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Genetics

Trasferimenti giornalieri, archiviazione delle popolazioni e misurazione dell'idoneità nell'esperimento di evoluzione a lungo termine con Escherichia coli

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65342
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,4, 1, 1, 2,3, 2,5
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2BEACON Center for the Study of Evolution in Action, Michigan State University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 4Department of Integrative Biology, Michigan State University, 5Biological Sciences Program, Michigan State University

Summary

Questo protocollo descrive come mantenere l'esperimento di evoluzione a lungo termine (LTEE) di Escherichia coli eseguendo i suoi trasferimenti giornalieri e congelamenti periodici e come condurre test di competizione per misurare i miglioramenti della forma fisica nei batteri evoluti. Queste procedure possono servire come modello per i ricercatori che iniziano i propri esperimenti di evoluzione microbica.

Abstract

Il Long-Term Evolution Experiment (LTEE) ha seguito dodici popolazioni di Escherichia coli mentre si adattavano a un semplice ambiente di laboratorio per oltre 35 anni e 77.000 generazioni batteriche. La configurazione e le procedure utilizzate nell'LTEE incarnano metodi affidabili e riproducibili per studiare l'evoluzione microbica. In questo protocollo, descriviamo innanzitutto come le popolazioni LTEE vengono trasferite su terreni freschi e coltivate ogni giorno. Quindi, descriviamo come le popolazioni LTEE vengono regolarmente controllate per possibili segni di contaminazione e archiviate per fornire una "documentazione fossile" congelata permanente per studi successivi. Le molteplici misure di sicurezza incluse in queste procedure sono progettate per prevenire la contaminazione, rilevare vari problemi quando si verificano e recuperare dalle interruzioni senza rallentare sensibilmente l'avanzamento dell'esperimento. Un modo in cui il ritmo generale e il carattere dei cambiamenti evolutivi sono monitorati nell'LTEE è misurando l'idoneità competitiva delle popolazioni e dei ceppi dell'esperimento. Descriviamo come vengono condotti i test della competizione di co-coltura e forniamo sia un foglio di calcolo che un pacchetto R (fitnessR) per calcolare l'idoneità relativa dai risultati. Nel corso dell'LTEE, i comportamenti di alcune popolazioni sono cambiati in modi interessanti e nuove tecnologie come il sequenziamento dell'intero genoma hanno fornito ulteriori strade per indagare su come le popolazioni si sono evolute. Concludiamo discutendo di come le procedure LTEE originali sono state aggiornate per accogliere o trarre vantaggio da queste modifiche. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che utilizzano l'LTEE come sistema modello per studiare le connessioni tra evoluzione e genetica, biologia molecolare, biologia dei sistemi ed ecologia. Più in generale, l'LTEE fornisce un modello collaudato per coloro che stanno iniziando i propri esperimenti di evoluzione con nuovi microbi, ambienti e domande.

Introduction

Nel febbraio del 1988, Richard Lenski inoculò dodici fiaschi contenenti un mezzo di crescita limitato dal glucosio definito con colture clonali di Escherichia coli presso l'Università della California, Irvine1. Il giorno seguente, ha trasferito l'1% della coltura da ciascun pallone a una serie di nuovi palloni contenenti terreno di coltura fresco. Questa diluizione 1:100 ha permesso alle popolazioni batteriche di espandersi di 100 volte prima di esaurire il glucosio disponibile, corrispondente a circa 62/3 generazioni di divisioni cellulari. Questa procedura è stata ripetuta il giorno seguente e da allora è stata ogni giorno, con alcune interruzioni. Questi trasferimenti giornalieri sono continuati, anche se l'esperimento è stato trasferito, prima alla Michigan State University nel 1992 e poi all'Università del Texas ad Austin nel 2022. Nel frattempo, nuove mutazioni hanno continuamente generato variazioni genetiche in queste popolazioni di E. coli e la selezione naturale ha portato a cellule evolute che superano i loro antenati.

Lenski ha progettato questo esperimento, ora noto come Long-Term Evolution Experiment (LTEE), per studiare le dinamiche e la ripetibilità dell'evoluzione. Per rispondere a queste domande, ha incluso diverse caratteristiche importanti nella progettazione del setup sperimentale e dei suoi protocolli2. Una di queste caratteristiche era l'attenta scelta di un organismo modello. Le dodici popolazioni originarie erano tutte originarie di singole colonie che condividevano un antenato comune immediato, Escherichia coli B ceppo REL606. Questo ceppo è stato scelto perché era già stato comunemente usato in laboratorio, riprodotto completamente asessualmente e non conteneva plasmidi o profagi intatti 3,4 - il che rende più facile lo studio della sua evoluzione. Un'altra scelta che ha semplificato l'esperimento è stata quella di utilizzare una concentrazione molto bassa di glucosio nel mezzo di crescita per limitare la densità delle cellule in ogni pallone dopo la crescita. L'uso di una bassa densità cellulare aveva lo scopo di rendere più facile analizzare i cambiamenti nell'idoneità della popolazione riducendo il potenziale di evoluzione delle interazioni ecologiche all'interno delle popolazioni (ad esempio, mediante alimentazione incrociata)5.

REL606 non è in grado di utilizzare ʟ-arabinosio come fonte di carbonio ed energia (Ara−) a causa di una mutazione puntiforme nel gene araA . Prima di iniziare l'LTEE, un mutante spontaneo con una sequenza araA ripristinata, designato REL607, è stato isolato da REL6066. REL607 è in grado di crescere su ʟ-arabinosio (Ara+). REL606 è stato utilizzato per avviare sei delle popolazioni LTEE e REL607 è stato utilizzato per avviare le altre sei. L'arabinosio non è presente nel mezzo di crescita utilizzato durante l'LTEE, quindi REL607 si comporta allo stesso modo di REL606 in queste condizioni. Tuttavia, quando placcate su agar tetrazolium arabinosio (TA), le cellule Ara− e Ara+ formano rispettivamente colonie rosse e bianche. Questo metodo per discriminare tra i due ceppi ancestrali di E. coli e i loro discendenti è molto utile. Può essere utilizzato per rilevare la contaminazione incrociata tra popolazioni LTEE. Aiuta anche a misurare l'idoneità di un ceppo o di una popolazione Ara− rispetto a un Ara+ quando sono in competizione l'uno contro l'altro. L'idoneità viene misurata impostando una co-coltura di concorrenti marcati in modo opposto e quindi monitorando come le frequenze delle colonie rosse e bianche (ottenute diffondendo diluizioni della coltura su piastre TA) cambiano tra quando i concorrenti sono inizialmente miscelati e dopo uno o più cicli di crescita nelle stesse condizioni dell'LTEE. La rappresentazione del tipo di cellula più in forma aumenterà durante ogni ciclo di crescita.

Un'altra caratteristica critica dell'LTEE è che i campioni delle popolazioni in evoluzione vengono periodicamente archiviati. Se miscelato con un crioprotettore come il glicerolo, le cellule di E. coli possono essere congelate e successivamente rianimate7. Come parte del protocollo LTEE, ogni 75 ° giorno (che equivale a circa 500 generazioni), una parte di ogni popolazione che non è stata trasferita in un nuovo pallone viene mescolata con glicerolo, divisa tra più fiale e conservata in un congelatore. Questo "record fossile" congelato ha permesso ai ricercatori di eseguire i primi studi sull'LTEE, in cui hanno rianimato le popolazioni evolute di E. coli da vari punti temporali e le hanno contestate rispetto ai ceppi ancestrali per monitorare quanto rapidamente la forma fisica stava aumentando1. L'evoluzione della forma fisica è stata rimisurata periodicamente man mano che sono stati conservati più "strati" dei "reperti fossili" congelati. La conclusione generale di queste misurazioni è che la forma fisica continua a migliorare nell'LTEE fino ad oggi, anche dopo così tante generazioni di evoluzione nello stesso ambiente 8,9,10.

Cosa ha permesso all'LTEE di continuare così a lungo? Molte delle stesse caratteristiche che hanno permesso di porre e rispondere alle sue domande originali sono servite anche come misure di sicurezza e fail-safe contro inevitabili interruzioni dovute a sfortuna, errore umano ed eventi mondiali. Ogni giorno, quando le colture vengono trasferite su un nuovo terreno di crescita, il ricercatore che esegue i trasferimenti alterna tra popolazioni Ara− e Ara+ . Quindi, quando le popolazioni sono congelate, possono essere placcate su agar selettivo e indicatore per verificare se eventuali popolazioni "vicine" sono state accidentalmente contaminate o mescolate (ad esempio, le colonie bianche sono in una popolazione che dovrebbe formare solo colonie rosse) o contaminate da microbi estranei (ad esempio, morfologie di colonie inaspettate o densità cellulari). Nel caso in cui una popolazione sia stata compromessa, il suo progenitore può essere rianimato dal congelatore e portato avanti al suo posto. I marcatori Ara e l'archivio congelato hanno quindi un duplice scopo, sia come risorse sperimentali che come misure di sicurezza.

Poiché la sua storia è così ben conservata e facilmente accessibile, i campioni LTEE sono stati studiati utilizzando tecnologie che non esistevano quando l'esperimento è iniziato. Ad esempio, il sequenziamento dell'intero genoma è stato utilizzato per esaminare la dinamica delle mutazioni nelle popolazioni LTEE 11,12,13,14,15, e la trascrittomica e la profilazione ribosomiale sono state utilizzate per esaminare i cambiamenti nell'espressione genica 16,17. Strumenti genetici sono stati utilizzati per ricostruire ceppi che differiscono per singole mutazioni o combinazioni di diverse mutazioni evolute per comprendere i loro effetti sulla forma fisica e vari fenotipi 18,19,20,21. I campioni dei "reperti fossili" congelati vengono facilmente reintegrati in modo che parti o intere copie della storia dell'esperimento possano essere spedite ad altri laboratori. I campioni LTEE ora esistono in tutti i continenti tranne l'Antartide e sono stati studiati da ricercatori che sono più giovani dell'esperimento stesso. I metodi robusti dei campioni e dei ceppi di E. coli LTEE ed evoluti dalla sua documentazione storica sono serviti anche come punti di partenza per esperimenti di evoluzione che esaminano altre domande e ambienti 22,23,24,25,26,27,28,29.

Figure 1
Figura 1: Panoramica delle procedure LTEE. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Qui, dimostriamo tre protocolli di base utilizzati nell'esperimento di evoluzione a lungo termine di E. coli (Figura 1). Descriviamo: (1) come eseguire i trasferimenti giornalieri, (2) come archiviare campioni di popolazione e isolati clonali e (3) come eseguire e analizzare saggi di competizione di co-coltura per misurare le differenze di fitness. La nostra speranza è che questi protocolli promuovano l'uso continuato delle risorse LTEE e informino la progettazione di nuovi esperimenti di evoluzione microbica.

Protocol

1. Trasferimenti giornalieri delle popolazioni LTEE

NOTA: Le dodici popolazioni LTEE vengono trasferite giornalmente inoculando terreno fresco con l'1% delle colture dai fiaschi del giorno precedente. I passaggi di questo processo sono riepilogati nella Figura 1. Le sei popolazioni Ara− iniziate dal ceppo REL606 sono designate da A−1 ad A−6, e le sei popolazioni Ara+ iniziate dal ceppo REL607 sono designate da A+1 ad A+6. Il rigoroso rispetto della tecnica asettica e di un programma e ordine per il trasferimento delle popolazioni riduce al minimo il rischio di contaminazione e altre interruzioni.

  1. Disinfettare la superficie su cui verranno effettuati i trasferimenti LTEE pulendola con etanolo al 70% o una soluzione di candeggina al 10%. Accendi un bruciatore Bunsen per creare una corrente ascensionale locale e consentire la fiammatura della vetreria.
    NOTA: Indossare guanti da laboratorio per prevenire la contaminazione. Per la sicurezza intorno a una fiamma libera, è fondamentale utilizzare solo guanti fatti di un materiale come il nitrile che non è infiammabile.
  2. Preparare tredici boracchette Erlenmeyer in borosilicato da 50 mL ricoperte da bicchieri in borosilicato o polipropilene da 20 mL che sono stati lavati e sterilizzati in autoclave. Controllare i palloni per i detriti visibili e sostituire quelli che non sono perfettamente puliti.
  3. Etichettare sei palloni da A−1 a A−6 utilizzando un pennarello rosso e gli altri sei matraccio da A+1 a A+6 utilizzando un pennarello nero. Etichettare l'ultimo matraccio rimanente, che sarà vuoto, con la data in formato mese/giorno e il giorno della settimana.
  4. Riempire ciascuno dei 13 matraccio con 9,9 mL di terreno DM25 utilizzando una pipetta sierologica sterile da 10 ml. Infiammare la bocca di ciascun matraccio dopo aver rimosso il becher che funge da coperchio e prima di sostituire il becher. Fiammare la punta della pipetta tra un riempimento e l'altro di ciascun pallone.
    NOTA: Le istruzioni per la realizzazione di DM25 sono disponibili online30. Se si utilizza una pipetta sierologica di plastica, rinunciare a bruciare la punta o limitare il tempo nella fiamma per evitare di sciogliere la plastica.
  5. Rimuovere i palloni LTEE del giorno precedente dall'incubatore agitatore.
  6. Esaminare ogni pallone avvicinandolo alla luce per valutarne la torbidità e il colore, controllare l'integrità del pallone e cercare la presenza di corpi estranei.
    NOTA: Ad occhio nudo, tutte le culture Ara− e Ara+ appariranno leggermente torbide rispetto al bianco, ad eccezione di A−3, che sarà ~10 volte più torbido delle altre a causa della crescita del citrato nel mezzo. Molti contaminanti microbici esterni sono anche in grado di crescere sul citrato, quindi l'aumento della torbidità in popolazioni diverse da A-3 probabilmente indica contaminazione. Vedere la sezione Risultati rappresentativi per le immagini delle culture LTEE prima di un trasferimento.
  7. FACOLTATIVO: Verificare che ogni coltura LTEE abbia la torbidità prevista pipettando 1 mL del bianco e 1 mL di ciascuna coltura in cuvette di plastica da 1 cm e prendendo letture di densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando uno spettrofotometro dopo aver oscurato lo strumento.
    NOTA: Questo passaggio aggiuntivo può essere utile per i ricercatori che sono nuovi a lavorare con LTEE e non sono sicuri di giudicare la torbidità ad occhio, nonché per documentare e indagare su anomalie sospette. Prelevare campioni per misurare OD600 dai palloni del giorno precedente solo dopo aver completato i normali trasferimenti del giorno a nuovi palloni (le seguenti fasi) per ridurre al minimo il rischio di contaminazione delle popolazioni cellulari che continueranno a propagarsi se i valori di OD600 sono come previsto. Vedere la sezione Risultati rappresentativi per i valori OD600 tipici per le culture LTEE.
  8. Utilizzando un micropipettatore P200 con punta filtrante sterile, trasferire 100 μL di coltura da ciascun matraccio LTEE nel pallone corrispondente contenente DM25 fresco. Inizia con A-1, quindi trasferisci A+1. Successivamente, continua ad alternare tra le popolazioni − e +. Per tenere traccia delle colture trasferite, spostare i palloni a sinistra dopo il pipettaggio da o verso di esse.
    NOTA: Il rigoroso ordine dei trasferimenti e l'alternanza tra le popolazioni Ara− e Ara+ aiuta a prevenire e rilevare contaminazioni incrociate e confusioni. Osservare una rigorosa tecnica asettica: utilizzare una punta di pipetta fresca per ogni trasferimento, infiammare le bocche dei palloni immediatamente dopo aver aperto il tappo e prima di ricapitolare e pulire la canna e l'espulsore del micropipettor con una salvietta di carta priva di lanugine inumidita con etanolo al 70% tra ogni trasferimento. La candeggina non dovrebbe mai essere usata per disinfettare i micropipettatori, poiché anche tracce possono uccidere le colture.
  9. Incubare i palloni appena inoculati a 37 °C per 24 ± 1 ora con agitazione orbitale a 120 giri/min su un diametro di 1 pollice.
  10. Conservare le colture del giorno precedente a 4 °C. Conservare queste lingue di backup per due giorni. Scartare le colture più vecchie che sono state salvate a 4 °C tre giorni prima in questo momento.
    NOTA: Le colture dei due giorni precedenti forniscono due set completi di backup con cui riavviare l'esperimento, se necessario, in caso di problemi o incidenti, o se viene rilevata una contaminazione delle colture del giorno precedente prima del trasferimento (ad esempio, colorazione strana o particelle impreviste).
  11. Inserire l'ora, la data, il numero di trasferimento, il nome o le iniziali del ricercatore che ha effettuato i trasferimenti, se le colture erano a posto o meno e qualsiasi altra informazione pertinente nel quaderno del registro di trasferimento. Passare ai punti 1.12-1.14 se si verifica una delle seguenti situazioni: (1) il bianco del giorno precedente è contaminato, (2) un matraccio o il suo coperchio è rotto o rotto, (3) un matraccio contiene materiale estraneo, (4) un matraccio è rovesciato o lasciato cadere durante i trasferimenti, o (5) c'è qualsiasi altro evento o osservazione che renda discutibile il proseguimento da questi palloni.
  12. In caso di problemi, incidenti o sospetti di contaminazione con le colture LTEE del giorno precedente, non trasferirli da essi. Conservare invece l'intero set di dodici colture a 4 °C per un successivo esame e un'ulteriore caratterizzazione.
  13. Recuperare i palloni contenenti le colture di riserva trasferite dal giorno precedente e conservate a 4 °C. Posizionali sul piano del banco per riscaldarli a temperatura ambiente. Ruotare delicatamente ogni pallone per risospendere le cellule.
  14. Trasferire dai palloni di riserva alla nuova serie di palloni contenenti mezzo fresco e continuare l'esperimento normalmente come descritto nei punti 1.6-1.11. Annotare nel registro di trasferimento che sono state utilizzate le lingue di backup e registrare lo stesso numero di trasferimento del giorno precedente.
    NOTA: Anche se si nota un problema nel matraccio di una sola popolazione, trasferire tutte e dodici le popolazioni dai palloni di riserva in modo che il numero di generazioni trascorse in tutte le popolazioni rimanga in fase. Se si nota contaminazione nei palloni di riserva conservati a 4 °C, le popolazioni LTEE interessate devono essere riavviate dalle scorte congelate utilizzando la procedura descritta nelle fasi 3.1-3.2 per i campioni di popolazione. Il numero di trasferimento per l'LTEE non dovrebbe essere incrementato fino alla crescita delle prime colture in DM25 dopo la rinascita.

2. Archiviazione delle popolazioni LTEE

NOTA: I campioni delle popolazioni LTEE vengono congelati ogni 75 trasferimenti. Le popolazioni crescono ~ 6 2/3 generazioni ogni giorno dopo la diluizione di trasferimento di 100 volte, quindi questo periodo corrisponde a ~ 500 generazioni. Durante l'archiviazione, le popolazioni LTEE vengono anche placcate su diversi tipi di supporti agar per verificare la contaminazione. Facoltativamente, i cloni rappresentativi possono essere prelevati da queste lastre e archiviati in questo momento. Questi passaggi sono riepilogati nella Figura 1.

  1. Il giorno prima del congelamento previsto o qualche giorno prima, preparare tre tipi di piastre di agar: glucosio minimo (MG), arabinosio minimo (MA) e tetrazolio arabinosio (TA). Fai dodici piatti di ogni tipo di agar, più alcuni extra. Preparare anche almeno 250 ml di soluzione salina sterile allo 0,85% (p/v) e 50 ml di glicerolo sterile all'80% (v/v).
    NOTA: Le ricette per tutti i media e le soluzioni sono disponibili online30. Il giorno prima che l'LTEE raggiunga una generazione che è un multiplo di 500 per il normale programma di archiviazione è il 74° giorno dall'ultimo congelamento più eventuali giorni che sono stati aggiunti a causa di trasferimenti dai palloni di backup a 4 °C quando sono stati rilevati o sospettati problemi.
  2. FACOLTATIVO: Se si archiviano isolati clonali dalle popolazioni LTEE, preparare forniture aggiuntive: isolare tre cloni da ogni popolazione richiede 72 piastre MG, 80 ml di glicerolo all'80% (v / v) e 370 ml di DM1000.
  3. Preparare un set extra di dodici palloni quando si esegue il passaggio 1.2 dei trasferimenti LTEE giornalieri il giorno prima del congelamento pianificato. Etichettare sei dei palloni aggiuntivi da xA−1 a xA−6 usando un pennarello rosso e gli altri sei da xA+1 a xA+6 usando un pennarello nero.
    NOTA: La "x" indica che il set extra di palloni verrà utilizzato per l'archiviazione e li differenzia dall'altro set di palloni che verrà utilizzato per continuare i trasferimenti giornalieri dell'LTEE in parallelo.
  4. Riempire ciascuno dei palloni aggiuntivi che verranno utilizzati per l'archiviazione con 14,85 mL di DM25 utilizzando una pipetta sierologica da 25 mL quando si esegue la fase 1.4 dei trasferimenti LTEE giornalieri.
  5. Completare il normale trasferimento LTEE come descritto nei passaggi 1.5-1.11. Quindi, ripetere le istruzioni per il punto 1.8, ma questa volta trasferire 150 μL da ciascuna delle colture LTEE del giorno precedente ai palloni aggiuntivi di 14,85 ml di DM25 fresco che verranno utilizzati per l'archiviazione.
    NOTA: in questa e in tutte le fasi successive, evitare contaminazioni e confusioni seguendo queste linee guida. Inizia con la popolazione A-1, quindi trasferisci A+1 e poi continua alternando -e + popolazioni. Pulire la canna e l'espulsore del micropipettor con una salvietta di carta priva di lanugine inumidita con etanolo al 70% quando si cambia popolazione. Spostare i palloni e le provette nei loro vassoi o scaffali dopo il pipettaggio da o verso di essi per tenere traccia di quali trasferimenti sono stati completati.
  6. Incubare la serie di dodici palloni per l'archiviazione a 37 °C per 24 ± 1 ora con agitazione orbitale a 120 giri/min su un diametro di 1 pollice accanto alle dodici colture LTEE e al bianco come descritto al punto 1.9.
  7. Preparare le forniture per la placcatura delle popolazioni LTEE almeno un'ora prima che i trasferimenti LTEE vengano eseguiti il giorno del congelamento.
    1. Seleziona dodici piastre di agar MG, dodici MA e dodici TA. Ispezionare visivamente ciascuno per essere sicuri che non abbia alcuna contaminazione evidente.
    2. Etichettare uno di ogni tipo di piastra per ciascuna delle dodici popolazioni LTEE (da A−1 a A+6).
      NOTA: Quando si etichettano le piastre, scrivere sui lati del fondo della capsula di Petri. Questo è importante per non oscurare le colonie quando si vuole esaminarle o fotografarle da sotto l'agar. Non scrivere sui coperchi, poiché questi possono essere confusi.
    3. Porre le piastre di agar in un'incubatrice a 37 °C per almeno 20 minuti per riscaldarle prima di utilizzarle al punto 2.10.
    4. Preparare 24 provette contenenti 9,9 ml di soluzione salina. Disponeteli in dodici serie di due tubi ciascuna.
    5. Etichettare ciascuno dei due set di dodici provette allo stesso modo delle piastre, aggiungendo un "1" o un "2" sotto l'identificatore della popolazione LTEE per designare l'ordine in cui verranno utilizzate per effettuare diluizioni di quella popolazione.
  8. Eseguire i passaggi 1.1-1.11 utilizzando i palloni che continueranno i trasferimenti giornalieri dell'LTEE come al solito. Durante il punto 1.5, rimuovere dall'incubatore agitatore anche i dodici palloni contenenti le colture extra per l'archiviazione.
  9. Pipettare 100 μL della coltura da ciascuno dei dodici palloni aggiuntivi per l'archiviazione nella prima provetta di soluzione salina nella coppia per quella popolazione LTEE. Vortice i tubi con queste diluizioni 100 volte accuratamente. Quindi, pipettare 100 μL da ciascuno al corrispondente secondo tubo di soluzione salina. Vortice le ultime diluizioni di coltura di 10.000 volte a fondo.
  10. Pipettare 80 μL da ciascuna delle provette contenenti una diluizione della coltura di 10.000 volte nelle piastre TA, MG e MA etichettate per quella popolazione. Distribuire uniformemente il liquido sulla superficie dell'agar utilizzando un'asta di diffusione sterile o perline sterili, a seconda delle preferenze. Ripeti fino a quando tutte e dodici le popolazioni sono state placcate su tutti e tre i tipi di supporti.
  11. Se necessario, lasciare asciugare le piastre fino a quando non è visibile alcun liquido sull'agar. Posizionare le piastre capovolte (con il lato dell'agar rivolto verso l'alto) in un incubatore a convezione gravitazionale impostato a 37 °C.
    NOTA: Le piastre di incubazione capovolte impediscono all'agar di asciugarsi e impediscono alla condensa di gocciolare sulla superficie dell'agar. Il movimento delle cellule nel liquido sulla superficie dell'agar durante l'incubazione può spalmare le colonie e produrre conteggi di colonie errati.
  12. Aggiungere 3 ml di glicerolo sterile all'80% (v/v) a ciascuno dei dodici palloni supplementari destinati all'archiviazione. Mescolare accuratamente ruotando e vorticando delicatamente.
  13. Distribuire la miscela da ciascun matraccio a crioviali sterili etichettati con un identificatore univoco per il campione, la popolazione LTEE a cui appartiene il campione, la generazione in cui è stato congelato, che si tratta di un campione misto (popolazione) e la data. Pipettare 6 mL in un flaconcino grande e 1,25 mL in ciascuno dei sei flaconcini piccoli.
    NOTA: Il flaconcino grande è il materiale di lavoro. Una piccola fiala è un backup nel caso in cui il materiale di lavoro sia esaurito o venga contaminato. Le altre cinque piccole fiale sono copie che possono essere inviate ad altri laboratori.
  14. Congelare i flaconcini riempiti a -80 °C.
  15. Esaminare e documentare la crescita e le morfologie delle colonie sulle placche TA, MG e MA dopo 24 ore e 48 ore di incubazione.
    NOTA: Vedere la sezione Risultati rappresentativi per immagini e descrizioni delle colonie formate dagli antenati REL606 e REL607 e ciascuna delle dodici popolazioni LTEE quando sono state placcate a 76.000 generazioni.
  16. FACOLTATIVO: eseguire i passaggi seguenti durante l'archiviazione degli isolati clonali.
    1. Prelevare tre isolati clonali (colonie) per ogni popolazione LTEE dalle piastre MG, striare ciascuno separatamente su una nuova piastra MG e incubare queste piastre per 16-24 ore a 37 °C.
      NOTA: Se sono presenti colonie con morfologie diverse, la pratica standard nell'LTEE è quella di campionare per la massima diversità scegliendo prima il tipo più comune, quindi selezionando ulteriori colonie da tipi minoritari. Si può anche usare una strategia di campionamento casuale segnando punti sul lato inferiore della capsula di Petri prima di diffondere le cellule e quindi scegliere la colonia isolata più vicina a ciascun segno dopo la crescita.
    2. Il giorno successivo, strisciare una colonia rappresentativa da ciascuna piastra su una nuova piastra MG e incubare queste piastre per 16-24 ore a 37 °C.
    3. Il giorno seguente, inoculare una colonia isolata da ciascuna piastra MG in un matraccio contenente 10 ml di DM1000 fresco. Inoltre, riempire un altro pallone con 10 ml di DM1000 da utilizzare come bianco non vaccinato per verificare la contaminazione dei fluidi.
    4. Incubare i palloni a 37 °C per 16-24 ore con agitazione orbitale a 120 giri/min su un diametro di 1 pollice.
    5. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 ml di glicerolo sterile all'80% (v/v) a ciascun matraccio e agitare per mescolare.
    6. Distribuire 1,25 mL di aliquote da ciascun matraccio in piccoli flaconcini sterili etichettati con un identificatore univoco per ciascun clone, la sua popolazione LTEE e la generazione di origine, che si tratta di un campione clonale e la data.
    7. Congelare i flaconcini riempiti a -80 °C.

3. Saggi di fitness competitivo

NOTA: Nell'LTEE, l'idoneità riproduttiva è quantificata in termini di numero relativo di raddoppi che diversi batteri raggiungono in uno o più cicli di coltura di 24 ore nelle stesse condizioni dei trasferimenti giornalieri. In particolare, l'idoneità relativa di un concorrente rispetto a un altro è il rapporto tra i loro tassi di raddoppio realizzati quando competono testa a testa in una co-cultura. Ogni concorrente in una coppia può essere una popolazione completa o un isolato clonale che è stato precedentemente archiviato come parte del "record fossile" congelato del LTEE. In alternativa, uno o entrambi i concorrenti possono essere un clone che è stato geneticamente modificato per aggiungere o rimuovere mutazioni specifiche per testare i loro effetti. I due concorrenti devono avere stati Ara+/Ara− opposti perché questo marcatore genetico viene utilizzato per differenziarli durante questo test. Il flusso di lavoro complessivo per un test di competizione è illustrato nella Figura 2. La durata della fase di co-coltura può essere estesa da uno a tre (o più) giorni per migliorare la precisione delle stime di idoneità durante i test per le differenze tra i concorrenti che sono quasi uguali. Si veda la Disussion per altre considerazioni critiche e possibili modifiche di questo protocollo.

Figure 2
Figura 2: Diagramma di flusso del saggio di concorrenza. Viene mostrata la procedura completa per un test di concorso di un giorno. La procedura di tre giorni continua con il percorso alternativo il giorno 1 e il giorno 2 fino alla placcatura del giorno 3 nello stesso modo illustrato per il giorno 1 della competizione di un giorno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Preparare le forniture
    1. Decidi quanti ceppi LTEE e/o popolazioni concorrenti saranno utilizzati e quanti test di replica della competizione verranno eseguiti per ogni coppia di concorrenti. Preparare le forniture necessarie come descritto nei passaggi seguenti.
      NOTA: Le ricette per tutti i media e le soluzioni sono disponibili online30. I palloni e le provette necessari per tutti i giorni di un esperimento di concorso possono essere riempiti in anticipo o secondo necessità nei giorni in cui saranno utilizzati. Se i palloni e le provette vengono riempiti in anticipo, conservarli a temperatura ambiente al buio per ridurre al minimo l'evaporazione. Le piastre TA devono essere preparate almeno due giorni prima di quando verranno utilizzate in modo che possano asciugarsi abbastanza dopo essere state versate per consentire la diffusione di diluizioni di coltura. Preparare sempre alcuni palloni extra, provette e piastre TA in modo che un esperimento possa continuare se ci sono errori di pipettaggio, piastre contaminate o altri piccoli incidenti.
    2. Per il giorno di risveglio (Giorno -2), riempire un matraccio sterile di Erlenmeyer da 50 mL ricoperto da un becher da 20 mL con 9,9 mL di DM1000 o Brodo di lisogenia (LB) per ceppo o popolazione di E. coli che verrà utilizzato come concorrente. Riempire un altro matraccio con 9,9 mL dello stesso mezzo per servire come un bianco non inoculato.
    3. Per il giorno di precondizionamento (Giorno -1), riempire una provetta con 9,9 mL di soluzione salina sterile allo 0,85% (p/v) per concorrente, due palloni con 9,9 mL di DM25 per test replicato tra una coppia di concorrenti e un altro matraccio con 9,9 mL di DM25 per uno sbianco.
    4. Per il giorno in cui inizia la competizione (Giorno 0), riempire un pallone con 9,9 mL di DM25, riempire una provetta con 9,9 mL di soluzione salina sterile allo 0,85% (p/v) e preparare una piastra TA per replica del test di gara. Riempire un altro matraccio con 9,9 mL di DM25 per servire come uno spazio vuoto.
    5. ALTERNATIVA: Per ogni giorno di una competizione di più giorni dopo il primo, riempire un pallone con 9,9 mL di DM25 per replica della competizione e riempire un altro pallone con 9,9 mL di DM25 per uno spazio vuoto.
    6. Per l'ultimo giorno della competizione (ad esempio , Giorno 1 o Giorno 3), riempire due provette con 9,9 ml di soluzione salina sterile allo 0,85% (p/v) e preparare una piastra TA per ogni replica della competizione.
  2. Giorno −2: Rilanciare i concorrenti separatamente in DM1000 o LB
    1. Per ciascuno dei concorrenti, etichettare un matraccio riempito con 9,9 ml di DM1000 o LB. Etichettare un altro matraccio riempito con 9,9 mL dello stesso lotto di terreno da utilizzare come bianco non inoculato per verificare la contaminazione.
      NOTA: Le scorte congelate vengono riportate in LB o DM1000 per un recupero più uniforme e prevedibile delle cellule crioconservate. Il glicerolo utilizzato come crioprotettore può essere metabolizzato da E. coli, il che porterà a densità cellulari più elevate del previsto se i campioni vengono rianimati in DM25. LB e DM1000 supportano la crescita a densità cellulari così elevate che questa complicanza diventa trascurabile.
    2. Estrarre i crioviali contenenti le scorte congelate dei ceppi concorrenti dal congelatore a -80 °C. Tenere i flaconcini refrigerati in un secchiello del ghiaccio durante l'utilizzo.
    3. Dopo che ogni stock congelato si è scongelato, vortice accuratamente per risospendere le cellule di E. coli. In caso di rianimazione di un clone, inoculare il matraccio contenente terreno fresco con 12 μL di brodo congelato. Se si rianima una popolazione, inoculare il matraccio con 120 μL di brodo congelato.
      NOTA: Il volume di 120 μL dello stock congelato viene utilizzato per le popolazioni in modo che il numero di cellule che viene rianimato sia approssimativamente lo stesso del collo di bottiglia giornaliero quando l'1% della popolazione LTEE viene trasferito in un nuovo pallone. Lo scongelamento e il vortice degli stock congelati più volte può stressare le cellule e ridurre la redditività degli stock nel tempo. Se una determinata popolazione o clone LTEE verrà utilizzata nelle competizioni più volte, è buona norma ricrescere e congelare più copie dello stock in modo che nessuna singola venga scongelata e ricongelata molte volte.
    4. Incubare i palloni di risveglio e il bianco a 37 °C durante la notte (16-24 h) con agitazione orbitale a 120 giri/min su un diametro di 1 pollice.
  3. Giorno −1: Precondizionare i concorrenti separatamente in DM25
    1. Per ogni concorrente, etichettare una provetta riempita con 9,9 ml di soluzione salina. Per ogni test di replica del concorso tra una coppia di concorrenti, etichettare due palloni da 50 ml riempiti con 9,9 ml di DM25, ciascuno con il numero di replica e il nome di uno dei concorrenti. Etichettare un altro matraccio riempito con 9,9 mL di DM25 da utilizzare come spazio vuoto.
    2. Prendi le fiasche contenenti le culture dei concorrenti rianimati fuori dall'incubatrice. Esamina la loro torbidità ad occhio nudo per confermare che sono cresciuti e che non vi è alcuna contaminazione evidente.
    3. Pipettare 100 μL da ciascun matraccio nella provetta di soluzione salina per quel concorrente.
      NOTA: Questo passaggio diluisce la coltura di 100 volte, il che è necessario perché la densità delle cellule è molto più alta in LB e DM1000 rispetto all'ambiente DM25 utilizzato nell'LTEE (vedere Risultati rappresentativi).
    4. Vortice accuratamente ogni tubo di diluizione prima di pipettare 100 μL dalla coltura diluita in un matraccio con DM25 fresco. Inoculare due di questi palloni di precondizionamento per ciascun test replicato, uno per ciascuno dei concorrenti.
    5. Incubare i palloni di precondizionamento e il grezzo a 37 °C per 24 ± 1 h con agitazione orbitale a 120 giri/min su un diametro di 1 pollice.
  4. Giorno 0: Inizia la competizione mescolando concorrenti e piastra per i conteggi iniziali
    1. Per ogni replica del test di concorso, etichettare un matraccio riempito con 9,9 mL di DM25 e una provetta riempita con 9,9 mL di soluzione salina. Etichettare i palloni e i tubi in modo da identificare in modo univoco ogni coppia di concorrenti e il numero di replica del test di competizione. Etichettare un altro matraccio riempito con 9,9 mL di DM25 da utilizzare come spazio vuoto.
    2. Estrarre i palloni di precondizionamento dall'incubatore. Esamina la loro torbidità ad occhio nudo per confermare che sono cresciuti e che non vi è alcuna contaminazione evidente.
    3. Trasferire 50 μL del concorrente Ara− nel primo pallone da competizione replicato riempito con DM25 fresco. Trasferire immediatamente 50 μL del concorrente Ara+ nello stesso matraccio da competizione e mescolare ruotando delicatamente.
    4. Ripetere il passaggio 3.4.3 per tutte le repliche di tutte le coppie di concorrenti.
      NOTA: I palloni da competizione hanno ora una diluizione complessiva di 100 volte di colture di E. coli coltivate in DM25, le stesse cellule condizione nell'esperienza LTEE dopo ogni trasferimento giornaliero. L'ordine di esecuzione dei trasferimenti e della miscelazione è importante. Aggiungere immediatamente entrambi i concorrenti a ciascun pallone uno dopo l'altro, in modo che nessuno dei due inizi a crescere nel terreno fresco. Ad esempio, non aggiungere le colture Ara− a tutti i palloni da competizione e poi tornare indietro e aggiungere tutti i ceppi Ara+ .
    5. Pipettare 100 μL da ciascun pallone da competizione appena inoculato nella provetta di soluzione salina etichettata per quel test di competizione replicare in modo che ciascuna di queste provette contenga una diluizione complessiva di 10.000 volte delle colture DM25 precondizionate che sono state combinate.
    6. Posizionare i palloni da competizione e metterli in bianco nell'incubatrice agitatrice. Incubare i palloni da competizione a 37 °C per 24 ± 1 h con scuotimento orbitale a 120 giri/min su un diametro di 1 pollice.
    7. Lo stesso giorno, subito dopo aver inserito i palloni da competizione nell'incubatore, vortice accuratamente ciascuna provetta del punto 3.4.5 e distribuire 80 μL di queste diluizioni da 10.000 volte su piastre TA, come descritto al punto 2.10. Etichetta il lato del fondo di ogni piastra con la coppia di ceppi che sono stati miscelati, il numero di replica e "Giorno 0" per indicare che verrà utilizzato per determinare la rappresentazione iniziale di ciascun concorrente.
    8. Incubare le piastre TA capovolte in un incubatore a convezione gravitazionale a 37 °C fino a quando le colonie dei concorrenti Ara− e Ara+ sono visibili e distinguibili. Generalmente, questo si verifica entro 16-24 ore, ma potrebbe richiedere più tempo per alcuni ceppi evoluti. Conta il numero di colonie Ara− (rosso) e Ara+ (bianco) su ogni piastra eregistra i risultati.
      NOTA: Le differenze tra i colori delle colonie Ara- e Ara+ sulle piastre TA diventano meno nette nel tempo, anche quando le piastre sono conservate a 4 °C, quindi devono essere contate il più rapidamente possibile una volta rimosse dall'incubatore. Le immagini delle piastre TA che mostrano l'aspetto tipico delle colonie formate dalle cellule Ara− e Ara+ sono incluse nei risultati rappresentativi. Quella sezione ha anche immagini di colonie comuni "caso limite" (ad esempio, sovrapposizione o escrescenza di diversi tipi di colonie) e spiega come contarle. Se i tassi di crescita e le morfologie delle colonie formate su piastre TA da uno qualsiasi dei concorrenti non sono state precedentemente caratterizzate, distribuire 80 μL di una diluizione di 10.000 volte in soluzione salina dai palloni di precondizionamento il giorno 0, quando i concorrenti sono ancora separati l'uno dall'altro. Quindi, esaminare le colonie su queste piastre di controllo dopo l'incubazione a 37 °C per 16-24 ore o più.
  5. ALTERNATIVA: Giorni 1 e 2: Continua la competizione di tre giorni
    1. Per ogni replica del test di concorso, etichettare un matraccio riempito con 9,9 ml di DM25. Etichettare i palloni in modo da identificare in modo univoco ogni coppia di concorrenti, il numero di replica e il giorno del test della competizione. Etichettare un altro matraccio riempito con 9,9 mL di DM25 da utilizzare come spazio vuoto.
    2. Prelevare dall'incubatrice le borracce da competizione del giorno precedente. Esaminare la loro torbidità ad occhio per verificare la crescita prevista e rilevare la contaminazione.
    3. Trasferire 100 μL da ciascun matraccio da competizione nel corrispondente matraccio di mezzo fresco per il giorno successivo della competizione.
    4. Posizionare i nuovi palloni da competizione e metterli in bianco nell'incubatrice vibrante. Incubarli a 37 °C per 24 ± 1 ora con scuotimento orbitale a 120 giri/min su un diametro di 1 pollice.
    5. Ripetere i passaggi 3.5.1-3.5.4 il giorno 2 della competizione prima di procedere.
  6. Giorno 1 o 3: Fine gara e targa per i conteggi finali
    1. Per ogni pallone da competizione, preparare due provette riempite con 9,9 ml di soluzione salina. Etichettali in modo da identificare in modo univoco ogni coppia di concorrenti, il numero di replica e se sono per la prima o la seconda diluizione.
    2. Prendi le borracce da competizione dall'incubatrice. Esamina la loro torbidità ad occhio per rilevare che sono cresciuti e non c'era contaminazione evidente.
    3. Pipettare 100 μL da ciascun matraccio da competizione nel primo tubo di soluzione salina per quella replica. Le provette risultanti contengono diluizioni 100 volte delle colture DM25.
    4. Vortice ogni tubo di diluizione 100 volte per miscelarlo accuratamente e pipettare 100 μL al secondo tubo di soluzione salina per quello replicare. Le provette risultanti contengono diluizioni 10.000 volte delle colture DM25.
    5. Vortice accuratamente ogni provetta contenente una diluizione di 10.000 volte e distribuirne 80 μL su una piastra TA come descritto al punto 2.10. Etichetta il lato del fondo di ogni piastra con la coppia di ceppi che sono stati miscelati, il numero di replica e "Giorno 1" per una competizione di un giorno o "Giorno 3" per una competizione di tre giorni per indicare che verrà utilizzato per determinare la rappresentazione finale di ciascun concorrente.
    6. Incubare le piastre di TA a 37 °C e contare le colonie Ara− e Ara+ dopo la crescita come descritto nella fase 3.4.8.
      NOTA: tenere traccia del numero di replica di ciascun test di concorso durante tutte le fasi di trasferimento e placcatura. Confondere quali conteggi finali e iniziali corrispondano tra diversi test di replica - anche quando gli stessi due concorrenti sono stati mescolati in ciascuno di essi - si tradurrà in stime di idoneità errate.
  7. Calcolo e idoneità della trama
    1. Se si utilizza Excel per calcolare e tracciare l'idoneità relativa, scaricare il foglio di calcolo XLS (file supplementare 1). Se si utilizza R, installare il pacchetto fitnessR31 e scaricare il modello CSV (Supplemental File 2) o generare una nuova copia di questo file seguendo le istruzioni riportate nella vignetta.
    2. Immettere una "diluizione di trasferimento" di 100 per i test del concorso condotti nella cella o colonna designata nel file scaricato. Inserisci il numero totale di cicli di crescita giornalieri durante i quali i concorrenti sono stati co-coltivati come "numero di trasferimenti" (ad esempio, 3 per una competizione di tre giorni).
    3. Inserire i nomi di ciascuna coppia di concorrenti nelle celle o colonne designate con il ceppo di riferimento come "concorrente1" e il ceppo o la popolazione di prova come "concorrente2".
    4. Per ogni replica del test di competizione, inserire i rispettivi conteggi delle colonie iniziali e finali nelle colonne designate del file scaricato.
    5. Se si utilizza il foglio di calcolo Excel, ora verrà visualizzato il valore medio di idoneità relativa e i limiti di confidenza del 95% su questa stima. Copia i risultati per diverse combinazioni di concorrenti in un altro foglio e crea un grafico che riepiloga i risultati. Se si utilizza R per analizzare i dati, seguire le istruzioni nella vignetta per il pacchetto fitnessR per eseguire questi calcoli, generare un file CSV con i valori calcolati e tracciare i risultati.

Representative Results

Aspetto e torbidità delle colture LTEE
A causa della bassa concentrazione di glucosio in DM25, la torbidità delle popolazioni LTEE completamente cresciute è appena visibile in undici dei dodici palloni. Quando si esaminano le colture LTEE ad occhio nudo per rilevare una crescita normale e segni di contaminazione (fase 1.6), ogni pallone contenente una popolazione LTEE deve essere confrontato fianco a fianco con il bianco (Figura 3A). L'eccezione è la popolazione A-3, che si è evoluta per utilizzare il citrato come fonte aggiuntiva di carbonio ed energia e quindi raggiunge una densità cellulare più elevata32. La torbidità delle colture DM25 dei ceppi antenati REL606 e REL607 è simile a quella di una tipica popolazione evoluta (Figura 3B). I ceppi e le popolazioni LTEE crescono fino a una maggiore densità in DM1000 a causa della maggiore concentrazione di glucosio e una densità molto più elevata in LB (Figura 3B). La densità delle colture DM25 della popolazione A-3 LTEE è intermedia tra le densità delle colture di REL606 in DM25 e DM1000 (Figura 3C).

Figure 3
Figura 3: Comparsa delle colture LTEE. (A) I flaconi contenenti le dodici popolazioni LTEE dopo 24 ore di crescita in DM25 il giorno in cui l'esperimento ha raggiunto 76.253 1/3 generazioni sono raffigurati accanto al bianco. (B) I palloni contenenti colture degli antenati REL606 e REL607 coltivati per 24 ore in DM25, DM1000 e LB sono raffigurati accanto agli spazi vuoti dei supporti. (C) Immagini ingrandite degli stessi palloni affiancate che mostrano come la torbidità del pallone della popolazione A-3 in DM25 si confronta con l'antenato REL606 in DM25 e DM1000. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Le letture spettrofotometriche delle densità ottiche a 600 nm (OD600) di colture coltivate in DM25 (fase 1.7) corrispondono a queste osservazioni visive sia per le popolazioni LTEE (Figura 4A) che per i loro antenati (Figura 4B). Queste letture possono essere utilizzate per confrontare quantitativamente e documentare la crescita quando si sospetta una contaminazione o un errore. Per le misurazioni delle popolazioni LTEE tra 76.000 e 76.500 generazioni, abbiamo scoperto che l'OD600 di A-3, la popolazione che si è evoluta per crescere sul citrato, era in media 0,223 (0,218-0,227, intervallo di confidenza del 95%). L'OD600 delle altre undici popolazioni era in media 0,0252 (0,0239-0,0265, intervallo di confidenza al 95%). C'è stata una leggera, ma significativa variazione nelle letture OD600 tra le undici popolazioni normali (F 10,88 = 5,1035, p = 7,5×10−6). Le popolazioni LTEE raggiungono la fase stazionaria dopo circa 5-6 ore di incubazione. Se vengono trasferiti al mattino, la crescita sarà visibile da metà a tardo pomeriggio dello stesso giorno. Molte specie di microbi sono in grado di crescere aerobicamente sul citrato. Pertanto, l'aumento della torbidità in popolazioni diverse da A-3 è probabilmente un segno di contaminazione esterna.

Figure 4
Figura 4: Torbidità delle colture LTEE . (A) Densità ottica a 600 nm (OD600) delle dodici popolazioni LTEE dopo il ciclo di crescita di 24 ore in tre giorni diversi tra 76.000 e 76.500 generazioni dell'esperimento. I valori OD600 di tre aliquote da 1 mL in ciascuno dei tre diversi giorni sono tracciati come punti. Il valore medio OD600 di tre diverse aliquote del bianco dello stesso giorno è stato sottratto da questi valori. Le barre piene mostrano le medie. Le barre di errore sono limiti di confidenza del 95%. (B) OD600 delle colture degli antenati REL606 e REL607 in DM25, DM1000 e LB. I valori OD600 di tre aliquote da 1 mL su ciascuno dei tre giorni diversi di due colture separate per ogni condizione e ceppo sono tracciati come punti. Il valore medio OD600 di tre diverse aliquote del bianco dello stesso giorno è stato sottratto da questi valori. Le barre riempite mostrano le medie e le barre di errore sono limiti di confidenza del 95%. Le aree ombreggiate grigie tra i pannelli mostrano come l'asse OD600 viene riscalato tra il pannello DM25 e i pannelli DM1000 e LB. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Crescita e morfologia delle colonie LTEE
Quando si controllano le popolazioni per la contaminazione placcandole su diversi supporti (fase 2.15), gli antenati REL606 e REL607 e tutte le popolazioni evolute formano colonie bianche con bordi traslucidi e un po 'irregolari su piastre di agar di glucosio minimo (MG) (Figura 5A). La composizione dell'agar MG è la stessa di quella del DM25 utilizzato nei trasferimenti giornalieri di LTEE, tranne che con una maggiore concentrazione di glucosio, quindi le popolazioni LTEE evolute spesso formano colonie più grandi su MG rispetto agli antenati. A causa della sua maggiore densità cellulare in DM25, la popolazione A-3 avrà molte più colonie se lo stesso volume è placcato per esso come per le altre popolazioni, e questo può limitare la dimensione delle colonie. I tipi più comuni di microbi contaminanti formano colonie bianche, opache e perfettamente circolari su MG.

Sull'agar arabinosio minimo (MA), l'antenato REL607 e le popolazioni Ara+ formano tipicamente colonie bianche leggermente traslucide. Questo tipico modello di crescita è persistito per le popolazioni Ara+ attraverso 76.000 generazioni, ad eccezione di A + 6, che ha sviluppato un difetto nella crescita sull'arabinosio e non forma più colonie su MA (Figura 5B). Non esiste una selezione per mantenere la crescita sull'arabinosio durante i trasferimenti LTEE in DM25, quindi altre popolazioni Ara+ potrebbero anche eventualmente smettere di formare colonie su piastre di agar MA mentre l'esperimento continua. Con l'eccezione di A-3, le popolazioni Ara− non formano colonie sull'agar MA, anche se un attento esame può rivelare microcolonie a causa di tracce di nutrienti nell'agar. La popolazione A-3 forma numerose piccole colonie su MA, poiché queste cellule possono crescere sul citrato che è presente anche in questo mezzo. Le colonie di contaminanti su MA sono rare.

Figure 5
Figura 5: Placcatura delle popolazioni LTEE per rilevare la contaminazione. Le diluizioni degli antenati REL606 e REL607 e delle dodici popolazioni LTEE il giorno in cui l'esperimento ha raggiunto 76.026 2/3 generazioni sono state placcate su piastre di agar (A) MG, (B) MA e (C) TA e fotografate dopo 24 ore e 48 ore. Le stesse diluizioni sono state fatte per tutte le culture, ma la metà del volume è stato placcato per gli antenati come descritto nel protocollo per le popolazioni LTEE, per tenere conto in qualche modo delle loro densità cellulari più elevate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Sull'agar tetrazolio arabinosio (TA), l'antenato REL606 e tutte le popolazioni Ara− dovrebbero formare colonie rosse, mentre l'antenato REL607 e tutte le popolazioni Ara+ dovrebbero generalmente formare colonie bianche (che possono includere sfumature rosa chiaro o pesca) (Figura 5C). Gli antenati LTEE formano colonie robuste, che sono facilmente identificabili come Ara− e Ara+ su agar TA entro 16-24 ore. Originariamente, questa differenza poteva essere utilizzata per rilevare la contaminazione incrociata tra le popolazioni Ara− e Ara+ . Tuttavia, l'agar TA ha una composizione nutritiva più complessa rispetto al mezzo DM25 chimicamente definito utilizzato nei trasferimenti giornalieri e non c'è stata una pressione evolutiva per E. coli nell'LTEE per mantenere la capacità di crescere robustamente in queste condizioni. Di conseguenza, alcune popolazioni LTEE evolute ora mostrano una scarsa crescita sulle piastre TA, impiegando 48 ore per formare colonie o non crescendo in modo affidabile. Anche i colori e le morfologie delle colonie formate su TA dalle popolazioni LTEE evolute sono cambiate rispetto agli antenati e si sono differenziate l'una dall'altra. La presenza di alcune colonie aberranti non è sempre indice di contaminazione. Possono verificarsi mutazioni spontanee che cambiano lo stato marcatore Ara dei ceppi LTEE, in particolare da Ara+ ad Ara− a causa della maggiore probabilità di mutazioni con perdita di funzione che influenzano l'utilizzo dell'arabinosio rispetto alle mutazioni di reversione che ripristinano l'attività di araA. Le mutazioni che cambiano gli stati dei marcatori Ara sono più comuni nelle popolazioni che hanno sviluppato ipermutazioni (A-1, A-2, A-3, A-4, A+3 e A+6)13. Sull'agar TA, i microbi contaminanti di altre specie spesso (ma non sempre) formano piccole colonie perfettamente circolari con centri rossi circondati da distinti confini bianchi che sono diversi da quelli formati da qualsiasi ceppo o popolazione LTEE.

Risultati della competizione di co-cultura
Le competizioni tra tutte le coppie Ara− e Ara+ dei due antenati LTEE (REL606 e REL607, rispettivamente) e i campioni di popolazione A-5 e A+5 archiviati a 20.000 generazioni (REL8597 e REL8604, rispettivamente) mostrano come le colonie con diversi stati marcatori Ara possano essere differenziate e contate su agar TA (fasi 3.4.8 e 3.6.6) (Figura 6). Le colonie sono state contate per sei fiaschi replicati per ogni coppia di concorrenti prima e dopo test di un giorno e tre giorni che sono iniziati con il risveglio in DM1000 (Tabella 1). Il numero totale di colonie osservate per la stessa diluizione e volume placcato varia con cui i concorrenti sono stati mescolati perché le colture di popolazioni LTEE evolute raggiungono densità cellulari inferiori rispetto alle colture dei ceppi antenati in DM25. Questa differenza è una conseguenza dell'evoluzione dell'aumento delle dimensioni delle cellule, che si è verificato in tutte le popolazioni LTEE durante le prime migliaia di generazioni dell'esperimento 8,33.

Figure 6
Figura 6: Saggi di gara placcati su piastre di agar TA. Esempi di piastre di agar TA da saggi di concorrenza. REL606 e REL607 sono rispettivamente gli antenati Ara− e Ara+ dell'LTEE. REL8597 e REL8604 sono le 20.000 popolazioni di generazione A-5 e A+5, rispettivamente, dai "reperti fossili" congelati dell'LTEE. Le piastre TA corrispondenti a un test replicato tra ciascuna coppia di ceppi sono mostrate per il giorno 0, il giorno 1 e il giorno 3 della competizione. Le lastre sono state fotografate dopo 24 ore di crescita a 37°C. Le cellule dei concorrenti REL606 e REL8597 sono Ara− e formano colonie rosse. Le cellule dei concorrenti REL607 e REL8604 sono Ara+ e formano colonie bianche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La maggior parte delle colonie su una tipica piastra TA da competizione sarà ben separata o si sovrapporrà in modi per i quali è facile contare quante colonie inizialmente circolari di diversi tipi sono cresciute insieme (Figura 7A). Tuttavia, possono verificarsi alcune situazioni in cui non è ovvio come contare una colonia atipica o una crescita che è una miscela dei due colori. In primo luogo, quando una colonia bianca Ara+ e una colonia Ara− rossa si sovrappongono, la colonia Ara+ tende a crescere troppo e ad avvolgere la colonia Ara−. In questa situazione, si dovrebbe contare una piccola macchia rossa o "gap" traslucido nella più grande colonia Ara+ come una colonia Ara− (Figura 7B). In secondo luogo, i mutanti Ara+ spontanei sorgeranno occasionalmente nelle colonie Ara−. Questi mutanti appaiono tipicamente come settori bianchi (papille) che si diffondono più rapidamente dall'interno di una colonia rossa perché crescono più rapidamente una volta ottenuto l'accesso all'arabinosio come nutriente aggiuntivo (Figura 7C). Queste colonie a settori bianchi sono contate come una colonia Ara− e nessuna colonia Ara+. Questa situazione diventa più comune se le piastre vengono incubate per 48 ore o più. In terzo luogo, a volte si osservano colonie rosate traslucide (Figura 7D). Questi sono formati dal concorrente Ara-. Infine, un piccolo numero di colonie circolari con interni di una tonalità di rosso leggermente diversa a volte crescono su piastre TA quando sono contaminate da alcune cellule microbiche esterne durante la preparazione dell'agar o quando diffondono diluizioni di coltura sulle loro superfici (Figura 7E). Queste colonie contaminanti non dovrebbero essere conteggiate. Se si sospetta la contaminazione di una cultura della competizione perché ci sono molte colonie atipiche su una qualsiasi delle sue piastre TA, tale replica dovrebbe essere esclusa.

Figure 7
Figura 7: Casi limite riscontrati durante il conteggio delle colonie Ara− e Ara+ su agar TA. In ogni pannello, alcune colonie Ara− e Ara+ che dovrebbero essere contate sono contrassegnate rispettivamente con frecce rosse e nere. Le colonie che non dovrebbero essere contate sono indicate con frecce tratteggiate corrispondenti al tipo che sembrano essere. Tutte le foto sono state scattate dopo 24 ore di incubazione tranne nel pannello C. (A) Esempi di colonie normali di Ara− e Ara+ . (B) Esempi di colonie Ara+ che ricoprono le vicine colonie Ara− , tra cui una che è appena visibile come una fessura trasparente all'esterno della colonia bianca. Conta ciascuno di questi casi come due colonie, una di ogni tipo. (C) Esempi di colonie Ara− che danno origine a settori mutanti Ara+ . Conta ogni caso come una singola colonia Ara− . Il settore bianco (papilla) che si crea è dovuto a un mutante Ara+ che sorge all'interno della colonia. Lo stesso campo di colonie viene mostrato dopo 24 ore, 48 ore e 72 ore di crescita. (D) Esempio di colonia rosa traslucida. Contalo come Ara−. (E) Esempi di colonie formate da contaminazione esterna da parte di un microbo che non è E. coli. Questi sono rossi ma più piccoli e perfettamente circolari con un bordo bianco distinto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'analisi dei conteggi delle colonie di queste competizioni utilizzando il foglio di calcolo Excel (file supplementare 1) o eseguendo le funzioni del pacchetto fitnessR in R sui conteggi delle colonie inserite nel modello CSV (file supplementare 2) mostra che i due antenati sono indistinguibili in termini di idoneità all'interno della precisione del test, che entrambe le popolazioni A-5 e A+5 di 20.000 generazioni sono significativamente più adatte degli antenati, e che nessuna delle due popolazioni evolute è significativamente più adatta dell'altra (test t di Welch, p > 0,05) (Figura 8). La precisione della stima della forma fisica relativa migliora nelle competizioni di tre giorni rispetto alle competizioni di un giorno per una delle coppie strettamente abbinate (REL606 vs REL607). La precisione di queste misurazioni potrebbe essere ulteriormente aumentata conducendo competizioni più lunghe con più cicli di crescita, se lo si desidera. Tuttavia, i risultati delle competizioni di più giorni non sono informativi una volta che un concorrente diventa così abbondante rispetto all'altro dopo i giorni aggiuntivi di competizione che il rapporto tra i due ceppi non può essere determinato con precisione perché ci sono pochissime o nessuna colonia del tipo meno adatto da contare. Questo è il caso delle competizioni di tre giorni degli antenati contro le popolazioni di generazione 20.000 evolute (REL606 vs. REL8604 e REL607 vs. REL8597) (Figura 6 e Tabella 1).

Tabella 1: Conteggi delle colonie dai test di fitness competitivo. Sono stati eseguiti test di gara di uno e tre giorni con sei repliche per tutte le combinazioni a coppie di due concorrenti Ara− e dei due concorrenti Ara+ . REL606 e REL607 sono rispettivamente gli antenati Ara− e Ara+ dell'LTEE. REL8597 e REL8604 sono le 20.000 generazioni A-5 e A+5, rispettivamente, dai "reperti fossili" congelati dell'LTEE. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figure 8
Figura 8: Idoneità relativa misurata utilizzando saggi di competizione. Risultati di test di competizione di uno o tre giorni tra gli antenati LTEE e le 20.000 popolazioni LTEE di generazione A-5 e A + 5. Il diagramma a sinistra mostra le quattro competizioni a coppie come frecce a due punte codificate a colori. Ogni combinazione dei due concorrenti Ara− (etichette rosse) e dei due concorrenti Ara+ (etichette nere) è stata testata con una replica di sei volte. I conteggi delle colonie della Tabella 1 sono stati analizzati in R utilizzando il pacchetto fitnessR31 e i risultati sono stati tracciati utilizzando il pacchetto ggplot2 (versione 3.4.0)34. L'idoneità viene visualizzata come il concorrente verso cui sta andando la freccia nell'etichetta rispetto al concorrente da cui proviene la freccia (ad esempio, REL8604 rispetto a REL606). Vengono mostrati i valori di fitness relativi stimati dai conteggi delle colonie per ogni replica del test di competizione (punti), i valori medi di idoneità relativa per la coppia di concorrenti (barre riempite con la stessa codifica a colori del diagramma) e gli intervalli di confidenza del 95% (barre di errore). Non è stato possibile determinare i valori di idoneità relativa (N.D.) per le competizioni di tre giorni tra gli antenati e le popolazioni evolute perché c'erano zero o pochissime colonie degli antenati sulle piastre del Giorno 3 (vedi Tabella 1). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1. File di foglio di calcolo Excel per il calcolo dell'idoneità relativa. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2. Modello di file di input con valori delimitati da virgole per il calcolo dell'idoneità relativa in R utilizzando il pacchetto fitnessR. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Resilienza a lungo termine dell'LTEE e dei suoi metodi
L'E. coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) è ora nel suo quarto decennio. Per un esperimento di evoluzione microbica di qualsiasi durata, è fondamentale mantenere un ambiente riproducibile, evitare la contaminazione, archiviare campioni e misurare accuratamente l'idoneità. L'LTEE dimostra diverse strategie collaudate nel tempo per raggiungere questi obiettivi, incluso l'uso di palloni ben scossi che creano un ambiente omogeneo e un mezzo di crescita chimicamente definito che supporta una bassa densità cellulare. Inoltre, l'LTEE impiega ceppi di antenati che differiscono in un marcatore genetico che fornisce un fenotipo (colore della colonia) che è sia facilmente schermato che selettivamente neutro nell'ambiente evolutivo. Questa caratteristica di progettazione sperimentale fornisce un mezzo per identificare la contaminazione interna ed esterna e facilita la misurazione dell'idoneità. Tuttavia, non tutte le procedure e le salvaguardie che sono state utilizzate dall'LTEE dal 1988 si sono dimostrate ugualmente solide. Alcuni metodi che erano affidabili quando è iniziato l'LTEE sono diventati meno efficaci con l'evoluzione delle popolazioni di E. coli. Fortunatamente, questi metodi problematici possono ora essere aumentati o sostituiti utilizzando tecnologie sviluppate sin dall'inizio dell'esperimento.

Rilevamento della contaminazione
Il rilevamento della contaminazione è fondamentale per l'LTEE. La contaminazione può essere di due tipi: tra popolazioni LTEE (contaminazione incrociata) e con microbi provenienti dall'ambiente (contaminazione esterna). Per la maggior parte, l'uso attento delle tecniche asettiche e la particolare attenzione durante la preparazione dei terreni e i trasferimenti giornalieri prevengono entrambi i tipi di contaminazione, ma si verificano. All'inizio dell'esperimento, la placcatura su agar TA potrebbe essere utilizzata per rilevare casi di contaminazione incrociata perché i trasferimenti si sono sempre alternati tra popolazioni Ara− e Ara+. L'impronta digitale della sensibilità e della resistenza di questi E. coli a determinati batteriofagi era anche intesa come una caratteristica di progettazione che potesse differenziare le popolazioni LTEE dai ceppi di laboratorio di E. coli comunemente usati che potrebbero contaminarli4. Tuttavia, questi marcatori genetici sono diventati inaffidabili man mano che l'esperimento è progredito (ad esempio, alcune popolazioni non formano più colonie su agar TA)10,35. Fortunatamente, le popolazioni si sono geneticamente differenziate poiché hanno sperimentato storie evolutive separate durante l'esperimento, che ha creato nuovi marcatori genetici che ora possono essere utilizzati per rilevare la contaminazione incrociata. Ad esempio, ogni popolazione ha sviluppato una combinazione unica di mutazioni nei geni pykF e nadR 14,36,37. A volte la PCR amplifica e sequenzia Sanger questi due geni per verificare se colonie con morfologie o colori insoliti sono dovute a contaminazione incrociata. Poiché i costi del sequenziamento dell'intero genoma e dell'intera popolazione continuano a diminuire, il sequenziamento di routine delle popolazioni LTEE potrebbe presto essere possibile, presentando così nuove opportunità per monitorarle per i segni di contaminazione.

Misurare la forma fisica competitiva
Un altro caso in cui l'LTEE ha superato i suoi metodi originali è che l'idoneità dell'E. coli evoluto è aumentata nell'ambiente sperimentale a tal punto che non è più possibile misurare direttamente l'idoneità delle popolazioni di oggi rispetto ai loro antenati usando il protocollo qui descritto. Le popolazioni evolute superano gli antenati a tal punto che poche o nessuna colonia di antenati rimane da contare dopo una competizione di un giorno. Un approccio per affrontare questa grande differenza di fitness è quello di utilizzare rapporti iniziali disuguali dei ceppi, ponderando i volumi iniziali che vengono miscelati verso il concorrente meno adatto (ad esempio, 90 μL antenato e 10 μL concorrente evoluto). Un secondo approccio consiste nell'identificare un clone Ara− evoluto che abbia una fitness superiore rispetto all'antenato LTEE, isolare un mutante revertante Ara+ spontaneo di esso mediante selezione su agar MA, e quindi verificare che il ceppo revertante abbia la stessa idoneità del suo genitore utilizzando un test di competizione 6,38. Questa nuova coppia Ara−/Ara+ può quindi essere utilizzata come insieme di ceppi concorrenti comuni al posto di REL606/REL607. Idealmente, il clone evoluto di Ara− scelto come concorrente comune (e il suo revertante Ara+) avrà una forma fisica intermedia rispetto a tutti i ceppi di interesse in un esperimento. Nel corso delle prime 50.000 generazioni di LTEE, questi due approcci (utilizzando rapporti di partenza disuguali o un concorrente comune) non hanno prodotto misurazioni di fitness significativamente diverse rispetto all'approccio tipico39.

Queste modifiche al protocollo sulla concorrenza rendono alcune ipotesi semplificative che potrebbero non essere sempre vere. Uno è che le misurazioni della forma fisica sono transitive. Cioè, se competiamo separatamente due popolazioni contro un ceppo concorrente comune, allora possiamo dedurre l'idoneità relativa delle due popolazioni l'una all'altra. Questa relazione è stata trovata vera per l'LTEE40, per la maggior parte, ma non lo è per altri esperimenti41. Una ragione di questa discrepanza può essere l'evoluzione degli effetti negativi di fitness dipendenti dalla frequenza. Questa situazione si verifica quando ceppi isolati da due diverse linee divergenti dalla popolazione A-2 dell'LTEE sono in competizione l'uno contro l'altro19,42. Ognuno ha un vantaggio quando raro, a causa dell'alimentazione incrociata, che stabilizza la loro coesistenza. I dati di sequenziamento che mostrano la coesistenza a lungo termine di lignaggi con diversi set di mutazioni suggeriscono che interazioni simili potrebbero essere sorte anche in altre popolazioni LTEE14,43, sebbene non sia chiaro se siano abbastanza forti da alterare notevolmente le stime di fitness. Infine, l'evoluzione della crescita aerobica sul citrato nella popolazione A-3 del LTEE32 significa che l'idoneità di queste cellule ora incorpora l'uso di una risorsa "privata" quando sono in competizione con cellule che non possono utilizzare il citrato, il che complica l'interpretazione di questi risultati. Nonostante queste eccezioni, l'uso di una bassa concentrazione di glucosio e di un ambiente ben scosso ha indubbiamente semplificato i confronti di fitness tra ceppi e popolazioni LTEE.

Nelle generazioni successive, alcune delle popolazioni LTEE non formano più colonie su agar TA, il che rende difficile o impossibile eseguire esperimenti di competizione utilizzando protocolli anche modificati10. Metodi alternativi che non richiedono la crescita delle colonie possono potenzialmente essere utilizzati per determinare la rappresentazione relativa di due concorrenti, come FREQ-seq che utilizza il sequenziamento di nuova generazione per contare la proporzione di letture contenenti due alleli alternativi in un amplicone44. Questo metodo o uno simile potrebbe potenzialmente essere usato con gli alleli Ara o con mutazioni di nuova evoluzione, come quelle in pykF e nadR, rispetto alla sequenza ancestrale. L'esecuzione di modifiche genetiche che introducono altri tipi di marcatori neutri può anche essere utilizzata per misurare l'idoneità relativa. Ad esempio, geni proteici fluorescenti sono stati inseriti nei cromosomi delle cellule in esperimenti di propaggine LTEE in modo che i concorrenti possano essere contati utilizzando la citometria a flusso45. Un altro approccio, che apre la possibilità di mescolare insieme più di due ceppi nello stesso pallone da competizione, è quello di inserire codici a barre che possono essere amplificati con PCR e sequenziati nei genomi di diversi concorrenti. Questo approccio è stato utilizzato per tracciare il lignaggio negli esperimenti di evoluzione46. Sia la citometria a flusso che il sequenziamento dei codici a barre possono misurare con precisione rapporti molto più estremi di due ceppi rispetto al conteggio delle colonie (perché possono interrogare > 10.000 cellule / genomi rispetto ai < 500 che possono essere contati su una piastra di agar), quindi l'utilizzo di questi metodi promette anche di aumentare la gamma dinamica in termini di differenze di fitness che possono essere misurate rispetto a un concorrente comune.

Disegni alternativi per esperimenti di evoluzione microbica a lungo termine
Nonostante tutte le sue virtù, l'LTEE non è perfetto. Alcuni aspetti del suo design lo rendono laborioso e suscettibile di errore umano. Ad esempio, ogni giorno un ricercatore deve entrare in laboratorio e pipettare tra le borracce di Erlenmeyer per continuare l'esperimento. Gli esperimenti di competizione possono anche porre ostacoli logistici scoraggianti, dato che i requisiti per la vetreria sterile, i media, lo spazio dell'incubatore e il conteggio delle colonie aumentano rapidamente quando anche un piccolo numero di concorrenti viene testato con una modesta replica. Spesso ci viene chiesto perché non sfruttiamo i sistemi di automazione di laboratorio, come i robot di pipettaggio che operano su micropiastre a 96 pozzetti, o i sistemi di coltura continua, come i chemiostati o i turbidostati. La risposta è semplice: l'LTEE è, in un certo senso, prigioniero della sua stessa lunga storia. Non osiamo deviare da colture da 10 mL che si agitano ad una velocità specifica in boccette Erlenmeyer da 50 mL perché ciò rischierebbe di cambiare radicalmente l'esperimento. Aspetti sottili dell'ambiente a cui queste popolazioni si sono adattate per decenni (ad esempio, la quantità di aerazione), sarebbero alterati in micropiastre o sistemi di coltura continui. Il collo di bottiglia della popolazione ad ogni trasferimento potrebbe anche essere diverso (più piccolo nelle micropiastre, per esempio), cambiando le dinamiche evolutive. In breve, deviare dai metodi qui descritti renderebbe l'LTEE un esperimento diverso, o almeno rischierebbe di introdurre una discontinuità che sconvolgerebbe le traiettorie evolutive.

I ricercatori che progettano nuovi esperimenti di evoluzione dovrebbero prendere in considerazione questi altri modi di propagare le popolazioni microbiche, pur essendo consapevoli dei loro potenziali benefici e svantaggi. L'uso di robot di pipettaggio per trasferire popolazioni in piastre di micropozzetti è logisticamente più semplice in qualche modo e può rivelarsi piuttosto potente a causa dell'elevato numero di popolazioni replicate che possono essere propagate in questo modo47,48,49. Tuttavia, i trasferimenti automatici nella maggior parte delle configurazioni attuali non avvengono in condizioni completamente sterili, il che aumenta la probabilità di contaminazione esterna. Per prevenire la contaminazione, il mezzo di crescita è spesso integrato con antibiotici, che diventano una caratteristica dell'ambiente che influenza l'evoluzione. I trasferimenti nelle piastre dei micropozzetti sono anche più inclini a eventi di contaminazione incrociata. Infine, l'ambiente delle piastre di micropozzetti - in particolare se non sono scosse - tende a selezionare la crescita delle pareti, l'aggregazione e altri fenomeni che possono complicare l'evoluzione creando più nicchie in un pozzo. L'uso di terreni ricchi o alte concentrazioni di sostanze nutritive per mantenere grandi le dimensioni della popolazione in piccoli pozzi rischia di esacerbare queste complessità. Se si verificano tali interazioni, possono rendere molto più difficile misurare e interpretare la forma fisica.

I sistemi di coltura continua per l'evoluzione microbica includono chemiostati, in cui il terreno fresco viene costantemente pompato e la coltura viene pompata fuori, e turbidostati, in cui le colture vengono periodicamente diluite attraverso il rilevamento e il pompaggio automatizzati per mantenere le cellule in uno stato di crescita costante. Questi sistemi sono molto utili quando si vuole modellare la fisiologia e l'evoluzione microbica perché evitano che i microbi passino tra la crescita e la fame mantenendoli in un ambiente che ha sempre nutrienti50. Si possono anche aggiungere sensori che effettuano misurazioni in tempo reale della densità ottica, del consumo di O2, del pH e di altri aspetti dell'ambiente e della crescita di una cultura. Tuttavia, gli attuali sistemi di coltura continua richiedono costosi acquisti di attrezzature o competenze specializzate per costruire configurazioni personalizzate51,52,53,54. Inoltre, la crescita della parete, in cui le cellule sfuggono alla diluizione aderendo alla camera di coltura, tormenta le dinamiche evolutive nei sistemi di coltura continua a meno che non vengano periodicamente sterilizzate. A causa di questi vincoli, la maggior parte degli esperimenti di evoluzione di chemostat e turbidostat fino ad oggi sono stati di durata limitata e/o hanno coinvolto relativamente poche popolazioni che si evolvono in modo indipendente rispetto agli esperimenti di evoluzione a trasferimento seriale.

Conclusione
I metodi che dimostriamo qui per l'LTEE sono fondamentali per studiare il suo record storico unico e continuare l'evoluzione aperta di queste popolazioni di E. coli. Forniscono anche un punto di partenza per altri che stanno prendendo in considerazione nuovi esperimenti di evoluzione che possono trarre vantaggio dall'automazione di laboratorio o aggiungere vari elementi della complessità trovati negli ambienti naturali che sono stati volutamente omessi dall'LTEE. Dal 1988, l'evoluzione sperimentale è fiorita come campo. Durante questo periodo, i ricercatori nei laboratori di tutto il mondo hanno dimostrato l'immensa flessibilità di questo approccio per studiare l'evoluzione, innovando introducendo progetti sperimentali creativi e monitorando i risultati utilizzando nuove tecnologie. I metodi dell'LTEE non rappresentano un punto finale, ma speriamo che continueranno a ispirare e fornire una base per il campo nel futuro.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Acknowledgments

Ringraziamo Richard Lenski e i numerosi ricercatori che hanno studiato e contribuito a mantenere l'esperimento di evoluzione a lungo termine con E. coli, tra cui in particolare Neerja Hajela. L'LTEE è attualmente supportato dalla National Science Foundation (DEB-1951307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich T8877
20 mL Glass Beaker Sigma-Aldrich CLS100020
50 mL Erlenmeyer Flasks Sigma-Aldrich CLS498050
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich AX1385
Antifoam Sigma-Aldrich A5757
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Freezer Box (2") VWR 82007-142
Freezer Box (3") VWR 82007-144
Freezer Box Cell Divider (49-place) VWR 82007-150
Freezer Box Cell Divider (81-place) VWR 82007-154
Freezer Vials (1/2-Dram) VWR  66009-816 
Freezer Vials (2-Dram) VWR  66010-560 
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Fisher Scientific G33
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Metal Tray Winco SPJP-202
Petri Dish Fisher Scientific FB0875712
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P5379
Sodium Chloride Sigma-Aldrich M7506
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate Sigma-Aldrich C7254
Test Tube Cap (18mm) VWR 10200-142
Test Tube Rack (18mm, steel) Adamas-Beta N/A Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm)
Test Tubes (18 x 150 mm) VWR 47729-583
Thiamine, Hydrochloride Millipore 5871
Tryptone Gibco 211705
Yeast Extract Gibco 212750

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References

  1. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  2. Fox, J. W., Lenski, R. E. From here to eternity-the theory and practice of a really long experiment. PLoS Biology. 13 (6), e1002185 (2015).
  3. Daegelen, P., Studier, F. W., Lenski, R. E., Cure, S., Kim, J. F. Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 634-643 (2009).
  4. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12 genomes. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 653-680 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Lenski, R. E. Experimental studies of pleiotropy and epistasis in Escherichia coli. II. Compensation for maladaptive pleiotropic effects associated with resistance to virus T4. Evolution. 42 (3), 425-432 (1988).
  7. Calcott, P. H., Gargett, A. M. Mutagenicity of freezing and thawing. FEMS Microbiology Letters. 10 (2), 151-155 (1981).
  8. Lenski, R. E., Travisano, M. Dynamics of adaptation and diversification: a 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (15), 6808-6814 (1994).
  9. Wiser, M. J., Ribeck, N., Lenski, R. E. Long-term dynamics of adaptation in asexual populations. Science. 342 (6164), New York, N.Y. 1364-1367 (2013).
  10. Lenski, R. E., et al. Sustained fitness gains and variability in fitness trajectories in the long-term evolution experiment with Escherichia coli. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1821), 20152292 (2015).
  11. Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  12. Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
  13. Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
  14. Good, B. H., McDonald, M. J., Barrick, J. E., Lenski, R. E., Desai, M. M. The dynamics of molecular evolution over 60,000 generations. Nature. 551 (7678), 45-50 (2017).
  15. Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980-980 (2021).
  16. Cooper, T. F., Rozen, D. E., Lenski, R. E. Parallel changes in gene expression after 20,000 generations of evolution in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (3), 1072-1077 (2003).
  17. Favate, J. S., Liang, S., Cope, A. L., Yadavalli, S. S., Shah, P. The landscape of transcriptional and translational changes over 22 years of bacterial adaptation. eLife. 11, e81979 (2022).
  18. Khan, A. I., Dinh, D. M., Schneider, D., Lenski, R. E., Cooper, T. F. Negative epistasis between beneficial mutations in an evolving bacterial population. Science. 332 (6034), 1193-1196 (2011).
  19. Plucain, J., et al. Epistasis and allele specificity in the emergence of a stable polymorphism in Escherichia coli. Science. 343 (6177), 1366-1369 (2014).
  20. Quandt, E. M., Deatherage, D. E., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Recursive genomewide recombination and sequencing reveals a key refinement step in the evolution of a metabolic innovation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2217-2222 (2014).
  21. Leon, D., D'Alton, S., Quandt, E. M., Barrick, J. E. Innovation in an E. coli evolution experiment is contingent on maintaining adaptive potential until competition subsides. PLoS Genetics. 14 (4), e1007348 (2018).
  22. Bennett, A. F., Lenski, R. E., Mittler, J. E. Evolutionary adaptation to temperature. I. Fitness responses of Escherichia coli to changes in its thermal environment. Evolution. 46 (1), 16-30 (1992).
  23. Kibota, T. T., Lynch, M. Estimate of the genomic mutation rate deleterious to overall fitness in E. coli. Nature. 381 (6584), 694-696 (1996).
  24. Friesen, M. L., Saxer, G., Travisano, M., Doebeli, M. Experimental evidence for sympatric ecological diversification due to frequency-dependent competition in Escherichia coli. Evolution. 58 (2), 245-260 (2004).
  25. Cooper, T. F. Recombination speeds adaptation by reducing competition between beneficial mutations in populations of Escherichia coli. PLoS Biology. 5 (9), e225 (2007).
  26. Cooper, T. F., Lenski, R. E. Experimental evolution with E. coli in diverse resource environments. I. Fluctuating environments promote divergence of replicate populations. BMC Evolutionary Biology. 10, 11 (2010).
  27. Quan, S., et al. Adaptive evolution of the lactose utilization network in experimentally evolved populations of Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), e1002444 (2012).
  28. Deatherage, D. E., Kepner, J. L., Bennett, A. F., Lenski, R. E., Barrick, J. E. Specificity of genome evolution in experimental populations of Escherichia coli evolved at different temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1904-E1912 (2017).
  29. Izutsu, M., Lake, D. M., Matson, Z. W. D., Dodson, J. P., Lenski, R. E. Effects of periodic bottlenecks on the dynamics of adaptive evolution in microbial populations. BioRixv. , 4457 (2021).
  30. Chavarria-Palma, J. E., Blount, Z. D., Barrick, J. E. LTEE Media Recipes. , (2022).
  31. Barrick, J. E., Lake, D. M. fitnessR: fitnessR-v1.0.0. barricklab. , (2023).
  32. Blount, Z. D., Borland, C. Z., Lenski, R. E. Historical contingency and the evolution of a key innovation in an experimental population of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (23), 7899-7906 (2008).
  33. Grant, N. A., Magid, A. A., Franklin, J., Dufour, Y., Lenski, R. E. Changes in cell size and shape during 50,000 generations of experimental evolution with Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 203 (10), 22 (2021).
  34. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  35. Meyer, J. R., et al. Parallel changes in host resistance to viral infection during 45,000 generations of relaxed selection. Evolution. 64 (10), 3024-3034 (2010).
  36. Woods, R., Schneider, D., Winkworth, C. L., Riley, M. A., Lenski, R. E. Tests of parallel molecular evolution in a long-term experiment with Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (24), 9107-9712 (2006).
  37. Barrick, J. E., Deatherage, D. E., D'Alton, S. LTEE-Ecoli: genomics resources for the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. , Available from: https://github.com/barricklab/LTEE-Ecoli (2022).
  38. Izutsu, M., Lenski, R. E. Experimental test of the contributions of initial variation and new mutations to adaptive evolution in a novel environment. Frontiers in Ecology and Evolution. 10, 958406 (2022).
  39. Wiser, M. J., Lenski, R. E. A comparison of methods to measure fitness in Escherichia coli. PLoS One. 10 (5), 0126210 (2015).
  40. de Visser, J. A. G. M., Lenski, R. E. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. XI. Rejection of non-transitive interactions as cause of declining rate of adaptation. BMC Evolutionary Biology. 2 (1), 19 (2002).
  41. Paquin, C. E., Adams, J. Relative fitness can decrease in evolving asexual populations of S. cerevisiae. Nature. 306 (5941), 368-371 (1983).
  42. Rozen, D. E., Lenski, R. E. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. VIII. Dynamics of a balanced polymorphism. The American Naturalist. 155 (1), 24-35 (2000).
  43. Quandt, E. M., Gollihar, J., Blount, Z. D., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Fine-tuning citrate synthase flux potentiates and refines metabolic innovation in the Lenski evolution experiment. eLife. 4, e09696 (2015).
  44. Chubiz, L. M., Lee, M. -C., Delaney, N. F., Marx, C. J. FREQ-Seq: a rapid, cost-effective, sequencing-based method to determine allele frequencies directly from mixed populations. PLoS One. 7 (10), e47959 (2012).
  45. Gallet, R., Cooper, T. F., Elena, S. F., Lenormand, T. Measuring selection coefficients below 10-3: method, questions, and prospects. Genetics. 190 (1), 175-186 (2012).
  46. Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
  47. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  48. Frenkel, E. M., et al. Crowded growth leads to the spontaneous evolution of semistable coexistence in laboratory yeast populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (36), 11306-11311 (2015).
  49. Jordt, H., et al. Coevolution of host-plasmid pairs facilitates the emergence of novel multidrug resistance. Nature Ecology and Evolution. 4 (6), 863-869 (2020).
  50. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  51. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and use of multiplexed chemostat arrays). Journal of Visualized Experiments. (72), e50262 (2013).
  52. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  53. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  54. Ekkers, D. M., Branco Dos Santos, F., Mallon, C. A., Bruggeman, F., Van Doorn, G. S. The omnistat: A flexible continuous-culture system for prolonged experimental evolution. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 932-942 (2020).

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Genetica Numero 198
Trasferimenti giornalieri, archiviazione delle popolazioni e misurazione dell'idoneità nell'esperimento di evoluzione a lungo termine con <em>Escherichia coli</em>
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Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, D. M., Dwenger, J. H., Chavarria-Palma, J. E., Izutsu, M., Wiser, M. J. Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. J. Vis. Exp. (198), e65342, doi:10.3791/65342 (2023).

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