Articolo metodologico

Un sistema di perfusione normotermica open-source progettato per i ricercatori

DOI:

10.3791/68722

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18 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgical Oncology Program, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Radiology and Imaging Sciences, Department of Interventional Radiology, National Institutes of Health, 4Histopathology and Autopsy Pathology, Laboratory of Pathology, National Institutes of Health, 5Division of Cancer Treatment and Diagnosis, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 6Department of Perioperative Medicine, National Institutes of Health, 7Blood Services Section, Department of Transfusion Medicine, National Institutes of Health, 8Translational Hepatology Section, Liver Disease Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 9Center for Immuno-Oncology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per un sistema di perfusione normotermico ex vivo open source e modificabile, progettato per superare l'alto costo e la limitata flessibilità delle piattaforme esistenti, consentendo un uso più accessibile, economico e iterativo nella ricerca biomedica preclinica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'integrazione di macchine di perfusione ex vivo per organi umani prima del trapianto ha migliorato i risultati per i riceventi e aumentato la disponibilità di organi, rivelando nuove vie di indagine per la medicina traslazionale. Tuttavia, queste macchine hanno una disponibilità limitata per le modifiche sperimentali, pur presentando un significativo investimento iniziale e un costo proibitivo per l'uso per il ricercatore. Inoltre, c'è una significativa necessità di migliorare i modelli preclinici nella ricerca biomedica che consentano un'autentica interrogazione dei processi cellulari nel contesto degli organi multicellulari.

Per fornire l'accesso a una tecnologia simile per la più ampia comunità di ricerca, abbiamo costruito una macchina di perfusione normotermica modulare ed economica interamente con parti di pronta reperibilità eseguite con codice Python modificabile dall'utente. Poiché il sistema è privo di hardware personalizzato, i ricercatori possono costruire e aumentare il sistema come richiesto per applicazioni di ricerca individualizzate.

In questo articolo, descriviamo in dettaglio la configurazione della macchina e il processo di perfusione, trasmettiamo la nostra esperienza con gli organi suini e umani e forniamo i primi risultati sperimentali proof-of-concept. Questi studi dimostrano il potenziale per interrogare la fisiopatologia e i processi cellulari complessi utilizzando tessuti umani intatti.

Introduzione

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Sebbene la perfusione meccanica normotermica di breve durata (<12 ore) sia stata precedentemente impiegata per reni e fegati prima del trapiantodi 1,2,3,4,5, la perfusione epatica normotermica ex vivo prolungata è diventata una realtà nel 2020 con la macchina Liver4Life 6. L'intento di questa tecnologia era orientato verso l'espansione di organi vitali da donatore, ma le possibili applicazioni traslazionali erano immediatamente evidenti alla comunità di ricerca 7,8,9,10,11,12. Per gli scienziati da banco e i laboratori di ricerca convenzionali, questi strumenti clinici sono quasi sicuramente fuori portata a causa dei significativi costi iniziali e ricorrenti12,13. Le macchine per la perfusione normotermica clinica costano fino a $ 250.000 USD, con prodotti monouso che vanno da $ 9.500 a $ 60.000 USD per corsa 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Inoltre, i diritti di proprietà e l'impossibilità di personalizzare la tecnologia esistente rendono le applicazioni scientifiche impegnative.

L'eccezionale necessità di migliorare i modelli preclinici 24,25,26 nella ricerca biomedica, insieme alle limitazioni di cui sopra, ha ispirato la creazione di un sistema di perfusione modificabile open-source (Figura 1). La progettazione e lo sviluppo dei circuiti sono stati guidati dai principi dell'utilizzo dei costi, dei requisiti di spazio in laboratorio e della mobilità per le applicazioni traslazionali. Il sistema può essere costruito per $ 48.000 - $ 66.000 USD e ogni costo di perfusione varia da $ 1.000 a $ 2.300 USD, che è stato ottenuto attraverso l'integrazione di singoli componenti di pronta reperibilità eseguiti da codice scaricabile gratuitamente. Il sistema è stato ottimizzato attraverso un processo iterativo che utilizza sangue suino di donatori e sangue umano espirato, fegati suini e segmenti parziali di fegato umano provenienti dalla sala operatoria (Tabella supplementare 1, Tabella supplementare 2 e Tabella supplementare 3). Gli organi sono alloggiati in una bacinella chiusa che posiziona in modo ottimale il campione per ridurre al minimo la necrosi da pressione, consentire una traiettoria di incannulamento ideale, drenare il deflusso e garantire la normotermia. Il serbatoio ospita circa 2-3 L di perfusato prima di essere indirizzato verso i circuiti di afflusso. L'emodialisi, che è fondamentale per l'omeostasi elettrolitica e l'emoconcentrazione nelle perfusioni epatiche 6,27,28,29, è stata integrata attraverso un circuito laterale con una pompa a rulli indipendente. Le infusioni farmacologiche supportano le funzioni fisiologiche (ad es. nutrizione parenterale totale (TPN), sali biliari, ecc.30), aumentano il tono vascolare (epoprostenolo, fenilefrina), prevengono la coagulazione (enoxaparina) e l'infezione (piperacillina-tazobactam, amfotericina). I parametri fisiologici di perfusione sono garantiti utilizzando sensori in linea in tempo reale per ottenere i valori di gasgas, pressione e flusso nel sangue. Il sistema consente la massima adattabilità dell'utente in modo tale che l'integrazione dei componenti hardware possa avvenire in qualsiasi punto del circuito. Inoltre, ciascuno dei singoli componenti all'interno del circuito può essere intercambiato o modificato per consentire l'adattamento a specifiche domande di ricerca e esigenze sperimentali. Ad esempio, il circuito a doppio afflusso può essere modificato per la perfusione di organi con un singolo afflusso (ad esempio, reni o pancreas) semplicemente rimuovendo il connettore a Y prima delle teste della pompa, e le clavi per infusione/campionamento possono essere installate in qualsiasi punto all'interno del circuito. Inoltre, il sistema viene eseguito con codice Python che consente la perfusione semi-automatica basata su un insieme specifico di parametri di perfusione dettati dall'utente finale (Figura 1 supplementare). Ad esempio, i sensori acquisiscono letture continue di emogasanalisi arteriosa (ABG), pressione e flusso che fungono da input per implementare i comandi di uscita per regolare automaticamente il flusso di gas dell'ossigenatore, la velocità della pompa, ecc. L'interfaccia utente grafica (GUI) consente l'override manuale di questa automazione, se lo si desidera. La personalizzazione del circuito è il suo tratto distintivo, e amplia l'applicabilità complessiva di questo sistema per un'ampia gamma di indagini sperimentali.

L'accesso al sistema nella sua interezza è disponibile gratuitamente (https://github.com/CCR-SOP/OpenSourcePerfusionSystem.git) per incoraggiare la collaborazione e l'innovazione nel tentativo di forgiare nuove profondità di conoscenza in diversi campi della scienza traslazionale.

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Figura 1: Sistema di perfusione open source. (A) Schema del sistema di perfusione open source per la configurazione a doppio afflusso per la perfusione epatica. (B) Rendering tridimensionale (3D) del sistema durante la perfusione d'organo con integrazione del software come dimostrato sugli schermi. (C) Foto della macchina di perfusione durante l'esperimento di perfusione suina. La configurazione esposta nella figura è solo a scopo dimostrativo. Durante la perfusione, il telo riscaldante sterile copre l'organo per mantenere un involucro sterile. Sensore P/F: Sensori di pressione e flusso. HA: Arteria epatica. PV: Vena porta. HV: Vena epatica. BD: Dotto biliare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

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Questo protocollo è stato condotto in conformità con gli standard etici del Comitato Etico per la Ricerca Umana della nostra istituzione e aderisce a tutte le linee guida e i regolamenti applicabili per la ricerca che coinvolge soggetti e tessuti umani.

1. Messa a punto della macchina

  1. Preparazione della tavola
    1. Sterilizzare il tavolo e il carrello mobile con spray alcolico al 70% e strofinare accuratamente. Posizionare il carrello mobile perpendicolarmente al lato sinistro del tavolo. Prima di collegare tutti i tubi e l'hardware in tutto il protocollo, spruzzare con alcol al 70% o in autoclave, se applicabile, per sterilizzare.
      NOTA: Prima di qualsiasi manipolazione o intervento d'organo, utilizzare guanti sterili e spray alcolico per facilitare la sterilità prima e durante la perfusione.
    2. Coprire la postazione di lavoro con teli blu sterili e poi con sottocuscinetti assorbenti.
    3. Fissare il supporto del serbatoio alla gamba del carrello più vicina al banco con l'anello che sporge verso l'esterno, circa 12" sotto la parte inferiore della parte superiore della workstation.
    4. Posizionare l'imbuto del tamburo sul lato destro della postazione di lavoro con un beccuccio che sporge dal bordo anteriore del tavolo. Ritagliare il memory foam circolare per riempire la base del tamburo, lasciando uno spazio di 4 pollici per il deflusso vicino al beccuccio. Posizionare il diaframma sotto la schiuma collegata a un respiratore.
    5. Procurati 2 coperte scalda acqua e posizionale sopra l'inserto in schiuma con il tubo di collegamento orientato in alto a sinistra della coperta. Tagliare i morsetti bianchi dal tubo e inserire una punta Luer maschio da 3/16" in ciascun tubo. Fissare 1 linea di afflusso e 1 di deflusso dalle linee del serbatoio di riscaldamento dell'acqua Y'ed a ciascuna coperta.
    6. Procurati un telo sterile e identifica il quadrato blu centrale. Piegare a metà due volte e tagliare 2 mm dall'angolo della piega per creare un foro di uscita. Posizionare il telo sterile sulla parte superiore del tamburo in modo che il foro tagliato sia in linea con il beccuccio di uscita.
    7. Procurarsi il connettore di uscita stampato in 3D e posizionare il magnete nella scanalatura. Posizionare sotto il telo attraverso il beccuccio di uscita e allineare il foro tagliato al foro nel connettore e nel magnete. Posizionare un secondo magnete allineato con il deflusso per fissare il telo.
    8. Sollevare il telo in eccesso per coprire l'intero imbuto del tamburo e fissarlo con elastici/fascette. Piega il telo in eccesso sopra per creare una barriera sterile. Riposizionare la seconda camicia d'acqua sopra il telo piegato.
    9. Tagliare un pezzo di tubo da 1/4" da ~30" e collegare l'aspetto prossimale al pezzo di uscita dal fondo del beccuccio dell'imbuto del tamburo e l'aspetto distale a una punta di afflusso del serbatoio.
  2. Preparazione della pompa e dell'ossigenatore
    1. Posizionare le pompe sul carrello mobile più vicino al bordo della postazione di lavoro con supporto e due morsetti immediatamente dietro le pompe in modo che i morsetti si trovino 6" sopra le pompe.
    2. Procurarsi 2 teste della pompa e fissarle nelle pompe.
    3. Procurarsi 2 ossigenatori e posizionarli all'interno di morsetti fissati ai supporti in configurazione orizzontale. Orientare gli ossigenatori con l'aletta rivolta verso l'esterno e l'aletta laterale rivolta a destra.
      NOTA: Gli ossigenatori con connettori Luer richiedono una configurazione alternativa con l'etichetta rivolta verso l'esterno e i rebbi interni rivolti verso l'alto.
  3. Preparazione del miscelatore di gas
    1. Tagliare due (2) pezzi da 4' di tubo da 1/8" e inserire un Luer maschio da 1/8" alle estremità di ciascun tubo. Collegare un tubo a ciascun afflusso di gas arterioso e venoso.
    2. Tagliare due (2) pezzi da 2" di tubo da 1/4" e collegare un Luer femmina da 1/4" su un'estremità. Montare ciascuno di questi pezzi di tubo sulle punte in alto a destra di ciascun ossigenatore.
    3. Collegare il tubo di afflusso di gas arterioso e venoso da 1/8" al connettore Luer in alto a destra dei rispettivi ossigenatori.
  4. Preparazione del circuito di emodialisi
    1. Rimuovere tutti i tubi dal kit di emodialisi ad eccezione di quelli che portano direttamente al filtro (linee blu, rossa, verde e gialla). Fissare il filtro sul pannello forato sul retro della postazione di lavoro, ~12" a destra delle pompe o in linea con il serbatoio.
    2. Posizionare 1 pompa a rullo grande immediatamente a destra del filtro per l'afflusso di sangue. Posizionare 2 pompe peristaltiche più piccole a destra della pompa a rullo del sangue.
      1. Procurarsi due (2) tubi peristaltici da 1/8e posizionarli all'interno della pompa bianca clamp. Collegare due (2) punte Luer femmina da 1/8a ciascuna estremità di ciascun tubo.
    3. Appendere una sacca da 5 L di dialisato sul lato destro della postazione di lavoro.
      1. Collegare la sacca per dialisato all'afflusso del filtro per emodialisi collegando un tubo da 1/8al connettore Luer della sacca. Collegare il Luer maschio da 1/8 all'estremità di questo tubo e collegarlo al tubo della pompa peristaltica di afflusso.
    4. Afflusso/deflusso del dializzato: Ottenere un tubo da 3 1/8con ciascuna estremità dotata di un Luer maschio da 1/8di secondo .
      1. Afflusso: collegare l'estremità prossimale all'aspetto distale del tubo della pompa e l'estremità distale al tubo di afflusso giallo (con 1/8 di Luer femmina) al filtro per emodialisi.
      2. Deflusso: collegare l'estremità prossimale al tubo di deflusso verde (con 1/8 di Luer femmina) e l'estremità distale al tubo della pompa peristaltica di deflusso. Collegare il tubo da 1/8 all'aspetto distale della pompa peristaltica e scaricarlo nel sacchetto dei rifiuti tramite connettori Luer.
  5. Creazione di circuiti prossimali
    1. Posizionare il serbatoio all'interno del supporto del serbatoio con i numeri esterni e il connettore con cappuccio giallo orientato verso l'esterno.
    2. Tagliare ~36" di tubi da 5/16" e collegare l'estremità prossimale al picchetto di deflusso sul fondo del serbatoio. Collegare il connettore a Y da 5/16" all'estremità distale di questo tubo.
    3. Tagliare due (2) lunghezze da 4" del tubo da 5/16" e collegarle all'estremità del connettore a Y. Fissare ciascuna delle estremità di questi tubi da 4" sul polo orizzontale di ciascuna delle teste della pompa.
    4. Tagliare due (2) lunghezze da 4" di tubi da 1/4" e collegarne 1 a ciascuna delle punte verticali delle teste della pompa. Collegare l'aspetto distale al polo inferiore sinistro di ciascun ossigenatore.
    5. Tagliare due (2) lunghezze da 2" di tubo da 1/4" e collegare un Luer femmina a un'estremità. Aggiungere un tappo Luer maschio e fissarlo al polo inferiore destro di ciascun ossigenatore.
  6. Creazione di circuiti venosi
    1. Tagliare un (1) tubo da 30" di lunghezza da 5/16" e collegare l'estremità prossimale alla punta di deflusso (destra) dell'ossigenatore venoso. Tagliare a metà e posizionare un connettore a Y da 5/16" sull'estremità del taglio distale. Ricollegare l'altra metà alla punta superiore del connettore a Y.
    2. Circuito di campionamento laterale: Tagliare un (1) pezzo da 2" di tubo da 1/4" e allungare l'estremità prossimale utilizzando un cacciavite ad ago. Collegarlo all'altra punta del connettore a Y da 5/16".
      1. Procurarsi un sensore per cuvette. Collegare il lato spinato al tubo da 2" collegato al connettore a Y. Tagliare 1-2" di tubo della cuvetta distale e collegarlo al Luer maschio da 1/4". Collegare all'estremità prossimale del sensore di shunt una volta calibrato e, sull'aspetto distale, collegare il Luer maschio da 1/8" al tubo da 1/8".
      2. Collegare l'aspetto orizzontale del connettore a T femmina al tubo da 1/8" e al Luer maschio. All'aspetto perpendicolare, collegare una clave di campionamento. Collegare un Luer maschio da 1/8" all'aspetto orizzontale rimanente del connettore a T.
      3. Tagliare 12" di tubo da 1/8", collegare l'estremità prossimale alla clave di campionamento e collegare un Luer maschio da 1/8" all'estremità distale. Collegarlo a un altro connettore a T femmina. Su un lato del connettore a T femmina, collegare un Luer maschio da 1/4" e collegarlo a un canale di afflusso utilizzando un tubo da 2" da 1/4".
    3. Ritornare all'estremità distale del tubo da 5/16" e collegare un altro connettore a Y da 5/16". Procurarsi ~55" di tubo da 1/4" e collegarlo all'estremità superiore del connettore a Y da 5/16".
    4. Creazione del circuito sanguigno per emodialisi: collegare un Luer maschio da 1/4" all'estremità distale del tubo da 1/4". Posizionare il tubo attraverso la grande pompa a rulli. Collegare all'afflusso di sangue nella parte superiore del filtro per emodialisi (tubo con rivestimento blu).
      1. Tagliare un (1) pezzo da 24" di tubo da 1/4" e collegare un Luer maschio da 1/4" all'aspetto prossimale. Collegare questo tubo al filtro per emodialisi di deflusso del sangue (tubo con linea rossa). Collegare l'aspetto distale a una punta di afflusso del serbatoio.
    5. Ritorno per completare il circuito di afflusso venoso che porta al campione. Tagliare un (1) pezzo da 36" di tubo da 1/4" e allungarlo per adattarlo all'aletta del connettore a Y da 5/16".
    6. Sito di infusione del farmaco: Procurati 3 rubinetti a quattro vie e collegali linearmente. Collegare questo pezzo al braccio perpendicolare di un connettore a T femmina. Ai bracci in linea del connettore a T femmina, collegare due Luer maschio da 1/4". Inserire il pezzo da 12" dall'aspetto sinistro del tubo.
    7. Collegare i sensori di flusso esterni al tubo da 1/4" dopo il sito di infusione del farmaco. Ottenere un supporto da 1 9" e fissarlo a livello dell'imbuto del tamburo. Praticare un taglio di 2" distale all'estremità dei sensori di flusso e inserire i sensori di pressione con le punte nel tubo da 1/4". Posizionare l'aspetto distale del tubo al centro dell'imbuto del tamburo. Riservare un (1) Luer maschio da 1/4" per l'incannulamento venoso nel campione.
  7. Creazione di circuiti arteriosi
    1. Tagliare un altro pezzo da ~30" di tubo da 5/16" e collegare l'estremità prossimale della punta di deflusso destra dell'ossigenatore arterioso. Tagliare questo tubo a circa metà e collegare un connettore a Y da 1 5/16".
    2. Circuito di campionamento laterale: creare un circuito di campionamento laterale duplicato come descritto al punto 1.6.2 e collegarlo all'aspetto inferiore del connettore Y, omettendo la cuvetta. Al termine, collegare il deflusso da 1/8" Luer al connettore a T.
    3. Tagliare un (1) pezzo da 36" di tubo da 1/4" e inserirlo sull'aletta del connettore a Y da 5/16".
    4. Ripetere il passaggio 1.6.7. Riservare un (1) Luer maschio da 1/4" per l'incannulamento arterioso nel campione.
  8. Creazione di deflusso venoso
    1. Tagliare ~30" di tubo da 1/4" e collegare 1 Luer maschio da 1/4" all'estremità prossimale per attaccarlo al deflusso della vena cava inferiore (IVC) del campione. Fissare l'estremità distale a una delle punte di afflusso del serbatoio.
    2. Tagliare questo tubo ~6" dal serbatoio e collegare 2 Luer maschio da 1/4" a ciascuna estremità. Inserire una T femmina con una clave attaccata all'aspetto perpendicolare per il campionamento.
  9. Introdurre il perfusato nel circuito come descritto al punto 4. Riscaldare e collegare il campione come descritto al punto 6.1.4. o il passaggio 6.2.4. e iniziare la perfusione.

2. Calibrazione del sensore CDI

  1. Assicurarsi che le bombole del gas del calibratore siano piene e installate secondo il manuale operativo dell'utente e che il monitor sia impostato sulla modalità di calibrazione. Calibrare secondo le istruzioni del produttore.
  2. Una volta completata la calibrazione, scollegare l'apparato sensore-cavo-testa dal monitor e integrarlo immediatamente nei rispettivi circuiti laterali venoso e arterioso. Le connessioni Luer vengono create nei passaggi 1.6.2 e 1.7.2.

3. Avvio del codice

  1. Scarica, installa e apri il codice Python disponibile nel repository GitHub. Garantire la corretta installazione dei software Python e PyCharm.
  2. Crea un ramo univoco per ogni ciclo di perfusione per una registrazione accurata dei dati. Una volta avviata, verrà visualizzata una GUI con due finestre. Orienta una finestra per display per un facile controllo dell'hardware e la visualizzazione dei parametri di perfusione.
  3. Regolare manualmente i parametri di perfusione o automatizzare la perfusione tramite i rispettivi pulsanti visualizzati sulla GUI (Figura 1 supplementare).

4. Creazione del perfusato e priming del sistema

  1. Innescare il circuito circa 2 ore prima della perfusione d'organo per consentire la correzione di squilibri metabolici/elettrolitici, il riscaldamento alla normotermia e la somministrazione di anticoagulanti, antibiotici e altri farmaci.
  2. Perfusato di maiale
    1. Prelevare 2 L di sangue suino intero di tipo OO e introdurlo nel serbatoio drenandolo attraverso una siringa aperta da 50-100 ml. Prelevare circa 1 ml di sangue intero e misurare il pH, gli elettroliti e l'ematocrito al basale su una macchina point-of-care.
    2. Somministrare aliquote di bicarbonato di sodio all'8,4% se necessario per contrastare l'acidità dovuta ai conservanti del sangue freddo. Avviare l'emodialisi per normalizzare l'iperkaliemia e l'acidemia lattica, se necessario, e titolare alla concentrazione di ematocrito desiderata. Regolare il flusso di gas per titolarlo ai livelli fisiologici di pO2 e pCO2.
    3. Somministrare i farmaci come descritto di seguito (sezione 5).
    4. Conservare il sangue intero di tipo OO da 1-2 L per i boli intermittenti, se necessario, per mantenere l'ematocrito a ~30-40% durante l'esperimento di perfusione.
  3. Perfusato umano
    1. Ottenere emoderivati di tipo corrispondente da una banca del sangue (quasi scaduti o donati per scopi di ricerca).
      NOTA: Per ogni esperimento di perfusione sono necessarie circa 4 unità ciascuno di globuli rossi concentrati (RBC) e plasma.
    2. Lavare i pRBC per rimuovere i conservanti e normalizzare gli squilibri elettrolitici dal pellet di globuli rossi prima dell'adescamento. Lavare i globuli rossi due volte.
      1. Lavaggio con globuli rossi: Mettere i globuli rossi e lo 0,9% di NaCl in un rapporto 1:1 in una provetta da centrifuga. Centrifugare a 1300 × g per 15 min. Rimuovere il surnatante con una pipetta e somministrare NaCl fresco allo 0,9% in rapporto 1:1 al pellet di globuli rossi. Centrifugare nuovamente come sopra e rimuovere il 2° surnatante per il pellet RBC lavato finale.
    3. Introdurre i pellet di globuli rossi lavati nel serbatoio utilizzando una siringa aperta da 50-100 ml. Metti 4 unità di plasma nel serbatoio e inizia la circolazione.
    4. Iniziare la dialisi, riscaldare le coperte e l'afflusso di gas una volta che il perfusato è in circolazione.
    5. Campionare il perfusato e applicare gli interventi farmacologici necessari per garantire livelli di perfusato il più possibile fisiologici prima della perfusione d'organo.
    6. Lavare e introdurre ulteriori pellet di pRBC lavati e titolare lo stato del volume attraverso l'emodialisi, se necessario, per mantenere i livelli di ematocrito del 30-40%.

5. Intervento farmacologico e preparazione dell'infusione

  1. Somministrazione di antibiotici e antimicotici
    1. Combinare due flaconcini da 2,5 g di piperacillina/tazobactam in una coppa sterile con 40 mL di soluzione fisiologica sterile. Aggiungere 10 ml al serbatoio come "antibiotico primo".
      1. Diluire la miscela rimanente con 60 mL di soluzione fisiologica sterile e dividerla in due siringhe da 50 mL. Collegare una siringa a una pompa a siringa e programmare in modo da erogare continuamente 41 μl/min al sito di infusione del farmaco nella vena porta (passaggio 1.6.6).
      2. Conservare l'antibiotico rimanente in frigorifero a 4 °C.
    2. Ricostituire un flaconcino da 50 mg di amfotericina con 10 mL di acqua sterile.
      1. Aspirare 1 mL di amfotericina concentrata e combinarla con 9 mL di soluzione fisiologica sterile. Somministrare la miscela da 10 ml al serbatoio per fungere da "primo antimicotico" all'inizio della perfusione.
      2. Somministrare 1 mL di amfotericina concentrata ogni 12 ore al serbatoio.
  2. Anticoagulazione
    1. Combinare 1 mL (100 mg) di enoxaparina con 49 mL di soluzione fisiologica sterile. Somministrare una miscela di 5 ml per litro di perfusato all'inizio della perfusione per un "primo anticoagulante".
      1. Conservare la restante soluzione di enoxaparina in frigorifero a 4 °C.
      2. Somministrare la soluzione di enoxaparina (5 mL/1 L perfusato) ogni 12 ore nel serbatoio.
  3. Steroidi
    1. Ricostituire 1 g di metilprednisolone con 20 mL di acqua sterile.
    2. Innescare il sistema secondo le specifiche di dosaggio prima dell'inizio della perfusione: i fegati suini ricevono 10 ml (500 mg) di metilprednisolone. I fegati umani parziali ricevono 2 mL (100 mg) di solumedrol.
    3. Diluire la miscela rimanente con 40 mL di soluzione fisiologica in una siringa da 50 mL e metterla in una pompa-siringa per erogare continuamente 33 μL/min al sito di infusione del farmaco della vena porta (passaggio 1.6.6).
  4. Nutrizione parenterale e sali biliari
    1. Ricostituire 1,7 g di acido taurocolico con 50 mL di aminoacido al 10% + componente di nutrizione parenterale concentrato di elettroliti di TPN (non miscelato con destrosio) in una coppa per campioni sterile. Aspirare in una siringa da 50 ml e inserirla in una pompa a siringa per erogare continuamente 83 μl/min al sito di infusione del farmaco nella vena porta (passaggio 1.6.6).
  5. Controllo del tono vascolare
    1. Vasodilatazione: ricostituire 0,5 mg di epoprostenolo con 50 ml di soluzione fisiologica sterile in una tazza sterile e metterli in una siringa da 50 ml. Metterlo in una pompa a siringa e collegarlo alla clave prossimalmente al sensore di flusso dell'arteria epatica.
      1. Bolo o infusione continua (10 μL/min) secondo necessità per raggiungere la pressione arteriosa media desiderata e/o per contrastare il vasospasmo.
    2. Vasocostrizione: Diluire 5 ml (50 mg) di fenilefrina con 45 ml di soluzione fisiologica sterile in una tazza sterile e metterli in una siringa da 50 ml. Conservare la miscela in frigorifero a 4 °C e in bolo secondo necessità per mantenere la pressione arteriosa media desiderata.
      NOTA: Questo è raramente richiesto e la ricostituzione può essere omessa e implementata solo se necessario.
  6. Taratura del sensore di pressione e flusso
    1. Calibrazione della pressione: Calibrare i sensori di pressione senza flusso perfusi. Azzera i sensori se la lettura della pressione è diversa da zero visualizzata secondo le istruzioni del produttore mentre l'estremità del tubo è aperta all'aria per una pressione di 0 mmHg. Garantire misurazioni corrette della pressione ostruendo delicatamente sia l'estremità prossimale che quella distale del tubo per produrre pressioni elevate.
    2. Calibrazione del flusso: calibrare una volta che il circuito sta circolando in perfusato prima della perfusione dell'organo per garantire una misurazione accurata. Clamp tubo distale ai sensori di flusso per interrompere il flusso. Azzera nuovamente i sensori di flusso se la portata è diversa da zero visualizzata secondo le istruzioni del produttore. Sganciare il tubo per consentire la portata e una misurazione accurata del flusso.

6. Approvvigionamento epatico

  1. Approvvigionamento suino
    NOTA: I fegati suini vengono acquistati da una macelleria locale in conformità con i protocolli USDA sulla gestione umana del bestiame. La dissezione è guidata dal team di ricerca per includere la vena cava infra e sopraepatica e il dotto biliare.
    1. Sterilizzare il fegato con iodio diluito in soluzione fisiologica sterile e metterlo in una bacinella sterile su ghiaccio. Identificare la vena porta, l'arteria epatica, la vena cava superiore e il dotto biliare comune, incannulare e fissare con fascette di seta 4-0.
      NOTA: Il dotto biliare è spesso incannulato con un angiocatetere fenestrato a causa del suo piccolo diametro e per prevenire l'ostruzione biliare dei sistemi biliari suini varianti.
    2. Lavare la vena porta cannulata e l'arteria epatica con 3 L di soluzione fisiologica sterile fredda (2 L PV:1 L HA) seguiti da 1 L di soluzione fredda per la conservazione degli organi (750 mL PV:250 mL HA). Immergere il fegato nella soluzione fredda per la conservazione degli organi con ghiaccio per il trasporto.
    3. Adescare il sistema come descritto sopra (passaggio 4.1) fino a quando i parametri fisiologici non sono soddisfatti.
    4. Immergere il fegato cannulato in soluzione fisiologica sterile riscaldata per un rapido riscaldamento e la rimozione di eventuali emboli d'aria. Collegare l'apposito tubo di afflusso alla vena porta e alle cannule dell'arteria epatica. Velocità della pompa per valori fisiologici di flusso e pressione.
    5. Collegare la cannula della vena cava al tubo di deflusso per facilitare il deflusso verso il serbatoio per completare il circuito.
    6. Drenare la cistifellea dalla bile residua prima di collegare il tubo della siringa alla cannula del dotto biliare e una fiala conica per la raccolta.
  2. Approvvigionamento umano
    1. Adescare il sistema come descritto sopra (passaggio 4.1).
    2. Ottenere campioni umani dopo le resezioni oncologiche standard di cura indicate. Misurare le portate in vivo mediante ultrasuoni intraoperatori per la calibrazione sul sistema ex vivo . Identificare la vena porta segmentale, l'arteria epatica e il dotto biliare durante la dissezione chirurgica. Sezionare la triade con la tecnica chirurgica standard e consegnare il campione del campo chirurgico al tavolo posteriore sterile.
    3. Identificare e incannulare la vena porta segmentale, l'arteria epatica, la vena epatica e il dotto biliare, fissarli con fascette di seta 4-0 o sutura in prolene.
      NOTA: Omettere l'incannulamento in uscita se il segmento non ha una vena di efflusso dominante per evitare l'epatopatia congestizia. Il deflusso del bacino funge quindi da tubo di deflusso della vena epatica/IVC.
    4. Tornare al laboratorio ex vivo e pesare il campione. Immergere il campione in soluzione fisiologica sterile riscaldata e collegare i rispettivi tubi di afflusso/uscita. Collegare la cannula del dotto biliare al tubo della siringa per il drenaggio nella fiala conica.
    5. Avviare la perfusione e titolare il flusso della pompa per i parametri di perfusione di flusso e pressione desiderati.

7. Titolazione dei parametri di perfusione

  1. Campionare il perfusato da clavi pre-epatiche (circuiti lato HA e PV) e post-epatiche (IVC o deflusso del bacino) in numerosi punti temporali per la titolazione dei parametri di perfusione in base ai valori di emogasanalisi, elettroliti, ematocrito ed emoglobina del punto di cura.
  2. Calibrare i sensori CDI durante la perfusione utilizzando le analisi manuali dei campioni.
  3. Regolare di conseguenza l'afflusso e il deflusso dell'emodialisi per mantenere lo stato del volume e la concentrazione di ematocrito del 30-40% e correggere eventuali squilibri metabolici ed elettrolitici.
  4. Dosare manualmente le aliquote di destrosio al 5%, acqua libera, bicarbonato di sodio all'8,4% e NaCl allo 0,9% secondo necessità per correggere le anomalie elettrolitiche.

8. Varianti del circuito di perfusione

  1. Adattamento dei trasporti
    1. Collegare le pompe a una fonte di alimentazione mobile per tutta la durata della corsa per facilitare la perfusione continua durante il percorso verso la macchina di imaging. Collegare la fonte di alimentazione mobile alla presa CA per caricare la batteria esterna durante la perfusione.
    2. Scollegare la fonte di alimentazione mobile dalla presa CA a muro una volta concluso l'esperimento di perfusione.
    3. Scollegare l'afflusso di gas agli ossigenatori. Clamp il circuito laterale dell'emodialisi e scollegare l'afflusso di sangue al filtro. Arrestare le pompe del dializzato.
    4. Rimuovere i sensori di flusso dal tubo di afflusso. Scollegare le infusioni di farmaci e chiudere i rubinetti. Scollegare i sensori di pressione dalla spina di ingresso/uscita.
    5. Spostare con cautela l'imbuto del tamburo e il tubo sul carrello mobile, che ora è un'unità indipendente e può essere trasportato alla suite di imaging.

Risultati

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Corse suine rappresentative
I fegati interi di suino sono stati ottenuti da un macellaio locale per l'efficienza dei costi e perfusi per varie fasi di ottimizzazione e test dello sviluppo della macchina (Tabella supplementare 1). Qui vengono valutate le prime 24 ore di tre esecuzioni epatiche rappresentative (Figura 2). La pressione arteriosa epatica media è stata di 80 mmHg ± 11 mmHg e la pressione venosa portale media è stata di 7,1 mmHg ± 3,3 mmHg con flussi di 107 mL/min ± 102 mL/min e 501 mL/min ± 329 mL/min, rispettivamente. Le grandi deviazioni standard per la pressione e i flussi sono correlate alla grande differenza nelle dimensioni del fegato, con suini che vanno da 50 libbre a 350 libbre. I circuiti a doppio afflusso consentono differenziali fisiologici di ossigeno con una saturazione arteriosa media (SO2) del 95 ± del 7,4% rispettoalla SO venosa portale media 2 di 85 ± 13% (p < 0,001). Il deflusso di SO2 dalle vene epatiche era del 74-±18%, indicativo del consumo di ossigeno (p < 0,01), e le misurazioni del pH periferico erano all'interno di intervalli fisiologici a 7,2 ± 0,09. Ulteriori parametri fisiologici come l'emoglobina totale (9 ± 2,5 g/dL), i livelli di ematocrito (28,3 ± 6,4%), il livello di glucosio (477 ± 15 mg/dL) e le variazioni del lattato (3,0 ± 2,5 mmol) e del potassio (-0,77 ± 2,3 mmol) sono stati monitorati durante la perfusione mediante campionamento a intervalli regolari. Per le perfusioni suine, la produzione di bile era indicativa della vitalità degli organi. La cistifellea è stata drenata manualmente una volta che l'organo è diventato normotermico e il dotto biliare comune è stato collegato a un piccolo tubo per la raccolta. La produzione totale di bile durante la perfusione è stata di 41 ± 6,9 mL totali, con un tasso di 6,9 ± 4,0 mL/h.

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Figura 2: Metriche del perfusato durante la perfusione epatica suina (n = 3). (A) Tassi medi di afflusso di sangue (mL/min) dell'arteria epatica e della vena porta nel tempo. (B) Pressioni medie di afflusso nel sangue (mmHg) dell'arteria epatica e della vena porta nel tempo. (C) Confronto della percentuale di saturazione di O2 dei globuli rossi tra l'arteria epatica, la vena porta e la vena cava inferiore, dimostrando la differenza di ossigeno tra il doppio afflusso e il consumo di ossigeno nel deflusso. Sono state determinate differenze statisticamente significative tra la saturazione della vena porta e delle arterie (p < 0,0001), le saturazioni della vena porta e dell'IVC (p < 0,01) e le saturazioni arteriose e IVC (p < 0,0001). (D) Valutazione del pH del sangue tra l'arteria epatica, la vena porta e la vena cava inferiore. (E) Livelli di ematocrito (%) ed emoglobina (g/dL) durante la perfusione, oltre alla variazione del potassio PV (mmol) (in basso) come marcatore di emolisi. (F) Livelli di glucosio nel serbatoio che riflettono il glucosio medio del circuito (mg/dL) durante la perfusione. (G) Variazione del livello di lattato (mg/dL) durante la perfusione rispetto ai valori di lattato al tempo 0 nell'afflusso dell'arteria epatica, nel deflusso IVC e nel perfusato del sistema. (H) Produzione di bile (mL) nel tempo durante la perfusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Corse umane rappresentative
Tre segmenti epatici umani portatori di tumore sono stati perfusi, con un tempo di durata della perfusione compreso tra 48 e 72 ore, a seconda dei requisiti dell'esperimento (Figura 3). Per confrontare i dati tra le esecuzioni rappresentative dell'applicazione, abbiamo valutato le prime 48 ore di valori biochimici. Perfusione approssimata ai parametri in vivo con afflusso venoso portale continuo a bassa pressione e ad alto volume e afflusso arterioso pulsatile ad alta pressione e basso volume, che vengono visualizzati in tempo reale per consentire una facile titolazione. Se il fegato non raggiungeva valori biochimici fisiologici entro due ore dalla perfusione, l'esperimento veniva interrotto. Per le perfusioni epatiche riuscite, la pressione arteriosa epatica media è stata di 84 mmHg ± 11 mmHg e la pressione venosa portale media è stata di 9 mmHg ± 4 mmHg con flussi di 113 mL/min ± 66 mL/min e 317 mL/min ± 302 mL/min, rispettivamente. I circuiti a doppio afflusso consentono differenziali fisiologici di ossigeno con una saturazione arteriosa media (SO2) del 98% ± 3% rispettoalla SO venosa portale media 2 del 92% ± del 7% (p < 0,0001). L'SO2 del deflusso dalle vene epatiche era dell'86% ± del 9%, indicativo del consumo di ossigeno (p < 0,0001), e le misurazioni del pH in tutto il sistema erano all'interno di intervalli fisiologici tra 7,3 ± 0,09. Ulteriori parametri fisiologici come l'emoglobina totale (10,2 g/dL ± 1,6 g/dL), i livelli di ematocrito (30,2% ± 5,5%), il livello di glucosio (170 mg/dL ± 68 mg/dL) e le variazioni del lattato (3,6 mmol/L ± 2,2 mmol/L) sono stati monitorati durante la perfusione mediante campionamento a intervalli regolari. In una corsa rappresentativa, è stata prodotta una media di 1,4 mL/h di bile. Prima e al termine degli esperimenti di perfusione, sono state ottenute biopsie per l'analisi dei tessuti. Sezioni di tessuto rappresentative mostrano parenchima epatico, tumore neuroendocrino metastatico e adenocarcinoma colorettale metastatico dopo perfusione.

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Figura 3: Perfusato e metriche tissutali durante la perfusione di segmenti epatici umani (n = 3). (A) Tasso medio di afflusso di perfusato (mL/min) per l'arteria epatica e la vena porta. (B) Pressione media di afflusso del perfusato (mmHg) per l'arteria epatica e la vena porta nel tempo. (C) Saturazione di ossigeno dei globuli rossi (%) per l'arteria epatica in entrata, la vena porta in ingresso e la vena epatica in uscita. Sono state determinate differenze statisticamente significative tra la saturazione della vena porta e delle arterie (p < 0,0001), le saturazioni della vena porta e dell'IVC (p < 0,0001) e le saturazioni arteriose e IVC (p < 0,0001). (D) pH perfusato per l'arteria epatica in entrata, la vena porta in afflusso e la vena epatica in uscita. (E) Metriche dei globuli rossi durante la perfusione, inclusi i livelli medi di ematocrito (%) e di emoglobina (g/dL) perfusato (in alto) con variazione del potassio perfusato (mmol) rispetto al basale nel tempo (in basso). (F) Concentrazione media di glucosio (mg/dL) per l'arteria epatica in entrata, la vena porta in entrata e la vena epatica in uscita nel tempo. (G) Variazione della concentrazione di lattato di perfusato (mg/dL) rispetto al basale nel tempo per l'arteria epatica in entrata, la vena epatica in efflusso e il perfusato sistemico. (H) Produzione di bile (mL) nel tempo. (I) Segmenti di fegato umano (Couinaud II-IV) durante (a sinistra) e dopo la perfusione (a destra) che dimostrano l'assenza di necrosi da pressione dopo l'ottimizzazione del sistema. Area superficiale di cauterizzazione presente nella parte superiore dell'immagine a sinistra a causa dell'emostasi intraoperatoria. (J) Sezione di tessuto post-perfusione che dimostra il parenchima epatico (colorazione di ematossilina ed eosina, 10x, riquadro 40x; barra della scala 50 μM). (K) Sezione di tessuto post-perfusione che dimostra un tumore neuroendocrino metastatico (colorazione di ematossilina ed eosina, 10x, inserto 40x; barra della scala 250 μM). (L) Sezione di tessuto post-perfusione che dimostra adenocarcinoma colorettale metastatico (colorazione di ematossilina ed eosina, 10x, riquadro 40x; barra della scala 50 μM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Applicazione rappresentativa: imaging TC di campioni perfusi
La capacità di integrare fonti di dati clinici come la tomografia computerizzata (TC) o la risonanza magnetica (RM) con la patologia è un fattore di miglioramento della diagnostica e della medicina personalizzate. Tuttavia, i referti patologici sono risultati riassuntivi e l'eterogeneità inerente ai tumori solidi supera di gran lunga le capacità umane di delineazione. Una potenziale soluzione consiste nell'eseguire l'imaging ex vivo seguito da una preparazione immediata di sezioni di tessuto su macroscala per consentire l'integrazione radiomica di dati cellulari spazialmente preservabili (ad esempio, trascrittomica spaziale, immunofluorescenza altamente multiplex). Per ospitare l'imaging convenzionale sul sistema, è stata costruita una configurazione mobile, che include il passaggio delle pompe a una fonte di batteria esterna per fornire energia ininterrotta durante il trasporto e l'imaging (Figura 4A). Con il fegato sul tavolo TC, è stato somministrato il contrasto iodato e sono state ottenute immagini che dimostrano caratteristiche radiografiche coerenti con quelle acquisite in vivo (Figura 4B).

Applicazione rappresentativa: Perfusione renale e pancreatica
Innato nel suo design, il sistema è adattabile alla perfusione di organi aggiuntivi (Figura 4C-F), il che ovvia alla necessità di un doppio afflusso e quindi riduce i costi per uso. Per dimostrarlo, abbiamo rimosso il circuito venoso portale per un singolo afflusso arterioso (Figura 2 supplementare) e perfuso un rene umano (Figura 4C) e un pancreas parziale umano (Figura 4E). Sezioni di tessuto rappresentative dopo la perfusione mostrano glomeruli (Figura 4D) e Isole di Langerhans (Figura 4F).

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Figura 4: Applicazione rappresentativa delle macchine per perfusione: imaging TC e modularità d'organo. (A) Adattamento mobile del sistema per il trasporto. (B) Immagini TC rappresentative del fegato con tumore dopo somministrazione di contrasto iodato in vivo (in alto) ed ex vivo dopo perfusione (in basso). (C) Perfusione renale umana sulla macchina riconfigurata per singolo afflusso. (D) La sezione di tessuto post-perfusione mostra i glomeruli renali e i dotti collettori (colorazione con ematossilina ed eosina, 8x; barra graduata 250 μm). (E) Perfusione del pancreas distale umano sulla macchina riconfigurata per singolo afflusso. (F) La sezione di tessuto post-perfusione mostra le isole pancreatiche (colorazione con ematossilina ed eosina, 8x; barra graduata 250 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Impostazioni del codice Python per facilitare la perfusione semi-automatica. Schema che illustra i parametri di input e output utilizzati dal codice che consente la semi-automazione con l'aggiunta di regolazioni manuali comunemente impiegate (Tabella). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Schema a singolo afflusso utilizzato per la perfusione di rene e pancreas. Sensore P/F: Sensori di pressione e flusso. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Ottimizzazione dei globuli rossi. (A) L'esperimento di perfusione del solo sangue ha dimostrato un'emolisi significativamente inferiore in condizioni di basso numero di giri rispetto a condizioni di alto numero di giri (p < 0,01) utilizzando l'emoglobina libera dal plasma come surrogato per la lisi cellulare. (B) Il confronto qualitativo dell'emolisi plasmatica nel tempo dimostra visivamente una minore emolisi negli stati a basso numero di giri rispetto agli stati ad alto numero di giri. (C-F) Valutazione dell'emolisi in sistemi con diversi livelli di resistenza e integrazione del bacino con surrogati del plasma: (C) È stata determinata una differenza significativa nei livelli di lattato tra la configurazione del circuito parallelo e la configurazione chiusa e del bacino (p < 0,0001 e p < 0,0001, rispettivamente). (D) È stata determinata una differenza significativa nei livelli di potassio tra l'impostazione del circuito in parallelo e la configurazione in serie chiusa e in serie con bacino (p < 0,0001 e p < 0,0001, rispettivamente). (E) È stata determinata una differenza significativa nei livelli di ematocrito tra l'impostazione del circuito in parallelo e la configurazione in serie chiusa e in serie con bacino (p < 0,0001 e p < 0,0001, rispettivamente). (F) È stata determinata una differenza significativa nei livelli di emoglobina tra l'impostazione del circuito parallelo e la configurazione in serie chiusa e in serie con bacino (p < 0,0001 e p < 0,0001, rispettivamente). Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Perfusioni di ottimizzazione degli organi suini. Trentacinque esperimenti di perfusione suina eseguiti durante le fasi di ottimizzazione, tra cui 25 fegati parziali, 2 reni e 8 fegati interi. Sono inclusi la durata della perfusione e il motivo della cessazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Validazione del fegato umano e perfusioni di applicazione. Quattordici perfusioni epatiche parziali umane, comprese le epatectomie formali sinistra e destra che vanno fino agli esperimenti di perfusione a segmento singolo. Sono inclusi la patologia, l'obiettivo sperimentale, la durata della perfusione e il razionale per l'interruzione. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Ottimizzazione del solo perfusato. Ventidue esecuzioni di ottimizzazione solo per il perfusato, tra cui il tipo di specie, l'obiettivo sperimentale, la durata dell'esperimento e il motivo della terminazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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Le macchine per la perfusione normotermica comunemente impiegate prima del trapianto di organi solidi hanno permesso di fare passi da gigante nella perfusione ex vivo. Sebbene il loro utilizzo con organi parziali sia tecnicamente fattibile in alcuni casi 7,8,9, rimangono inaccessibili per il ricercatore a causa dei costi elevati e della disponibilità limitata. In questo lavoro, abbiamo cercato di fornire un'alternativa comparabile e open source alla più ampia comunità di ricerca attraverso l'uso di componenti di pronta reperibilità e codice liberamente accessibile per eseguire il sistema per un'ampia gamma di endpoint di ricerca.

Diversi passaggi all'interno del protocollo sono essenziali per ottenere una perfusione stabile degli organi. Uno dei passaggi più critici è l'efficace scarico della pressione per prevenire il collasso parenchimale e la dilatazione sinusoidale. Ciò è stato ottenuto implementando il memory foam supportato da un diaframma oscillante per distribuire uniformemente il peso dell'organo e mantenere la pressione del portale quasi atmosferica per un drenaggio adeguato. L'uso iniziale di una griglia metallica per sostenere il fegato ha provocato il collasso parenchimale e la congestione sinusoidale, come osservato nell'analisi istologica e nell'ecografia durante la perfusione. Questo problema è stato parzialmente risolto con il passaggio a un'amaca in silicone perforato. Sebbene la necrosi da pressione macroscopica sia stata risolta, c'erano ancora notevoli prove di collasso parenchimale, come evidenziato da elevate pressioni della vena porta e campioni significativamente congestionati dopo 48 ore di perfusione. Si è anche tentato di immergere il fegato in soluzione salina o sangue ed è riuscito ad alleviare la congestione e l'ipertensione portale; Tuttavia, non era fattibile a causa della grande quantità di perfusato richiesta, della difficoltà nel mantenere la sterilità e della mancanza di un efficiente drenaggio nel serbatoio. Rispetto alla tecnica del galleggiamento, abbiamo osservato la stessa pressione portale quasi atmosferica quando il fegato è stato posizionato su un cuscino di memory foam con un diaframma oscillante per disperdere il peso in modo più uniforme (Figura 1B e Figura 3I). Questo design si traduce in segmenti più morbidi e meglio perfusi, pur consentendo un drenaggio facile ed efficiente del deflusso del sangue dal campione.

Un secondo passo critico è ridurre al minimo la resistenza del circuito che impartisce uno stress di taglio sui globuli rossi per prevenire l'emolisi. Ciò è stato ottenuto introducendo circuiti laterali con componenti restrittivi per facilitare il flusso fisiologico senza sottoporre il perfusato a pressioni non necessarie. L'emolisi è un processo inevitabile e continuo durante la perfusione meccanica. Nelle prime iterazioni del sistema, l'emolisi estesa ha contribuito in modo significativo all'interruzione anticipata. Lo stress di taglio che il sistema impartisce ai globuli rossi deriva prevalentemente dalle pompe a causa della stasi e del ricircolo del perfusato, oltre che dai diametri stretti di tubi e membrane. Le pompe attualmente impiegate causano un certo grado di emolisi, che aumenta nel tempo. L'efficienza della pompa è un fattore importante nell'emolisi, poiché flussi più elevati potrebbero essere vantaggiosi a causa di tassi più bassi di riciclo del sangue e flusso secondario, mitigati da un volume più elevato di perfusato e/o da velocità della pompa più basse. Poiché grandi volumi di pRBC sono spesso difficili da acquisire, abbiamo concentrato gli sforzi sulla riprogettazione del sistema per fornire portate fisiologiche a velocità di pompa inferiori, impartendo una resistenza inferiore nel circuito nel suo complesso31. Per ridurre ulteriormente la resistenza intrinseca del circuito, abbiamo integrato circuiti laterali in parallelo, il che ha portato a livelli più bassi di lattato e potassio e a livelli più elevati di ematocrito ed emoglobina nel tempo (Figura 3 supplementare). Infine, l'emofiltro di corrente è integrato nel circuito lato vena porta con il sangue spinto da una pompa peristaltica che conferisce una quantità significativa di emolisi a causa della notevole resistenza e dello stress di taglio impartiti sia dal filtro che dalla sua pompa. Uno dei nostri attuali sforzi di ottimizzazione si concentra sulla rimozione di questo circuito laterale studiando la potenziale implementazione di tubi per emodialisi nel serbatoio. La rimozione degli emofiltri di livello clinico consentirebbe la successiva rimozione della pompa peristaltica, ridurrebbe ulteriormente l'emolisi e ridurrebbe il costo complessivo del sistema.

Nonostante l'utilità e l'adattabilità del sistema qui descritte, è necessario riconoscere i limiti. In particolare, la durata della perfusione vitale è riproducibile in 3-4 giorni. L'emolisi rimane un fattore centrale che limita la longevità della perfusione, come discusso in precedenza. Tuttavia, abbiamo scoperto che un aumento significativo del volume totale di perfusato può prolungare sostanzialmente la durata della perfusione se sono necessari tempi di perfusione più lunghi, ma questo aumenta l'utilizzo delle risorse oltre a quanto descritto qui. La durata ottimale della perfusione dipenderà in ultima analisi dalla specifica domanda sperimentale posta al sistema. Ad esempio, gli studi che indagano la cinetica di somministrazione dei farmaci o l'inibizione della via possono essere condotti efficacemente nell'arco di 2-12 ore, mentre le domande che coinvolgono il reclutamento cellulare nel microambiente tumorale possono richiedere 48 ore32. Estendere la vitalità oltre la finestra attuale può essere importante per applicazioni come il rimodellamento della matrice extracellulare (ad esempio, la fibrosi), ma riteniamo che la maggior parte delle applicazioni correlate al cancro non richiederà un dispendio di risorse extra. L'obiettivo principale è stato quello di ottenere applicazioni traslazionali orientate all'oncologia, con l'obiettivo di mantenere i tumori umani in un ambiente controllato ex vivo in cui la terapia può essere somministrata attraverso il parenchima intatto e la vascolarizzazione tumorale, condizioni che replicano più da vicino le complessità degli scenari in vivo25. In questo scenario, il sistema affronta problemi di lunga data negli attuali modelli di oncologia preclinica relativi alla somministrazione di farmaci, all'eterogeneità tumorale e al metabolismo dei farmaci, che possono spiegare il frequente fallimento nel tradurre il successo preclinico in efficacia clinica33,34.

Rispetto alle macchine commerciali esistenti, il sistema offre notevoli vantaggi in termini di costi, scalabilità modulare e flessibilità sperimentale. I dispositivi commerciali sono spesso proprietari, costosi e ottimizzati per la perfusione di organi completi in contesti di trapianto. Il sistema è scalabile in un modo che le macchine commerciali non sono, in modo tale da poter prevedere la sua applicabilità in generale. Il sistema qui presentato non è un prodotto finale, ma piuttosto un progetto, che può essere modificato, adattato e riproposto per adattarsi a un'ampia varietà di interessi di ricerca e domande sperimentali, colmando un vuoto per gli scienziati di molte discipline.

Le direzioni future di questa piattaforma includono il ridimensionamento dei segmenti epatici sottosegmentali e del volume del perfusato per consentire l'uso di emoderivati autologhi a supporto delle applicazioni immuno-oncologiche. Stiamo anche lavorando per integrare piattaforme multi-omiche e imaging in tempo reale per fornire un monitoraggio dinamico della risposta al trattamento, aprendo la strada a studi farmacologici dettagliati. Ci auguriamo che il sistema incoraggi la collaborazione e l'innovazione nel tentativo di forgiare nuove profondità di conoscenza in molteplici campi della scienza traslazionale.

Dichiarazioni

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Gli autori non riportano conflitti di interesse in questo studio e nei suoi risultati. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health. Fonte di finanziamento per l'imaging dei campioni e la radiomica preliminare supportata dal Research Award for Staff Clinicians Proposal ID 231145 a Elliot Levy.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano riconoscere ed esprimere il loro apprezzamento a sostegno di questo progetto ai seguenti gruppi: NIH Dipartimento di Medicina Trasfusionale, NIH Dipartimento di Medicina Perioperatoria, NIH Dipartimento di Patologia, Wagner's Meats.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" Parete Versilon  C-219-A Tubo flessibile in PVCPlastica degli Stati Uniti57682
Siringhe da 10 cc con punta BD Luer-LockBD302995
Siringhe da 1 cc con punta Luer-Lock BDBD309628
25 Fr Cannula PortaleXVIVO11.01.520
Supporto per sensore di flusso stampato in 3Dn/an/avedere GitHub per i file SDL
Supporto magnetico stampato in 3Dn/an/avedere GitHub per i file SDL
48 pollici A x 24 pollici. W Pannello forato biancoFerramenta109099
Rubinetto a 4 vie, giallo, 2 luer femmina, luer maschio con spin lockStrumenti di precisione mondiali14057-10
Siringhe da 50 cc con punta BD Luer-LockBD309653
ACF00023 Tygon S3  di Saint Gobain | 5/16" I.D. x 1/2" O.D. x 3/32" Parete | E-3603 non DEHP | Tubi da laboratorio privi di ftalati | 50' Lunghezza del pacchettoMagazzino TubiACF00023
AmfotericinaFarmacia Veterinarian/ahttps://mms.mckesson.com/product/505635/Xgen-Pharmaceuticals-39822105505
Raccordo spinato, connettore a Y, diametro interno tubo 3/8", PP, 5/PKVWRMFLX06368-24Tipo di materiale non critico
Calibratore CDI 540Terumo540CL
Staffa per testa del cavo CDITerumoCDI519CL
CDI MonitorTerumo500AVHCTCL
Morsetto per palo CDITerumoCDI517CL
Connettore per tubi Clave IV senza ago 100/CAHenry Schein Odontoiatria1097422
Clinimix con elettrolitiBaxterCodice 2B7721Utilizzare solo il lato aminoacidico, non mescolare con il lato destrosio
CO2 USP Grado 50 LBL'ossigeno di RobertR25
Monitor per computer per GUI n/an/aqualsiasi tipo di schermo per la visualizzazione della GUI
Dispositivo di acquisizione datiCalcolo delle misureUSB-202ne servono 2 o 3, a seconda di come sono collegati i macchinari
Alimentatore da tavolo per pompaLevitronix100-40015ne servono 2, uno per HA uno per il fotovoltaico
Imbuto a tamburo Eagle 1662 con schermo in ottone, 18" di diametro x 7" di altezza, gialloIndustriale globaleWB440139
EpoprostenoloFarmacia Veterinarian/ahttps://mms.mckesson.com/product/1239813/Sun-Pharmaceuticals-62756005940
Luer femmina ¼ " barbiglio in nylon naturale prodotto in camera bianca; Confezione da 10VWRMFLX40314-26Tipo di materiale non critico
Raccordo, polipropilene, dritto, femmina Luer a portagomma, 1/8" ID; 25/PKVWRMFLX30800-08Tipo di materiale non critico
Raccordo, polipropilene, dritto, maschio Luer Lock a portatubo, 1/8" ID; 25/PKVWRMFLX30800-18Tipo di materiale non critico
Raccordo, PVDF, dritto, riduttore portagomma, 5/16" ID x ¼ " ID; 10/PKVWRMFLX40614-62Tipo di materiale non critico
Supporti di flusso n/an/avedere GitHub per i file SDL
Morsetto per sensore di flussoKeyenceFD-XC20R1
Controller del sensore di flussoKeyenceFD-XA1
Testa del sensore di flussoKeyenceFD-XS20
Alimentazione del sensore di flussoKeyenceMS2-H50
Frullatore di gas A scelta multiplaGB100+2ne servono 2, uno per HA uno per il fotovoltaico
Bombola del gas A, CDI 500TerumoCDI506
Bombola del gas B, CDI 500TerumoCDI507
Kit Glücagone, Glücagone 1 mg, Acqua sterile 1 mL, FialaFresenio0593-03
CUVETTA H/S 1/4x1/4 W/6" EXT 1CA=10EA 70-2006-4298-4Terumo6934
Serbatoio rigido con 150 & micro; Filtro MSocietà Emonica00205-00
Pad freddo termico, Mul-T-Pad, TP12E Dimensioni pad 13 "x 18" per pompa Gaymar TP700Mul-T-Pad8002-062-012https://www.amazon.com/Heat-Cold-Mul-T-Pad-Gaymar-TP700/dp/B00HFF7876. Di  nota, Stryker fornisce anche camicie d'acqua riscaldate simili al "Mul-T-Pad C2Dx 8002-062-012"
InsulinaFarmacia Veterinariahttps://mms.mckesson.com/product/294668/Novo-Nordisk-Pharmaceutical-00169183311
Pompa Ecoline modello Ismatec VC-280 IIIsmatecISM1078B-115
Ventilatore pediatrico LTV 1200Carefusionhttps://coastbiomed.com/product/carefusion-ltv-1200-ventilator/?srsltid=AfmBOopSCKwTLmKhZXcI
CgGQHfiKwj__78jNWxVaznJCS
aq3RjXw2E-H.
Questo modello di ventilatore pediatrico è stato riutilizzato dalle eccedenze ospedaliere e non è stato acquistato. Qualsiasi pompa intermittente commerciale o macchina di aerazione è un sostituto adatto.
Cavo della pompa principaleLevitronix190-10331ne servono 2, uno per HA uno per il fotovoltaico
MaPerSol Soluzione per la conservazione degli organi, sacchetto da 1 litroSoluzioni per la conservazionePS005
Masterflex  Raccordi adattatori, Luer a Luer, Tee, Avantor VWRMFLX45508-56Tipo di materiale non critico
Masterflex  Femmina Luer 3/16 "ID Barb in PVDF naturale prodotto in camera biancaVWRMFLX40314-22Tipo di materiale non critico
Pompa digitale Masterflex Ismatec Reglo con MasterflexLive, 4 canali, 8 rulli; 115/230 V c.a.Azienda MasterflexMFLX78018-22https://www.avantorsciences.com/us/en/product/NA5139147/masterflex-ismatec-reglo-digital-multichannel-pumps-avantor
Maschio Masterflex Luer 1/4" ID Barb in PVDF naturale prodotto in camera bianca, 10/PKVWRMFLX40318-27Tipo di materiale non critico
Masterflex maschio Luer 3/16" ID Barb in PVDF naturale prodotto in camera biancaVWRMFLX40318-22Tipo di materiale non critico
Medline Placenta Basin Vassoi StandardLinea MedicaDYNJSPLACENTA
CANNULA PER VASI MEDTRONIC DLP DA 2", PUNTA SMUSSATA DA 3 MMsutureMDT30007
Schiuma di memoria Materasso al miglior prezzohttps://www.amazon.com/Best-Price-Mattress-Twin-Topper/dp/B07999TQWB/ref=sr_1_2_sspa?crid=17LQXX80WX5FK&dib=eyJ2Ijo
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Magnete al neodimio con foro dritto non filettatoMcMaster CarrCodice 336K834
Azoto, 125 CU FTGrade 4.5 Elevata purezzaL'ossigeno di RobertR32
Ossigeno, 255 CU FTGrade 4.5 Elevata purezzaL'ossigeno di RobertR5
PDMSXA-2500: PermSelect  Modulo a membrana da 2500 centimetri quadrati - raccordo spinato senza MCCPermselectPDMSXA-2500può ottenere un raccordo luer o spinato, ma il collegamento cambierà
Iniezione di fenilefrina HCI, fiala USP 10mg/mL 1mLLa salute prima di tutto1000520
Telo riscaldante in poliuretano per sistemi di riscaldamento fluidi ORS, sterile, 44" x 66"Linea MedicaORS-300H
Sangue di maiale suinoLampire7204911
Monitor del sensore di pressionePendoTECHPMAT2HR
PRISMAFLEX M60 SETBaxter Healthcare Corp106696
PrismaSol BGK0/2.5 Soluzione sostitutiva per terapia sostitutiva renale continua, NON PVCBaxterCodice 110240S
Piastra di base per montaggio pompaLevitronix190-10313ne servono 2, uno per HA uno per il fotovoltaico
Adattatore USB per pompaLevitronix100-30391ne servono 2, uno per HA uno per il fotovoltaico
Sistema di trasmissione PuraLevLevitronix100-91025ne servono 2, uno per HA uno per il fotovoltaico
Cavo adattatore IP PuraLev Levitronix190-10475ne servono 2, uno per HA uno per il fotovoltaico
SENSORE SHUNT SYS500 - CA = 20EA 98-0702-1541-7TerumoCDI510HPuò acquistare scaduto da suture - funziona allo stesso modo, a volte ha un po 'di deriva del pH
Sensore di pressione monouso, non sterile, portagomma in polisulfone da 1/4 di pollicePendoTECHPREPS-N-025
Sensori di pressione monousoPendoTECHPREPS-N-025Può essere riutilizzato con la sterilizzazione, ma testare il sensore prima di ogni utilizzo
Bicarbonato di sodio 8,4% soluzione da laboratorioVicolo del laboratorio144-55-8
Taurocolato di sodio idratoMillipore SigmaCodice 86339-25G
SolumedrolFarmacia Veterinarian/ahttps://mms.mckesson.com/product/1212228/Dr-Reddys-Laboratories-43598013074
Termoforo StrykerAmazzoneB01M74Y8DI
Testa pompante SU, PP, Barb 3/8", Gamma >25kGy, DCP-30.2-G25, PuraLev Levitronix100-91071può essere riutilizzato dopo la sterilizzazione 
Pompa a siringa (Pump 11 Elite)Apparato di Harvard70-4504Ne serve uno per ogni farmaco infuso
Tubo siringaGSSME2020
Scaldabagno e circolatoreSovvenzione scientificaTC120
ZosynFarmacia Veterinarian/ahttps://mms.mckesson.com/product/1009456/Auromedics-Pharmaceuticals-55150011930

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