Summary
وصفنا طريقة لجمع الهيموليمف القابل للقياس الكمي بكفاءة من المفصليات الصغيرة للتحليل اللاحق.
Abstract
من المعروف أن مفصليات الأرجل تنقل مجموعة متنوعة من الفيروسات ذات الأهمية الطبية والزراعية من خلال الدملمف الدموي ، وهو أمر ضروري لانتقال الفيروس. جمع الهيموليمف هو التكنولوجيا الأساسية لدراسة تفاعلات ناقلات الفيروسات. هنا ، نصف طريقة جديدة وبسيطة للجمع الكمي للهيموليمف من المفصليات الصغيرة باستخدام Laodelphax striatellus (نطاط النبات البني الصغير ، SBPH) كنموذج بحثي ، حيث أن هذه المفصليات هي الناقل الرئيسي لفيروس شريط الأرز (RSV). في هذا البروتوكول ، تبدأ العملية بالضغط بلطف على ساق واحدة من المفصليات المجمدة بملاقط ذات رؤوس دقيقة والضغط على الدملمف خارج الجرح. بعد ذلك ، يتم استخدام ماصة صغيرة بسيطة تتكون من لمبة شعرية وماصة لجمع الدملمف المتعدي من الجرح وفقا لمبدأ القوى الشعرية. أخيرا ، يمكن إذابة الدملمف الذي تم جمعه في مخزن مؤقت محدد لمزيد من الدراسة. هذه الطريقة الجديدة لجمع الهيموليمف من المفصليات الصغيرة هي أداة مفيدة وفعالة لمزيد من البحوث حول الفيروسات المنقولة بالمفصليات والتفاعلات بين الفيروسات والفيروسات الناقلة.
Introduction
يمكن أن تنتقل كل من الفيروسات الحيوانية والنباتية عن طريق المفصليات ، وتشكل هذه الفيروسات تهديدا خطيرا لصحة الإنسان وتسبب خسائر اقتصادية هائلة في الزراعة1،2،3. الأهم من ذلك ، أن اللمف المفصلي ، الذي يعمل كجهاز الدورة الدموية وعنصر حيوي في الجهاز المناعي في المفصليات ، يلعب دورا مهما في تنظيم انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات. يتم نقل الفيروسات المكتسبة من خلال أمعاء المفصليات إلى الأنسجة الأخرى فقط بعد الهروب بنجاح من البيئة الليمفاوية الضارة4،5،6،7. تتضمن دورة حياة الفيروسات في الهيموليمف المفصلي بقاء الفيروس في بلازما السائل ، والدخول إلى الخلية الدموية ، والانتقال إلى الأنسجة الأخرى ، وتحدث آليات تفاعل مختلفة للفيروس الناقل في الدملمف8،9،10،11،12. على سبيل المثال ، يعتمد الانتقال الرأسي ل RSV بواسطة SBPH على التفاعل الجزيئي بين بروتين SBPH vitellogenin وبروتين قفيصة RSV (فيروس شريط الأرز)13,14. قد تفلت بعض الفيروسات من الاستجابة المناعية للهيموليمف عن طريق ربط عوامل ناقلات محددة15،16،17،18. لذلك ، فإن التحقيق في تفاعلات الفيروس الناقل في الدملمف في المفصليات مهم لتطوير فهم أفضل لانتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات.
يصعب جمع الهيموليمف لبعض الحشرات الصغيرة ، مثل نطاطات النباتات ، نطاطات الأوراق ، وبعض البعوض ، بسبب حجمها. لمعالجة هذه المشكلة ، تم تطوير عدة طرق لجمع الدملمف ، بما في ذلك إدخال إبرة حقنة مباشرة في جسم الحشرة لاستخراج حجم صغير من الدملمف ، وجمع الإفرازات من موقع الجرح بملاقط ذات رؤوس دقيقة ، والطرد المركزي المباشر. وقد مكنت هذه الطرق من قياس مستويات التعبير الجيني النسبية والتتر الفيروسي داخل الدملمف19،20،21. ومع ذلك ، فإن طريقة فعالة لتحديد حجم الهيموليمف ، وهو أمر ضروري لحساب خلايا الدم ، وتحديد كمية البروتين ، وتحليل نشاط الإنزيم ، غير متوفرة حاليا لهذه الحشرات الصغيرة.
SBPH (نطاط النبات البني الصغير) هو نوع من ناقلات الحشرات الصغيرة التي يبلغ طول جسمها حوالي 2-4 ملم. SBPH قادر على نقل مجموعة متنوعة من الفيروسات النباتية ، بما في ذلك RSV ، وفيروس قزم الذرة الخام ، وفيروس قزم الأرز الأسودالمخطط 22،23،24. تمت دراسة التفاعل بين SBPH و RSV بعمق على مدار العقد الماضي. لتسهيل العمل مع SBPHs ، قمنا بتطوير طريقة جديدة وبسيطة لجمع الدملمف. تستخدم هذه الطريقة ، التي تعتمد على مبدأ القوى الشعرية ، شعيرات دموية ذات علامة مقياس للحصول على دملمف الحشرة بطريقة دقيقة وقابلة للقياس الكمي. هذا يسمح لنا بجمع حجم معين من الهيموليمف من الحشرات الصغيرة بكفاءة ودراسة بيئة الدملمف للنواقل الصغيرة بمزيد من التفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تربية الحشرات
- رفع SBPHs المستخدمة في هذه التجربة في شتلات الأرز (Oryza sativa cv. Nipponbare). ازرع 20 شتلة أرز في حاضنة (65 مم × 200 مم) ، وتنمو عند 25 درجة مئوية تحت فترة ضوئية فاتحة / 8 ساعات مظلمة.
2. تشريح SBPHs لجمع الدملمف
- ضع SBPHs في أنبوب طرد مركزي ، وضعها في حمام جليدي لمدة 10-30 دقيقة.
ملاحظة: لا تضع SBPHs في حمام الجليد لمدة تقل عن 10 دقائق ، وإلا فقد تنتعش الحشرات. - ضع SBPH مجمدا على شريحة زجاجية (انظر جدول المواد) تحت مجهر مجسم (انظر جدول المواد) مع توجيه بطنه لأعلى. ضبط التركيز على الأرجل الستة للحشرة.
- قم بإعداد ملقطين عاليتي الدقة (انظر جدول المواد) بأطراف فائقة الدقة. استخدم ملقط واحد للضغط لأسفل على جسم الحشرة لإبقائها في مكانها ، واستخدم الملقط الآخر لسحب إحدى الساقين بعناية من الحشرة.
ملاحظة: بالنسبة للحشرات ذات القشرة الصلبة ، يمكن استخدام مشرط العيون لقطع إحدى الساقين. - اضغط برفق على صدر الحشرة بملقط لجعل الدملمف يتدفق عبر الجرح.
ملاحظة: يظهر الهيموليمف على شكل قطرات شفافة دون أي زخارف بيضاء مرئية. تخلص من الدهون إذا كان هناك أي فلوكول أبيض ، والذي يمثل تلوث الجسم الدهني.
3. جمع الهيموليمف باستخدام micropipettes
- تحضير ماصة صغيرة. ضع أنبوبا شعريا (انظر جدول المواد) بحجم 1 ميكرولتر في لمبة الماصة (انظر جدول المواد). للحصول على قياسات دقيقة ، تأكد من أن خط الميزان مرئي.
ملاحظة: من الضروري وجود ثقب صغير في الجزء العلوي من لمبة الماصة. - عند جمع الدملمف ، أمسك لمبة ماصة الماصة ، وضع الأنبوب الشعري بالقرب من جرح الحشرة. جمع الدملمف ينضح من الجرح ببساطة عن طريق لمس طرف الشعيرات الدموية إلى الدملمف.
- قم بسد الفتحة الصغيرة الموجودة أعلى لمبة الماصة قليلا بالإصبع لإيقاف عملية الامتصاص عندما يصل السائل الموجود داخل الأنبوب الشعري إلى خط المقياس المطلوب.
ملاحظة: اجمع عينة واحدة من 1 ميكرولتر من الهيموليمف باستمرار وبسرعة لتجنب تلوث الدهون وانسداد الأنبوب. - اضغط على لمبة الماصة لتفريغ الهيموليمف المجمع إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS (137 مليمول / لتر NaCI ، 2.7 مليمول / لتر KCI ، 4.3 مليمول / لتر Na 2 HPO 4 ، 1.4 مليمول / لتر KH 2 PO 4 ، درجة الحموضة 7.2-7.4).
ملاحظة: يتم إدخال الأنبوب الشعري في المخزن المؤقت PBS. - التغيير إلى أنبوب شعري جديد عند جمع عينة أخرى 1 ميكرولتر من الدملمف.
4. تلطيخ كوماسي الأزرق
- اجمع 3 عينات من الدملمف بنفس الحجم (1 ميكرولتر) من يرقات المرحلة الثالثة وفقا للبروتوكولات الموضحة في الخطوة 3 ، وقم بتفريغ الدملمف الذي تم جمعه في المخزن المؤقت PBS لعمل حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر.
- أضف 25 ميكرولتر من مخزن تحميل البروتين 5x (250 مليمول / لتر Tris-HCI [درجة الحموضة 6.8] ، 10٪ W / V SDS ، 0.05٪ W / V Bromophenol Blue ، 50٪ W / V glycerol ، 5٪ W / V β-mercaptoethanol) إلى 100 ميكرولتر من عينات الدملمف المخفف ، والحرارة لتشويه البروتينات.
- قم بتحميل 20 ميكرولتر من العينات المغلية على جل بروتين SDS-PAGE بنسبة 10٪ (انظر جدول المواد) لفصل البروتينات.
- قم بتلطيخ الجل في محلول Coomassie Blue (امزج 1 جم من Coomassie Brilliant Blue R-250 مع 250 مل من الأيزوبروبانول ، و 100 مل من حمض الخليك الجليدي ، و 650 مل من ddH2O ، وقم بتصفية أي جزيئات باستخدام ورق الترشيح) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة لون الجل لمدة 1 ساعة بمحلول إزالة اللون (100 مل من حمض الخليك ، 400 مل من الميثانول ، 500 مل من ddH2O).
5. تحديد تركيز البروتين
- قم بتخفيف 10 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 5 مجم / مل ، 2.5 مجم / مل ، 1.25 مجم / مل ، 0.625 مجم / مل ، و 0.3125 مجم / مل باستخدام محلول PBS باستخدام طريقة التخفيف ذات الشقين.
- نضح 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS وكل تركيز من محاليل BSA في الخطوة 5.1 ، أضف 1 مل من كاشف صبغة برادفورد واحد (انظر جدول المواد) ، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم المخزن المؤقت PBS في كاشف صبغة برادفورد كعنصر تحكم ، والصفر عند OD = 595 نانومتر. قم بقياس قيم الامتصاص لكل من تركيزات البروتين المتبقية ، وقم بعمل منحنى قياسي.
- أضف 1 ميكرولتر من الهيموليمف من اليرقات أو الإناث أو الذكور SBPHs إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS ، ثم طرد العينات عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا الدموية.
- نضح 90 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد ، وقياس قيم امتصاص المادة الطافية وفقا للتعليمات الواردة في الخطوة 5.2.
- حساب تركيزات البروتين لعينات الدملمف وفقا لمعادلة الانحدار للمنحنى القياسي. قم بتضمين ثلاث نسخ بيولوجية مع ثلاث مكررات تقنية في التجارب.
6. الاكتشافات المجهرية
- استخدم الماصات الدقيقة لجمع الهيموليمف من 10-15 SBPHs في مراحل النمو المختلفة. أضف الدملمف الذي تم جمعه إلى أنبوب يحتوي على 20 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد 4٪ (انظر جدول المواد). احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لإصلاح الدملمف.
- ماصة 20 ميكرولتر من الخلايا الدموية الثابتة على مركز شريحة مغلفة بالسيلان (انظر جدول المواد).
- جفف القطرة في رف تجفيف منزلق.
ملاحظة: تجنب التجفيف المفرط. - قم بتغطية العينة بكاشف الذهب المضاد للتلاشي 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (انظر جدول المواد) ، وافحص الشريحة تحت المجهر المقلوب (انظر جدول المواد).
7. قياس كمية الخلية
- جمع 1 ميكرولتر من الهيموليمف من SBPHs مع micropipette ، وحلها في 20 ميكرولتر من العازلة PBS.
- تمييع عينات الدملمف خمسة أضعاف مع العازلة PBS.
- ماصة 20 ميكرولتر من محلول الدملمف في وسط غرفة عد الخلايا (انظر جدول المواد). قم بتغطية القطرة بغطاء (انظر جدول المواد).
- عد الخلايا في المربعات الخمسة في غرفة عد الخلايا (الشكل التكميلي 1) ، تحت مجهر مقلوب (انظر جدول المواد). قم بتضمين ثلاث نسخ بيولوجية مع ثلاث مكررات تقنية في كل تجربة.
الخلايا / ميكرولتر = العدد الإجمالي لخمسة مربعات متوسطة × 5 عامل تخفيف × × 104
8. التحليلات الإحصائية
- إجراء تحليلات إحصائية باستخدام البرنامج المقابل (انظر جدول المواد). قم بإنشاء ملف جديد ، وحدد العمود ، واستورد البيانات ، وقم بإنشاء مخطط مبعثر باستخدام شريط.
- احسب المتوسط و SD لكل مجموعة من البيانات باستخدام إحصائيات العمود ، واستخدم أداة ANOVA أحادية الاتجاه لتقييم أهمية الاختلافات بين المجموعات. أوجد المتوسط و SD من ثلاث مكررات بيولوجية بثلاث تجارب مستقلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نموذج Micropipette وجمع الهيموليمف
لقد طورنا ماصة صغيرة بسيطة يعتمد عملها على القوى الشعرية للأنبوب الشعري. تتكون الماصة الدقيقة من أنبوب شعري ومصباح ماصة (الشكل 1 أ). تتوفر الأنابيب الشعرية بأحجام مختلفة تتراوح من 1 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر ، ويتم اختيار أحجام الأنبوب الشعري وفقا للمتطلبات. لا يقترح استخدام الأنابيب الشعرية ذات الأحجام الأصغر لأن الفتحات الدقيقة الإضافية للأنابيب ذات الحجم الأصغر يمكن أن تجعل من الصعب امتصاص السائل مثل الدملمف. تحتوي لمبة الماصة على فتحة في الأعلى لا يمكن توصيلها أثناء جمع الدملمف. لمبة الماصة هذه ملائمة لحمل الماصة الدقيقة أثناء جمع السائل (الشكل 1 ب) وتساعد أيضا في نقل السائل الذي تم جمعه من الأنبوب الشعري إلى مخزن التجميع.
من أجل جمع الدملمف بسهولة ، في هذا العمل ، تم تجميد SBPHs أولا في الثلج أو في الثلاجة. ثم تم تحديد موقع SBPHs المجمدة هذه على شريحة تحت مجهر مجسم ، وتم سحب أحد أرجل كل SBPH بملاقط ذات رؤوس دقيقة (الشكل 1C). لضمان جرح كبير وجمع دملمف مثالي ، من الأفضل سحب الساق من الجذر (الشكل 1 كا ، ب). من أجل تقليل مخاطر التلوث من قبل الجسم الدهني ، تم جمع قطرات سائلة صافية فقط دون أي فلوكول أبيض (الشكل 1Cc). تم استخدام الماصة الدقيقة لامتصاص الأحجام المطلوبة من الدملمف (الشكل 1Cd). لجمع 1 ميكرولتر من الدملمف ، كان لا بد من تشريح ما يقرب من 30-40 من SBPHs اليرقية أو 8-15 SPBHs البالغة.
تحليل الهيموليمف الذي تم جمعه
لتقييم دقة الماصة الدقيقة كطريقة لتقييم حجم الدملمف الذي تم جمعه ، اختبرنا تركيزات البروتين لعينات مختلفة. تم جمع الهيموليمف من اليرقات باستخدام ماصة صغيرة بحجم شعري يبلغ 1 ميكرولتر ، وتم جمع ثلاث عينات من البروتين بشكل منفصل واختبارها عن طريق تشغيل هلام SDS-PAGE. أظهرت النتائج أن كمية البروتين في الممرات الثلاثة كانت متساوية تقريبا (الشكل 2 أ). وبالنسبة لليرقات، كان المحتوى الكلي للبروتين 3.707 ملغم/مل ± 1.382 ملغم/مل. جمعنا أيضا نفس الحجم من الهيموليمف من الإناث والذكور البالغين SBPHs ، وأظهرت تركيزات البروتين 3.515 مجم / مل ± 1.400 مجم / مل و 3.621 مجم / مل ± 0.860 مجم / مل ، على التوالي (الجدول 1). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في البروتين بين العينات الثلاث (الشكل 2 ب).
بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أيضا الخلايا الدموية داخل الهيموليمف اليرقية التي تم جمعها لتقييم جودة ونقاء عينات الدموليمف. تراوح حجم الخلايا الدموية بين 2-20 نانومتر ، ولم يتم اكتشاف أي جسم دهني (الشكل 2 ج). كانت غالبية الخلايا التي تم تحديدها عبارة عن خلايا بلازمية ، يتراوح قطرها من 5-15 نانومتر وغالبا ما تظهر في مجاميع25. ثم قمنا بحساب تركيزات الخلايا من الهيموليمف من اليرقات والإناث البالغات والذكور البالغين ، وكانت تركيزات الخلايا المحددة 1.794 × 10 5 / ميكرولتر ± 0.614 × 10 5 / ميكرولتر ، 1.256 × 10 5 / ميكرولتر ± 0.603 × 10 5 / ميكرولتر ، و 1.553 × 10 5 / ميكرولتر ± 0.474 × 10 5 / ميكرولتر ، على التوالي (الجدول 2). لم يظهر عدد خلايا الدم في اليرقات والإناث البالغات والذكور البالغين أي فروق ذات دلالة إحصائية (الشكل 2 د). تشير هذه النتائج إلى أن طريقة جمع الماصة الدقيقة هي طريقة موثوقة ودقيقة لجمع الهيموليمف من SBPHs.
الشكل 1: رسم تخطيطي لنموذج الماصة الدقيقة ومجموعة الدموليمف. أ: تكوين الماصة الدقيقة. تتكون الماصة الدقيقة من لمبة شعرية وماصة. تتراوح أحجام الشعيرات الدموية من 1-20 ميكرولتر. لمبة ماصة لديها ثقب صغير في الأعلى والأسفل. يتم إدخال الشعيرات الدموية في الفتحة السفلية ، والمقياس مرئي. (ب) مخطط عام لجمع الدملمف باستخدام ماصة مجهرية. يتم الاحتفاظ بطن الحشرة متجها لأعلى أثناء فصل الساق ، ويتم تحفيز تدفق الدملمف ، ويتم جمع الدملمف في الماصة تحت المجهر المجسم. ج: عملية جمع الدملمف باستخدام ماصة مجهرية. يتم سحب إحدى الساقين من الجذر باستخدام ملاقط ذات رؤوس دقيقة (أ) ، ويتم ضغط جسم الحشرة لجعل الدم الليمفاوي يتدفق (ب ، ج). يتم جمع الدملمف من الجرح في الشعيرات الدموية (د). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل اللمفم الدموي SBPH . (أ) تلطيخ أزرق كوماسي يظهر ثلاث نسخ مكررة من اللمف الدموي لليرقات. هدح يشير إلى الدملمف. ب: تركيزات البروتين الكلية للدملمف في اليرقات والإناث والذكور. (ج) صور مجهرية توضح الخلايا الموجودة في الدموليمف في SBPHs عند تكبير 20x و60x على الترتيب. كانت النواة ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (د) كثافة الخلايا الدموية لليرقات والإناث والذكور SBPHs. تم حساب المتوسط و SD من ثلاث تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الهيموليمف | تركيز البروتين (ملغم / مل) |
| اليرقه | 3.707±1.382 |
| أنثى | 3.515±1.400 |
| ذكر | 3.621±0.860 |
الجدول 1: تركيزات البروتين من الهيموليمف من مختلف SBPHs. تم الحصول على البيانات من ثلاث نسخ بيولوجية.
| الهيموليمف | تركيز الخلية (105 / ميكرولتر) |
| اليرقه | 1.794±0.614 |
| أنثى | 1.256±0.603 |
| ذكر | 1.553±0.474 |
الجدول 2: التركيزات الكلية للخلايا الدموية في الدملمف من مختلف SBPHs. تم الحصول على البيانات من ثلاث نسخ بيولوجية.
الشكل التكميلي 1: تحديد عدد الخلايا. يتم حساب مربعات الزاوية الأربعة (1 و 2 و 3 و 4) والمربع المركزي (5) في غرفة عد الخلايا. بالنسبة للخلايا الحدودية ، يتم حساب الحدين فقط (أعلى ويسار). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهيموليمف هو وسط الجهاز الدوري في المفصليات ، ولا يمكن للفيروسات المنقولة بالمفصليات أن تغزو أنسجة المفصليات الأخرى إلا إذا كانت قادرة على البقاء على قيد الحياة في بيئة الهيموليمف المعادية. يعد جمع عينة عالية الجودة من الدملمف الخطوة الأولى في دراسة تفاعلات الفيروس الناقل التي تحدث في الدملمف. تم الإبلاغ عن أنه يمكن الحصول على دملمف الحشرات من عدة مواقع على جسم الحشرة ، بما في ذلك جرح في الساق الأمامية ، أو شق بسيط في منطقة الرأس ، أو جرح مسيل للدموع في البطن26،27،28،29. قد تعمل طرق التجميع المختلفة لبعض عمليات الاستحواذ. الطريقة التي تنطوي على إنشاء شق صغير في مفصل الرأس والرقبة هي أكثر ملاءمة لجمع الدملمف من الحشرات الكبيرة مثل نحل العسل26. يعد إنشاء جرح في منطقة الرأس من SBPH أمرا صعبا لأنه قد يتلف الأعضاء الأخرى ويؤدي إلى تلوث الأنسجة الأخرى. بعد إجراء جرح مسيل للدموع في البطن ، يتم غمر الحشرات في المخزن المؤقت ، ثم يتم طرد المخزن المؤقت لاستخراج الدملمف. هذه طريقة ملائمة لجمع الدهون من الحشرات الصغيرة21. ومع ذلك ، نظرا لوجود كمية عالية من الجسم الدهني داخل الهيموكول من SBPHs ، فإن الجرح في جزء الجسم قد يتسبب في تسرب الجسم الدهني من الجرح ويؤدي إلى تلوث الدملمف. هذه الطريقة أكثر ملاءمة لجمع الهيموليمف من SBPHs البالغة ، والتي لديها جسم دهني أقل من اليرقات. لمنع تلوث الجسم بالدهون بشكل فعال ، يوصى بعمل جرح في موقع الساق بدلا من الجسم مباشرة. في الدراسات السابقة ل SBPH hemolymph ، تم استخدام ملاقط ذات رؤوس دقيقة لتسهيل جمع قطرات صغيرة من السائل من الجرح13. على الرغم من أن الدملمف الذي تم جمعه كان واضحا من الشوائب ، إلا أن حجم الدملمف لم يقاس. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير ماصة دقيقة بسيطة يمكن استخدامها لجمع الهيموليمف بدقة وكمية من ناقلات الحشرات الصغيرة جدا.
لنجاح جمع الهيموليمف ، يجب مراعاة العديد من الخطوات الحاسمة. أولا ، من الضروري تخدير الحشرات عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة من أجل إنتاج دملمف خال من الجسم الدهني. ثانيا ، من الأسهل الحصول على الدملمف النقي عن طريق سحب الساق الأولى. ثالثا ، يجب أن يتم جمع الدملمف بطريقة مستمرة وسريعة ، وإلا فإن الدملمف قد يتخثر في القاع ويمنع الشعيرات الدموية.
تم استخدام تقنية جمع الشعيرات الدموية على نطاق واسع لجمع دم الحيوانات30,31. قمنا بتعديل التقنية لتناسب الخصائص المميزة لدملمف الحشرات. نظرا لأن SBPHs تمتلك حجم جسم صغير ، فقد تم اختيار شعيرات دموية بحجم لا يقل عن 1 ميكرولتر. لا ينصح باستخدام الشعيرات الدموية مع حجم أقل من 1 ميكرولتر. من الجدير بالذكر أن الدملمف يحتوي على كثافة عالية من البروتينات وعدد كبير من الخلايا (الشكل 2) ، مما يرفع كثافته السائلة ويجعل من الصعب امتصاص الدملمف عبر الشعيرات الدموية ذات الأحجام الأصغر.
طريقة جمع الدملمف عن طريق الشعيرات الدموية هي تقنية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطبيق تمكن من القياس الكمي الموثوق والدقيق للدملمف. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة المطورة حديثا لجمع السوائل النزرة الأخرى من النواقل الصغيرة ، مثل عسل النحل. من الضروري تسليط الضوء على أن الحشرات تبقى على قيد الحياة بعد استخراج الدملمف باستخدام هذه الطريقة. هذا مفيد للدراسات التي تنطوي على أعضاء الحشرات الأخرى أو لجمع الدملمف المتكرر. يقدم هذا العمل تقنية قيمة لدراسة علم الحشرات والتفاعلات بين ناقلات الفيروسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2022YFD1401700) ومن قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (رقم 32090013 ورقم 32072385).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L.
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
