolumen14. USP<1071> anerkender, at alternative hurtige mikrobielle metoder kan være gavnlige, og at lavere produkttestmængder kan være acceptable, når der er anvendt en risikobaseret tilgang14. I betragtning af begrænsningerne i USP<71> til sterilitetstest af cellulære terapiprodukter er alternative metoder såsom automatiserede BacT / ALERT-respirationsmetoder blevet anvendt i industri 1,4,6. Enhver anvendelse af en alternativ testmetode kræver imidlertid streng slutbrugervalidering for at påvise, at produktet ikke er ringere end den kompendiale USP<71> metode for det pågældende produkt 5,15,16. Metodeegnethedstest for hvert nyt produkt er også påkrævet for at sikre, at produktet ved det valgte podningsvolumen og testbetingelser ikke hæmmer påvisningen af forurenende stoffer på lavt niveau6. Det er derfor muligt, at testvolumen og podningsvolumen kan variere mellem produkter afhængigt af resultatet af valideringsundersøgelserne. Membranfiltrering, en sekundær metode beskrevet i USP<71>, kan anvendes til at udtage prøver af et større prøvevolumen i en enkelt test. Validerings- og metodeegnethedstest bør omfatte organismer ud over de seks kompendie-QC-isolater. Der bør fokuseres på hyppigt genvundne anlægsflora og tidligere produktkontaminanter. Der bør lægges særlig vægt på svampe, da respirationsmetoder alene har vist suboptimal ydeevne 4,17, hvorfor NIH Alternative Sterility Testing Method inkluderer en parret svampekultur på SAB og en terminal visuel inspektion af BacT / ALERT-flaskerne.
En væsentlig begrænsning for ethvert mikrobielt kontrolprogram er den retrospektive karakter, hvori resultaterne er tilgængelige. Guldstandardtest er kulturbaseret, hvilket er langsomt og kan føre til konstante reaktive foranstaltninger til korrigerende handlinger. Hurtigere testmetoder kræver streng validering, men disse kan stadig ikke give realtidssikkerhed for mikrobiel overvågning og kontrol. Desuden fanger mikrobiologiske kulturer kun en lille delmængde af tid under en produktions- eller testsession. Det er derfor afgørende, at aktiv mikrobiel overvågning sker hyppigt risikobegrundet for at sikre, at tendensdataene er veletablerede. Dette vil gøre det muligt at anvende passende fastsatte varslingsgrænser til at forudsige potentielle afvigelser fra mikrobiel kontrol, før de opstår.
Etableringen af et robust cGTP/cGMP-program tager tid og kræfter og kan desværre ikke bare overføres fra et anlæg til et andet. De Forenede Staters Food and Drug Administration forventer, at alle programmer gennemgår slutbrugervalideringstest på trods af den potentielle tilgængelighed af tredjeparts offentliggjorte resultater, der viser deres effektivitet. Derfor kan mikrobielle kontrol- og teststrategier variere mellem institutter afhængigt af variabler, herunder facilitetsdesign, facilitetsflora og produktrisikoklassificering. De strategier, der er skitseret i denne protokol, hjælper med at skabe en ramme, hvorigennem man kan etablere et robust mikrobielt overvågnings- og kontrolprogram for cGTP/cGMP-laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Intramural Research Program fra National Institutes of Health Clinical Center. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-25°C Incubator | Lab preference | ||
| 30-35°C Incubator | Lab preference | ||
| Alcohol-based hand sanitizer | Lab preference | ||
| BacT/ALERT Dual-T instrument | BioMerieux Industry | ||
| Beard cover | Lab preference | ||
| Biosafety cabinet (BSC) | Lab preference | ||
| Cleanroom shoes | Lab preference | ||
| Fluidthioglycollate medium (FTM) | Hardy Diagnostics | U84 | USP |
| Handheld cleaning mop | Contec | 2665LF | |
| Hypodermic needle | Lab preference | ||
| iFA+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412990 | |
| iFN+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412991 | |
| Isokinetic head | Lab preference | ||
| Laser particle counter | TSI Incorporated | 9500-01 | |
| LpH III | Steris | 1S16CX | |
| Mirror | Lab preference | ||
| Non-sterile bouffant | Lab preference | ||
| Non-sterile gloves | Lab preference | ||
| Non-sterile shoe covers | Lab preference | ||
| Non-sterile sleeve covers | Lab preference | ||
| Parafilm | Lab preference | ||
| Peridox RTU | Contec | CR85335IR | |
| Plastic bag | Lab preference | ||
| Sabouraud Dextrose Agar with Lecithinase and Tween (SABLT) | Hardy Diagnostics | P595 | USP, irradiated |
| Sabouraurd Dextrose Agar (SAB) | Hardy Diagnostics | W565 | USP, irradiated |
| Safety glasses | Lab preference | ||
| Scrubs (top and bottom) | Lab preference | ||
| Spor-Klenx RTU | Steris | 6525M2 | |
| Sterile 70% isopropyl alcohol (IPA) | Decon CiDehol | 8316 | |
| Sterile alcohol wipe | Lab preference | ||
| Sterile boot covers | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile coveralls | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile face mask | Lab preference | ||
| Sterile gloves | Lab preference | ||
| Sterile hood | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile low-lint wipes | Texwipe | TX3210 | |
| Sterile mop cleaning pads | Contec | MEQT0002SZ | |
| Sterile sleeve covers | Kimberly Clark | 36077 | |
| Sterile spreading rod | Fisher Scientific | 14665231 | |
| Sterile syringe | Lab preference | ||
| Tacky mats | Lab preference | ||
| Tryptic Soy Agar (TSA) | Hardy Diagnostics | W570R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Agar with Lecithinase and Tween (TSALT) | Hardy Diagnostics | P520R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Hardy Diagnostics | U46 | USP |
| Tubing | Lab preference | ||
| Vesphene III | Steris | 1S15CX | |
| Viable air sampler | Hardy Diagnostics | BAS22K | |
| Vortex | Lab preference |
References
- Cundell, T., Atkins, J. W., Lau, A. F. Sterility testing for hematopoietic stem cells. Journal of Clinical Microbiology. , 10.1128/jcm.01654-22 (2023).
- United States Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing - Current Good Manufacturing Practice. United States Food and Drug Administration. , (2004).
- United States Pharmacopeia - National Formulary.
- England, M. R., Stock, F., Gebo, J. E. T., Frank, K. M., Lau, A. F. Comprehensive evaluation of compendial USP<71>, BacT/Alert Dual-T, and Bactec FX for detection of product sterility testing contaminants. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01548 (2019).
- Gebo, J. E. T., East, A. D., Lau, A. F. A side-by-side comparison of clinical versus current good manufacturing practices (cGMP) microbiology laboratory requirements for sterility testing of cellular and gene therapy products. Clinical Microbiology Newsletter. 43 (21), 181-191 (2021).
- Gebo, J. E. T., Lau, A. F. Sterility testing for cellular therapies: What is the role of the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 58 (7), 01492 (2020).
- International Organization for Standardization. ISO 14644-1:2015 Cleanrooms and associated controlled environments - Part 1: Classification of air cleanliness by particle concentration. International Organization for Standardization. , (2015).
- Parenteral Drug Association. PDA Technical Report No. 13 Revised 2022 (TR 13) Fundamentals of an Environmental Monitoring Program. Parenteral Drug Association, Inc. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1116> Microbiological Evaluation of Cleanrooms and Other Controlled Environments in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- Guinet, R., et al. Multicenter study on incubation conditions for environmental monitoring and aseptic process simulation. PDA journal of pharmaceutical science and technology. 71 (1), 43-49 (2017).
- Gordon, O., Berchtold, M., Staerk, A., Roesti, D. Comparison of different incubation conditions for microbiological environmental monitoring. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 68 (5), 394-406 (2014).
- Anders, H. J., et al. Multisite qualification of an automated incubator and colony counter for environmental and bioburden applications in pharmaceutical microbiology. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary.
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1071> Rapid Microbial Tests for Release of Sterile Short-Life Products: A Risk-Based Approach in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. PUSP<1223> Validation of Alternative Microbiological Methods in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- Parenteral Drug Association. PDA Technical Report No. 33, Revised 2013 (TR 33) Evaluation, Validation and Implementation of Alternative and Rapid Microbiological Methods. Parenteral Drug Association, Inc. , (2013).
- Putnam, N. E., Lau, A. F. Comprehensive study identifies a sensitive, low-risk, closed-system model for detection of fungal contaminants in cell and gene therapy products. Journal of Clinical Microbiology. 59 (11), 0135721 (2021).
- Pharmaceutical Inspection Convention & Pharmaceutical Inspection Co-operation. Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes (PE 009-16 (Annexes)). Pharmaceutical Inspection Convention & Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<825> Radiopharmaceuticals - Preparation, Compounding, Dispensing, and Repackaging in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
