Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Abstract

Le reti di interazione proteina-proteina (PPI) sono rimodellate dinamicamente nella malattia, ma la maggior parte degli approcci di biologia dei sistemi si concentra sui cambiamenti nell'abbondanza proteica, trascurando la disfunzione critica a livello di interazione. Qui, presentiamo un robusto metodo chemioproteomico - interattoma proteina-proteina disfunzionale (dfPPI) - che consente una mappatura sistematica e contestuale alla malattia ad alto rendimento delle disfunzioni della rete PPI nelle cellule e nel tessuto umano primario. Questo metodo integra sonde di biologia chimica che catturano selettivamente assemblaggi di interattomi basati su epicaperoma con cromatografia liquida label-free-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e analisi computazionale basata su rete, per scoprire il ricablaggio di reti proteiche non evidenti dai soli dati trascrittomici o proteomici. La piattaforma dfPPI può essere applicata a tutti gli stati patologici, le specie e i tessuti per identificare i linfonodi di disfunzione utilizzabili e consentire approfondimenti ad alta risoluzione a livello di sistema sulla progressione della malattia. In questo protocollo, dimostriamo le procedure passo-passo per la preparazione dei campioni, il trattamento chimico con sonda, l'arricchimento di affinità, l'analisi LC-MS/MS senza etichetta e i flussi di lavoro bioinformatici utilizzati per generare e interpretare i set di dati dfPPI. Questo articolo mira a promuovere la riproducibilità e l'accessibilità di questo approccio, supportandone l'adozione da parte delle più ampie comunità di biologia dei sistemi e di ricerca traslazionale.

Introduzione

La funzione delle cellule, e per estensione degli organismi, dipende dal preciso coordinamento delle reti di interazione proteina-proteina (PPI) ^1,2. Queste reti sono responsabili dell'organizzazione e dell'esecuzione di quasi tutti i processi biologici. Sebbene le reti PPI siano intrinsecamente dinamiche e reattive allo stress, nella malattia possono ricablare in modo anomalo, portando a funzioni disadattive. È importante sottolineare che questo ricablaggio non comporta necessariamente cambiamenti nell'espressione genica o proteica; piuttosto, deriva da interazioni fisiche alterate tra proteine che altrimenti sarebbero normalmente espresse ^3,4,5. Gli approcci tradizionali nella biologia dei sistemi, come la trascrittomica o la proteomica, non riescono a catturare questi cambiamenti critici a livello di interazione.

Le tecnologie di mappatura PPI sono progredite in modo significativo, offrendo approfondimenti sull'organizzazione e la regolamentazione delle reti cellulari 6,7,8,9,10,11. Gli approcci comunemente usati, tra cui la purificazione di affinità-spettrometria di massa (AP-MS), la reticolazione (XL)-MS, la marcatura di prossimità e il co-frazionamento, offrono vantaggi specifici, come l'elevata specificità, la risoluzione spaziale o la capacità di rilevare complessi transitori 6,8,9,10,11 . Tuttavia, questi metodi spesso richiedono proteine esca, manipolazione genetica o bioinformatica complessa e possono avere difficoltà a catturare il ricablaggio su larga scala delle reti proteiche nei sistemi biologici nativi 6,7,8,9,10,11 . La maggior parte manca anche di scalabilità, il che li rende poco pratici per l'analisi di grandi coorti di campioni o per la mappatura sistematica dei cambiamenti dell'interattoma tra condizioni, tipi di cellule o punti temporali 6,7,8,9,10,11 (Tabella 1).

Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato la piattaforma disfunzionale Protein-Protein Interactome (dfPPI), un metodo chemioproteomico che identifica direttamente le disfunzioni della rete PPI responsabili dei fenotipi^{di malattia 12}. Sfrutta un'intuizione biologica chiave: negli stati patologici, un sottogruppo di chaperoni molecolari forma scaffold supramolecolari chiamati epicapeomi 13,14,15. Queste strutture non agiscono nel ripiegamento delle proteine, ma funzionano invece come hub di interazione dell'impalcatura che riorganizzano la connettività proteica³. Fondamentalmente, le proteine sequestrate negli epicaperomi non sono casuali; Sono coloro che sono attivamente coinvolti nel sostenere il fenotipo della malattia 16,17,18,19,20. Catturando queste proteine legate all'epicaperoma e i loro interattori, dfPPI identifica le esatte alterazioni della rete che guidano specifici stati patologici. Il ricablaggio della rete guidato dall'epicaperoma è prevalente in tutte le malattie, la maggior parte nelle coorti di Alzheimer e ~70% nei campioni di cancro^16,20, supportando l'applicabilità del dfPPI a studi ampi e incentrati sulla malattia.

La piattaforma dfPPI comprende l'intero flusso di lavoro, dalla preparazione del campione, all'acquisizione dell'affinità dell'epicameroma, all'identificazione dell'interattoma mediante MS, fino alle analisi bioinformatiche a valle, come l'arricchimento del percorso e la modellazione della rete proteica funzionale (Figura 1). Il metodo si avvale di sonde chimiche specifiche per l'epicaperoma immobilizzate su matrici di affinità (perle di PU o altre sonde)13,16,17 per isolare l'interattoma funzionale da cellule o tessuti. Queste sonde sono già state rigorosamente convalidate in diverse pubblicazioni per la specificità degli epicapeomi e l'idoneità per dfPPI 16,17,18,20,21,22. I complessi catturati vengono sottoposti a MS, utilizzando flussi di lavoro di digestione sia su microsfere che in gel, seguiti da LC-MS/MS senza marcatura. I dati risultanti possono quindi essere analizzati attraverso una pipeline bioinformatica dedicata che definisce la disfunzione a livello di interazione e la collega ai processi biologici e ai fenotipi. Poiché gli epicapecomi impalcano gli interattomi specifici del contesto 17,18,20, dfPPI rivela come le reti proteiche vengono rimodellate in una particolare malattia, tipo di cellula o stadio, rendendolo un potente strumento di biologia dei sistemi per la fenotipizzazione di precisione.

Il metodo è altamente scalabile ed è stato applicato a centinaia di campioni clinici e sperimentali, inclusi tessuti umani post-mortem e cellule in coltura, in diverse malattie come il cancro e la neurodegenerazione 16,17,18,19,20,22,23. Scoprendo i cambiamenti del PPI che definiscono uno stato patologico, dfPPI consente sia l'intuizione meccanicistica che la scoperta di bersagli terapeutici attuabili 16,17,18,19,20,22,23.

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio i componenti sperimentali della piattaforma dfPPI, dall'acquisizione di affinità di interattomi legati all'epicaperoma alla preparazione del campione per LC-MS/MS all'identificazione dell'interattoma tramite MS. La pipeline di analisi computazionale, ovvero ciò che viene fatto con l'elenco delle proteine identificate dalla MS per definire le interazioni differenziali e le conseguenze funzionali, non è trattata qui a causa di limitazioni di spazio. Tuttavia, è liberamente accessibile e ampiamente documentato tramite l'app dfPPI Shiny all'indirizzo https://epichaperomics.mskcc.org (aggiornata a https://dfppi.mskcc.org) e attraverso il sito web di Chiosis Lab all'indirizzo https://www.chiosislab.com/resources. Oltre a questi portali, la pipeline bioinformatica completa e gli script di accompagnamento sono inclusi in diverse pubblicazioni che applicano dfPPI al cancro 16,17,19 e al morbo di Alzheimer ^18,20.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana e del comitato per la cura e l'uso degli animali della nostra istituzione. Le attrezzature e i reagenti utilizzati nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione del campione per l'acquisizione dell'affinità

1. Estrazione di proteine dai tessuti
   NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per campioni di tessuto cerebrale post-mortem.
   1. Preparare un tampone per l'estrazione delle proteine contenente 20 mM di Tris (pH 7,5), 20 mM di KCl, 5 mM di MgCl₂ e 0,01% di NP-40 (tampone di lisi nativo). Aggiungere inibitori della proteasi e della fosfatasi immediatamente prima dell'uso. Mantieni il tampone sul ghiaccio.
   2. Posizionare il tessuto congelato (volume target di circa 50 mm³) in una provetta per microomogeneizzatore di tessuti, che consiste in una provetta per microcentrifuga specializzata da 1,5 ml dotata di un pestello. Aggiungere 500-700 μl di tampone di lisi nativo, regolando il volume in base alla compattezza del tessuto e alla facilità di omogeneizzazione. Omogeneizzare il campione su ghiaccio muovendo delicatamente il pestello su e giù e contro le pareti abrasive del tubo dell'omogeneizzatore fino a formare una sospensione omogenea.
      NOTA: Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio per mantenere gli assemblaggi proteici nella loro configurazione nativa e per evitare la degradazione delle proteine.
   3. Incubare i lisati a 4 °C per 30 minuti posizionando il flaconcino su un'unità di rotazione. Mescolare delicatamente i campioni durante l'incubazione utilizzando la rotazione.
   4. Centrifugare i campioni a 13.000 × g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga da banco per rimuovere i detriti.
   5. Raccogliere i surnatanti e trasferirli in provette da microcentrifuga trasparenti da 1,5 mL. Evitare di disturbare il pellet durante il trasferimento.
   6. Determinare la concentrazione proteica totale nel surnatante utilizzando il kit per il dosaggio dell'acido bicinconninico (BCA) secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: I lisati proteici possono essere conservati a -80 °C fino all'uso. Evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. Fare riferimento a una precedente pubblicazione²⁴ per l'impatto dei cicli ripetuti di congelamento-scongelamento e della temperatura di conservazione sull'integrità degli assemblaggi proteici.
2. Normalizzazione del campione
   NOTA: HSP90α e HSP90β sono componenti fondamentali dell'epicafero e sono i partner di legame diretti della sonda chimica utilizzata per la cattura dell'interattoma 13,21,23. La normalizzazione dei campioni basata su HSP90α (o HSP90β) garantisce che la quantità di epicaperoma mirabile alla sonda corrisponda tra i campioni, il che è essenziale per un confronto accurato degli interattomi catturati. I campioni possono essere normalizzati in base ai livelli di HSP90 determinati mediante Western blot, ma possono essere utilizzati anche altri metodi. Se i livelli di HSP90 sono comparabili tra i campioni, saltare questa sezione e procedere al passaggio 1.3. L'uso del blotting HSP90α/β qui è solo per la normalizzazione dell'input e non deve essere interpretato come una misura dell'abbondanza dell'epicapecore.
   1. Preparare 2× tampone per campioni di Laemmli composto da 4% di sodio dodecil solfato (SDS), 20% di glicerolo, 10% di 2-mercaptoetanolo, 0,02% di blu di bromofenolo e 0,125 M Tris-HCl, pH ~6,8.
      ATTENZIONE: Il 2-mercaptoetanolo è tossico e volatile e deve essere maneggiato in una cappa aspirante.
   2. Combinare 5 μg dell'estratto proteico cerebrale totale (dal passaggio 1.1) 1:1 (v/v) con 2× tampone per campioni di Laemmli in una provetta da microcentrifuga trasparente da 1,5 mL.
   3. Riscaldare i campioni a 95 °C per 3-5 minuti in un'unità di riscaldamento per denaturare le proteine prima di caricarli su elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE).
   4. Caricare i campioni su gel proteici prefabbricati all'8% di tris-glicina. In alternativa, usa gel fusi a mano.
   5. Caricare 5 μL di standard proteico precolorato su ciascun gel, ad esempio, nel primo pozzetto, per determinare il peso molecolare delle proteine.
   6. Far funzionare i gel in 1× tampone di corsa TGS (Tris-Glycine-SDS) a RT. Il tempo di esecuzione tipico è di 1,5-2 ore a 100 V.
   7. Preparare un tampone di trasferimento contenente 25 mM di Tris, 192 mM di glicina e 20% di metanolo.
      ATTENZIONE: Il metanolo è infiammabile e deve essere maneggiato secondo le linee guida di sicurezza.
   8. Trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa in tampone di trasferimento a 4 °C per 60 minuti a tensione costante (100 V).
   9. Preparare una soluzione di lavaggio a membrana (1× TBS-0,1% Tween-20) e una soluzione bloccante (5% di latte in 1× TBS-0,1% Tween-20). Questo protocollo utilizza latte in polvere scremato in polvere proveniente da una fonte commerciale.
   10. Porre la membrana in soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente (RT) agitando delicatamente su una piattaforma a bilanciere. Utilizzare 10 ml di soluzione bloccante per mini gel.
   11. Rimuovere la soluzione bloccante e incubare la membrana con l'anticorpo anti-HSP90α (diluizione 1:6.000 in 10 mL di soluzione bloccante) per una notte a 4 °C su un bilanciere a piattaforma.
   12. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuna con 10 ml di soluzione di lavaggio.
   13. Aggiungere l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato con HRP (diluizione 1:5.000 in 10 mL 1× TBS-0,1% Tween-20) e incubare per 1 ora a RT su un bilanciere a piattaforma.
   14. Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare la membrana quattro volte con soluzione di lavaggio (stesso volume e tempi di cui sopra).
   15. Rileva il segnale chemiluminescente specifico per HSP90α utilizzando un kit di chemiluminescenza avanzata (ECL) secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare un sistema di imaging a chemiluminescenza o una pellicola autoradiografica.
   16. Quantificare i livelli di HSP90α nei campioni in base all'intensità del segnale e calcolare un fattore di normalizzazione per il pull-down a valle.
       NOTA: L'intensità del segnale HSP90 riflette la quantità di epicaperoma bersagliabile dalla sonda in ciascun campione. Confrontando l'intensità del segnale tra i campioni e normalizzandola con un campione di riferimento eseguito su ogni gel, i volumi di input per la cattura dell'interattoma possono essere regolati di conseguenza. La quantificazione può essere eseguita utilizzando un software di densitometria. Includere sempre un'aliquota di un campione di riferimento su ciascun gel per consentire la normalizzazione tra le macchie.
3. Preparazione del perline in PU
   NOTA: Le perle in PU e le perle di controllo possono essere sintetizzate internamente come precedentemente riportato^21,25 o richieste al laboratorio di Chiosis previa sottoscrizione di un accordo di trasferimento del materiale (MTA). Devono essere conservati a -20 °C in isopropanolo.
   1. Prelevare un'aliquota di perle di poliuretano (PU) o di perle di controllo direttamente dal materiale di partenza di isopropanolo. Includere circa il 30% in eccesso per tenere conto della perdita di perline durante il lavaggio e la manipolazione.
   2. Rimuovere il solvente di stoccaggio: lasciare depositare le perle, quindi aspirare l'isopropanolo. Aggiungere il tampone di lisi nativo (1 mL per una provetta da 1,5 mL; 5 mL per una conica da 15 mL) e risospendere completamente mediante pipettaggio delicato o inversione.
   3. Lavare ed equilibrare tre volte: per ogni lavaggio, vortice per risospensione, centrifugare (provetta da 1,5 mL: 10.000 × g, 1 min; 15 mL conica: 3.000 × g, 5 min), quindi aspirare il surnatante con una linea di aspirazione dotata di punta per pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
   4. Aggiungere un tampone di lisi nativo alle perle lavate con un rapporto di volume 1:1 (perle:tampone) per generare un impasto di perle di lavoro uniforme.
   5. Aliquotare 40 μL di liquame di perle di PU (o di controllo) (ad esempio, perle 1:1 v/v: tampone) per campione in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Utilizzare una punta per pipetta con l'estremità tagliata per consentire una facile erogazione delle microsfere.
      NOTA: Le perline in PU sono sensibili alla luce. Utilizzare provette da 1,5 mL scure o avvolte in pellicola durante le fasi di discesa. A causa del loro rivestimento superficiale idrofobico con la piccola molecola legante epicaperoma, le perle di PU tendono ad aggregarsi e ad aderire alle superfici plastiche. Pipettare delicatamente e mescolare accuratamente per garantire una risospensione uniforme. È fondamentale erogare volumi uguali di liquame di perle in ciascun campione per evitare la variabilità nella cattura delle proteine, che può portare a risultati incoerenti o non riproducibili.
   6. Lavare le microsfere tre volte con tampone di lisi nativo aggiungendo 1 mL di tampone a ciascuna provetta, agitandole, centrifugando a 10.000 × g per 1 minuto e scartando il surnatante per aspirazione. Assicurarsi che le perle siano completamente risospese tra un lavaggio e l'altro.
      NOTA: Durante l'aspirazione, evitare di toccare le perline. Premere delicatamente la punta della pipetta contro la parete del tubo mentre si rimuove il liquido.
   7. Dopo il lavaggio finale, rimuovere la maggior parte del liquido dai tubi, facendo attenzione a non disturbare il pallino di perline.
      NOTA: Le perle lavate possono essere conservate a 4 °C per alcuni giorni. In genere, le perle vengono utilizzate entro 1-2 giorni dalla preparazione.
4. Pull-down dell'interattoma
   NOTA: La prima fase del pull-down è una fase di pre-clearing che utilizza perle di controllo, che sono coniugate a una piccola molecola inerte che non lega gli epicapeomi¹⁶. Questa fase rimuove le proteine, gli aggregati e i detriti insolubili non specificamente interagenti dal lisato, migliorando così la specificità del successivo pull-down delle perle di PU. Il pre-clearing riduce il legame di fondo e migliora il rilevamento di specifiche proteine associate all'epicapero.
   L'interattoma recuperato da questo protocollo viene analizzato dalla MS, che è altamente sensibile ai contaminanti sperimentali. Per garantire un'identificazione accurata delle proteine e preservare la qualità dei dati, utilizzare sempre tamponi e reagenti preparati di recente, ridurre al minimo l'esposizione a polvere e cheratina e indossare guanti puliti e privi di polvere quando si maneggiano campioni, materiali di consumo o attrezzature. Utilizzare vetreria/materiali di consumo dedicati MS per tutte le fasi di digestione pull-down e in-gel e tenere fisicamente separati tutti gli oggetti utilizzati per il Western blotting. Se si riutilizza la vetreria, decontaminare risciacquando in sequenza con metanolo al 100%, acqua ultrapura, acido acetico all'80%, acqua ultrapura, quindi asciugare all'aria. Non utilizzare detersivi; anche i residui di tracce possono sporcare le colonne LC e le fonti di ioni.
   1. Aggiungere gli estratti proteici normalizzati (come per il passaggio 1.2, calcolato in base all'intensità del blot HSP90) a singole provette per microcentrifuga da 1,5 mL contenenti 40 μL di liquame di controllo (cioè 20 μL di perle + 20 μL di tampone) e regolare il volume finale a 250 μL aggiungendo il volume appropriato di tampone di lisi nativo.
      NOTA: Per determinare i volumi di input specifici del campione, utilizzare la formula A1 = (60 / C1) × X1, dove A1 è il volume della proteina totale normalizzata da aggiungere (μL), C1 è la concentrazione proteica misurata (μg/μL) e X1 è il fattore di normalizzazione derivato dal blotting HSP90 (come descritto nel passaggio 1.2). Il volume del tampone aggiuntivo da aggiungere è calcolato come 250 μl meno A1. Se la normalizzazione non è necessaria, utilizzare 250 μg di proteine totali in 250 μL.
   2. Incubare i campioni a 4 °C per 30 minuti con rotazione su un rotatore end-over-end (10-15 giri/min).
   3. Centrifugare le provette a 10.000 × g per 1 minuto a 4 °C per pellettare le perle di controllo insieme alle proteine aggregate o insolubili.
   4. Raccogliere con cura il surnatante dalle perle di controllo utilizzando una pipetta da 1 ml e trasferirlo in provette da 1,5 ml contenenti 40 μl di impasto di perle di PU lavato.
   5. Incubare i campioni a 4 °C per 3 ore ruotandoli su un rotatore end-over-end (10-15 giri/min).
   6. Centrifugare ogni provetta a 10.000 × g per 1 minuto, aspirare il surnatante e lavare le perle quattro volte con 1 mL di tampone di lisi nativo. Per ogni lavaggio: vortice, centrifuga e aspirazione, utilizzando i parametri descritti al punto 1.3.
      NOTA: In questa fase, i campioni possono essere processati per LC-MS/MS utilizzando uno dei due flussi di lavoro: (1) SDS-PAGE seguito da digestione in gel o (2) digestione su perlina delle proteine catturate.
      Per il flusso di lavoro della digestione in gel, continuare con il protocollo come scritto. Per la digestione su perline, lavare le perle altre due volte con PBS freddo e procedere immediatamente alla Sezione 3. Non congelare le perle se si procede con la digestione su perline; I campioni devono essere trattati freschi lo stesso giorno. Il congelamento dei complessi proteici legati a perline può compromettere l'efficienza della digestione promuovendo l'aggregazione o la perdita di solubilità delle proteine, portando a un minore recupero dei peptidi e a una maggiore variabilità. Sulla base delle raccomandazioni fondamentali della SM, i campioni devono essere trattati freschi lo stesso giorno per garantire una digestione costante su perline.
5. Preparazione del campione per la digestione in gel
   1. Aggiungere 25 μl di tampone per campioni Laemmli 2× ai campioni di microsfere preparati al punto 1.4.6, contenuti in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: A questo punto i campioni possono essere conservati a -80 °C per un massimo di 24 ore. Caricare sempre l'intero volume del campione nel gel SDS-PAGE per la digestione in gel per massimizzare la copertura del proteoma e garantire la piena rappresentazione dell'interattoma. Si sconsiglia il carico parziale. Se il volume del campione è limitato e il carico parziale è inevitabile, il materiale rimanente deve essere conservato in aliquote per ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo e preservare l'integrità dell'interattoma.
   2. Riscaldare ogni campione a 95 °C per 3 minuti (con l'aggiunta del tampone Laemmli 2×, come sopra) per denaturare i complessi proteici ed eluirli dalle perle prima di caricarli su SDS-PAGE. La SDS e gli agenti riducenti nel tampone interrompono i PPI e rilasciano proteine dalla matrice.
   3. Centrifugare ogni provetta a 10.000 × g per 1 minuto a RT.
   4. Caricare ciascun surnatante su gel SDS-PAGE prefabbricati a gradiente 4-20%.
   5. Far scorrere i gel in 1× tampone di corsa TGS a RT e interrompere la corsa a metà (~3,5-4 cm nel gel a 100 V, in genere 30-60 minuti di autonomia).
   6. Rimuovere il gel dall'unità di elettroforesi e procedere alla colorazione con Coomassie brilliant blue secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Il gel colorato, immerso in 5-7 ml di acqua ultrapura in un contenitore di plastica, può essere trasportato alla struttura MS per l'identificazione delle proteine. Se non viene lavorato immediatamente, conservare a 4 °C in acqua ultrapura per un massimo di 1-2 settimane. Sono stati utilizzati due flussi di lavoro proteomici alternativi a seconda della struttura principale che ha eseguito il lavoro e degli obiettivi sperimentali: la sezione 2 descrive la digestione in gel seguita dall'acquisizione indipendente dai dati (DIA)-MS utilizzando lo spettrometro di massa orbitrap a quadrupolo; La sezione 3 descrive in dettaglio un protocollo di digestione su perlina ottimizzato per la spettrometria di mobilità ionica intrappolata con frammentazione seriale ad accumulo parallelo (diaPASEF)²⁶. Se del caso, i passaggi possono essere incrociati.

2. Identificazione delle proteine mediante LC-MS/MS con digestione delle proteine in gel

1. Riduzione e alchilazione in gel di proteine cisteinilate
   1. Asportare la regione colorata di ogni corsia di gel colorata con Coomassie e tagliarla in circa cinque fette di gel di uguali dimensioni. Macchiare ogni fetta incubandola tre volte in 500 μL di metanolo al 50% (v/v) per 1 minuto a 37 °C con agitazione a 700 giri/min su un agitatore per microprovette a temperatura controllata.
      NOTA: Ogni fetta di gel non deve essere più grande di ~1 cm × 0,5 cm × 1 cm per garantire un'efficiente diffusione dei reagenti nelle fasi successive e un'efficiente digestione della tripsina in gel durante la notte. Asportare la regione del gel corrispondente a proteine fortemente colorate, come HSP90 e HSC70, che rappresentano leganti diretti della sonda chimica e componenti principali dell'epicamero 15,16,23, separatamente dal resto del gel. La loro elevata abbondanza può altrimenti interferire con il rilevamento e la quantificazione di interattori a bassa abbondanza durante l'analisi LC-MS/MS.
   2. Incubare ogni fetta di gel in 500 μL di bicarbonato di ammonio (ABC) da 5 mM preparato in acetonitrile (ACN) al 30% a 37 °C con agitazione a 700 giri/min su un agitatore per microprovette a temperatura controllata per 15 minuti per rimuovere la macchia residua. Ripetere l'incubazione fino a quando la fetta di gel non è completamente decolorata.
      NOTA: Qualsiasi colorazione proteica visibile rimanente può interferire con il legame del peptide alla matrice C18 durante la fase di purificazione del peptide, riducendo il recupero e la sensibilità alla SM a valle.
   3. Rimuovere ed eliminare la soluzione ABC/ACN utilizzando una pipetta a punta fine, facendo attenzione a non perdere i pezzi di gel (cioè non aspirare i pezzi di gel insieme al liquido). Quindi aggiungere 500 μl di ACN al 100% a ciascuna provetta, assicurandosi che i pezzi di gel siano completamente sommersi. Incubare a RT su un agitatore orbitale a 700 giri/min per 10 minuti, o fino a quando i pezzi di gel diventano traslucidi, si restringono di dimensioni e assumono l'aspetto di carta bianca.
      ATTENZIONE: ACN è infiammabile e deve essere maneggiato in una cappa aspirante.
   4. Rimuovere ed eliminare l'ACN da ogni provetta utilizzando una pipetta a punta fine, facendo attenzione a non aspirare pezzi di gel. Centrifugare brevemente a 1.000 × g per 10 s per raccogliere il liquido residuo e aspirare accuratamente le goccioline rimanenti con una pipetta a punta fine. Mettere le provette aperte in una centrifuga sottovuoto a RT per 10-15 minuti, o fino a quando le fette di gel sono asciutte e rigide.
      NOTA: Non asciugare eccessivamente. Controllare periodicamente per evitare screpolature o restringimenti eccessivi dei pezzi di gel. Una volta asciugati, conservare i pezzi di gel a 4 °C in una provetta sigillata a basso legame o in una provetta da microcentrifuga fino alla digestione; Le proteine legate al gel e purificate sono stabili fino a diversi giorni se mantenute a 4 °C.
   5. Riduzione: aggiungere ~100 μL di 10 mM di Ditiotreitolo (DTT) (preparato fresco da 500 mM di stock in 50 mM di bicarbonato di ammonio) a ciascuna provetta del campione, assicurandosi che i pezzi di gel siano completamente sommersi. Incubare a 56 °C per 45 minuti con agitazione a 700 giri/min su un agitatore per microprovette a temperatura controllata.
      ATTENZIONE: Il DTT è un irritante per la pelle e le vie respiratorie. Maneggiare all'interno di una cappa chimica e indossare guanti.
      NOTA: Assicurarsi che le provette siano ben chiuse durante l'incubazione per evitare l'evaporazione e mantenere la concentrazione di DTT.
   6. Alchilazione: Rimuovere la soluzione DTT da ciascuna provetta utilizzando una pipetta a punta fine, facendo attenzione a non disturbare i pezzi di gel. Aggiungere immediatamente ~100 μL di 55 mM di iodoacetammide (IAA) in 50 mM di ABC per coprire completamente le fette di gel. Incubare a RT con agitazione a 700 giri/min per 30 minuti al buio.
      ATTENZIONE: L'IAA è tossico e sensibile alla luce. Eseguire tutte le manipolazioni in una cappa aspirante indossando i guanti.
      NOTA: Assicurarsi che la DTT sia completamente rimossa prima di aggiungere l'IAA per evitare l'estinzione della reazione di alchilazione. Avvolgere le provette in un foglio di alluminio o utilizzare contenitori che bloccano la luce durante l'incubazione per ridurre al minimo la degradazione dell'IAA.
   7. Centrifugare brevemente le provette a 1.000 × g per 5 s a RT per raccogliere il liquido residuo sul fondo. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando un puntale per pipetta a foro fine (ad es. puntale P10) per evitare di disturbare i pezzi di gel. Inclinare leggermente la provetta e aspirare dal bordo per ridurre al minimo il rischio di aspirazione di frammenti di gel.
   8. Equilibrare: Coprire i pezzi di gel con 500 μL di 50 mM di ABC al 30% di ACN. Incubare a RT per 10 minuti, agitando a 700 giri/min su un agitatore orbitale riscaldato. Questo passaggio aiuta a rimuovere il reagente di alchilazione in eccesso e bilancia il gel prima della disidratazione.
   9. Rimuovere la soluzione: centrifugare brevemente a 1.000 × g per 5 s ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta a punta fine, come descritto sopra.
   10. Disidratare di nuovo: ripetere i passaggi 2.1.3 e 2.1.4 per disidratare nuovamente i pezzi di gel utilizzando ACN al 100% seguito da centrifugazione sottovuoto fino a quando non si asciugano. Questo passaggio garantisce un recupero ottimale dei peptidi durante la digestione enzimatica.
2. Proteolisi in gel e pulizia dei peptidi
   1. Digerire i campioni di gel essiccati aggiungendo tripsina di grado MS a una concentrazione finale di 5 ng/μL in 50 mM ABC per reidratare completamente i pezzi di gel (in genere 50-100 μL di volume totale, o abbastanza per coprire le fette di gel). Incubare per una notte a 37 °C in provette per microcentrifuga da 1,5 mL, assicurandosi che le provette siano sigillate ermeticamente per evitare l'evaporazione. Agitare delicatamente se possibile (ad es. 300 giri/min su uno shaker per microprovette a temperatura controllata).
   2. Acidificare il campione dopo la digestione notturna aggiungendo il 10% di acido formico (FA) goccia per goccia per ottenere una concentrazione finale dell'1% (v/v) (ad esempio, aggiungere 1 μL di FA al 10% a 100 μL di digestato). Mescolare delicatamente, quindi sonicare i tubi per 10 minuti in un sonicatore a bagno d'acqua RT per migliorare l'estrazione dei peptidi.
   3. Rimuovere con cautela il surnatante contenente peptidi utilizzando una pipetta a punta fine (ad es. punta P10 a foro stretto), facendo attenzione a non disturbare la matrice di gel o ad aspirare frammenti di gel. Trasferire il surnatante raccolto in una provetta da 500 μL a basso legame e posizionarla sul ghiaccio.
   4. Aggiungere una soluzione al 5% di FA/50% di ACN (v/v) a ciascuna provetta (in genere ~50-100 μL, o abbastanza per coprire completamente i pezzi di gel) e agitare delicatamente a RT (ad esempio, su un agitatore a 70 giri/min per 10-15 minuti) per estrarre i peptidi residui. Raccogliere con cura il surnatante e combinarlo con la soluzione peptidica originale del passaggio 2.2.3.
   5. Concentrare l'estratto peptidico combinato utilizzando la centrifugazione sotto vuoto a RT (ad es. 1.000 × g per ~30 minuti) fino a quando non rimane solo una piccola gocciolina. Non lasciare asciugare completamente il campione, poiché ciò potrebbe causare la perdita di peptidi a causa dell'aderenza alle pareti del tubo. Utilizzare l'estratto parzialmente essiccato immediatamente per la desalinizzazione o conservarlo a -20 °C in un tubo sigillato a basso legante.
   6. Dissalare i peptidi utilizzando puntali per pipette confezionati a mano in C18 su piccola scala (ad es. StageTips) preparati con due dischi di estrazione C18 impilati inseriti in un puntale per pipette da 200 μl, come descritto in precedenza²⁷, con le seguenti modifiche:
   7. Attivare i dischi C18 aggiungendo 40 μL di metanolo. Centrifugare il puntale della pipetta contenente i dischi (inserito in un puntale per pipetta vuoto da 200 μl e posizionato all'interno di una provetta da 500 μl) utilizzando una centrifuga da banco a 1.500 × g per 3 minuti.
      NOTA: In tutte le fasi, non lasciare asciugare i dischi C18. L'essiccazione interferisce con il legame e l'eluizione dei peptidi. Potrebbe essere necessario accorciare il puntale esterno della pipetta da 200 μl (manicotto) che contiene il puntale della pipetta confezionato a mano in C18 su piccola scala tagliato a ~ 1 cm dall'estremità per garantire che il gruppo a due puntali nella provetta si adatti correttamente alla centrifuga.
   8. Equilibrare i dischi aggiungendo lo 0,1% di FA e centrifugando come sopra.
   9. Applicare la soluzione peptidica, ricostituita in 20 μL di 0,1% di FA, direttamente sulla parte superiore dei dischi impilati.
   10. Centrifugare a 1.500 × g per 5 minuti per facilitare il legame dei peptidi ai dischi C18.
   11. Lavare i peptidi legati facendo passare 40 μl di FA allo 0,1% attraverso la colonna.
   12. Eluire i peptidi con 40 μl di ACN al 70% contenente lo 0,1% di FA. Conservare i peptidi eluiti in provette a basso legame a -80 °C fino all'analisi LC-MS/MS. Evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo.
3. Nano-LC accoppiato all'analisi MS mediante DIA
   1. Concentrare l'eluato peptidico desalinico utilizzando la centrifugazione sotto vuoto (ad esempio, 20-30 minuti a RT, 1.000 × g), lasciando una piccola gocciolina. Ricostituire i peptidi in 10 μl di 0,1% di FA in acqua di grado LC-MS pipettandoli delicatamente su e giù e agitando brevemente. Girare brevemente verso il basso per raccogliere il liquido sul fondo del tubo prima di procedere.
   2. Analizzare aliquote di 4 μL del campione di peptidi ricostituito mediante nano-LC-MS/MS. Separare i peptidi su una colonna di fase inversa autoimpaccata (75 μm ID × 2 cm, resina C18, granulometria 3 μm) mantenuta a 50 °C. Preparare la colonna utilizzando una bomba a pressione²⁸ impacchettando un impasto di resina C18 (in metanolo, 1:3 v/v) in un capillare di silice fusa con un ugello di spruzzatura integrato da 10 μm (360 μm OD × 75 μm ID × punta da 10 μm). Interfaccia la colonna tramite ionizzazione nanospray a uno spettrometro di massa ibrido ad alta risoluzione (tipo quadrupolo-Orbitrap) che supporta i flussi di lavoro DIA.
      NOTA: Si consiglia una lunghezza della colonna di 20 cm in quanto fornisce una separazione ottimale per le miscele di peptidi generate da fette di gel SDS-PAGE.
   3. Mantenere la colonna analitica a 50 °C utilizzando un forno a colonna o un blocco riscaldante per garantire una ritenzione e una separazione costanti dei peptidi. Garantire un controllo stabile della temperatura durante tutta la corsa, poiché le fluttuazioni possono influire sulla riproducibilità.
   4. Eluire i peptidi utilizzando un gradiente lineare di 3-40% ACN in 0,1% FA per 110 minuti, a una velocità di flusso di 250 nL/min. Questo gradiente fornisce un'efficace separazione dei peptidi prima del rilevamento della SM. Il tempo totale di analisi, compreso l'equilibrio della colonna, è di 120 minuti.
   5. Acquisire dati in modalità DIA utilizzando un MS ad alta risoluzione, come descritto in precedenza²⁹.
      1. Impostare le scansioni complete del rilevamento MS1 da acquisire in modalità profilo a una risoluzione di 120.000 (a m/z 200), su un intervallo di scansione compreso tra 300 e 1650 m/z. Seguire ogni scansione MS1 con la frammentazione MS2 di 30 finestre precursori sequenziali (364-1370 Th) utilizzando uno schema di finestre di isolamento scorrevoli.
      2. Esegui la frammentazione utilizzando energie di collisione normalizzate a gradini di 25,5, 27,0 e 30,0. Lo stato di carica del precursore massimo predefinito è 4. Impostare la prima massa fissa nelle scansioni MS/MS a 200 Da e acquisire spettri MS2 a una risoluzione di 30.000.
      3. Utilizzare un'impostazione automatica del tempo di iniezione per MS2 e un tempo di iniezione massimo di 60 ms per MS1. Sia per le scansioni MS1 che MS2, impostare il bersaglio ionico (AGC) su 3e6.
4. Quantificazione relativa degli interattomi catturati per affinità
   NOTA: Per quantificare le proteine identificate nelle analisi DIA-MS degli interattomi epichaperoma catturati per affinità, utilizzare una piattaforma software che supporta i flussi di lavoro DIA e fornisce una quantificazione affidabile basata sull'intensità dei peptidi o sulla conta spettrale. Questo protocollo utilizzava MaxQuant (ad esempio, la versione 2.5.1.0) e il suo flusso di lavoro MaxDIA^20,29 per l'identificazione di peptidi/proteine e la quantificazione basata sull'intensità senza marcatura. Le ricerche hanno utilizzato una strategia esca a sequenza inversa con FDR dell'1% a livelli di PSM/peptidi e proteine; Le voci "inverse" e "Potenziale contaminante" sono state filtrate prima della bioinformatica. Non sono stati utilizzati spike-in; la prontezza dello strumento è stata verificata con 250 ng di digestato HeLa (e una miscela intermittente di 10 fmol 6-proteine) che soddisfano i criteri interni di stabilità ID e RT.
   1. Analizza i dati DIA-MS grezzi con parametri coerenti su tutti i campioni. Includere fino a due scissioni mancate e impostare le modifiche come segue: fissa, carbamidometilazione della cisteina; ossidazione della metionina e acetilazione della proteina N-terminale.
   2. Utilizza una libreria spettrale in silico basata sul database delle proteine umane UniProt (ad esempio, ~20.000 voci), assicurandoti che le sequenze di esche e contaminanti siano incluse per una stima accurata del tasso di false scoperte (FDR). Specificare la digestione triptica a meno che non sia stato utilizzato un enzima alternativo. Una libreria spettrale umana convalidata (basata sulla versione UniProt del 18/06/2020, 20.956 voci) è disponibile presso il repository³⁰ del Max Planck Institute of Biochemistry.
      NOTA: in alternativa a questo flusso di lavoro con librerie previste, il passaggio 3.4 illustra l'elaborazione senza librerie, che ha prodotto un'identificazione e una quantificazione comparabili su questi set di dati.
   3. Quantificare le abbondanze proteiche utilizzando valori di intensità (non intensità di quantificazione senza marcatura [LFQ]), in quanto questi sono più appropriati per le analisi della rete PPI a valle. Assicurarsi che LFQ sia deselezionato per evitare artefatti di normalizzazione, che possono distorcere i dati di arricchimento dell'affinità. Invece, utilizza valori di intensità grezzi derivati da corrispondenze spettrali peptidiche, che riflettono la forza dell'interazione piuttosto che l'espressione proteica globale. Applicare criteri di filtraggio appropriati (ad esempio, almeno un peptide unico per gruppo proteico) per migliorare l'affidabilità dell'identificazione e della quantificazione delle proteine. Esporta la tabella dell'intensità proteica risultante per successive analisi statistiche e basate sulla rete.
      NOTA: A differenza dei flussi di lavoro proteomici standard, in cui i valori LFQ aiutano a normalizzare il carico proteico in interi lisati, qui le proteine sono arricchite attraverso la cattura di affinità degli epicaperomi. Questa fase di arricchimento introduce una varianza biologica che la normalizzazione LFQ può oscurare. Pertanto, i valori grezzi di intensità sono preferiti, in quanto riflettono meglio le interazioni differenziali proteina-epicaperoma tra le condizioni e preservano il segnale necessario per l'analisi a livello di rete a valle (ad esempio, dfPPI). In studi precedenti che utilizzavano ricerche basate su Mascot^16,18, sono stati utilizzati anche valori di conta spettrale MS/MS al posto delle intensità. Nei flussi di lavoro di acquisizione dell'affinità come questo, i conteggi spettrali riflettono la frequenza di interazione e sono adatti per identificare le proteine che interagiscono in modo differenziale tra le condizioni. A differenza dei valori LFQ, i conteggi MS/MS non presuppongono una normalizzazione globale in tutto il proteoma, preservando la varianza biologicamente significativa dalla fase di arricchimento dell'epicavemeroma.

3. Identificazione delle proteine mediante LC-MS/MS con digestione delle proteine su perlina

1. Digestione su perlina
   NOTA: Per garantire un recupero ottimale delle proteine e ridurre al minimo la perdita di campione durante la digestione delle proteine su perlina per l'analisi della MS, è essenziale utilizzare provette per microcentrifuga a basso legame proteico. Queste provette sono progettate per ridurre l'assorbimento delle proteine dalle pareti delle provette, migliorando così il recupero del campione. Tutti i reagenti utilizzati in questa sezione devono essere preparati di fresco utilizzando acqua e prodotti chimici di grado LC-MS. Se si inviano campioni a un nucleo di proteomica, verificare le politiche locali, poiché alcune strutture potrebbero richiedere che tutti i tamponi siano sterilizzati con filtro prima dell'uso.
   1. Rimuovere eventuali residui di PBS che potrebbero rimanere nel tubo dal passaggio 1.4.6. Risospendere le perle in 80 μL di urea 2 M, preparate al momento in 50 mM ABC, pH 8,5. Garantire la miscelazione completa mediante pipettaggio o vortice breve.
      NOTA: Regolare il volume proporzionalmente in base alla quantità e al tipo di perlina. Questo protocollo è ottimizzato per 40 μL di liquame di perle di PU.
   2. Aggiungere DTT per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
      NOTA: Preparare una soluzione fresca di DTT da 10 mM da una soluzione madre di DTT da 1 M in acqua di grado LC-MS immediatamente prima dell'uso, poiché il DTT è soggetto a ossidazione in soluzione. Aggiungere il volume richiesto direttamente al campione e miscelare delicatamente mediante pipettaggio.
   3. Tappare la provetta e incubare a 37 °C per 30 minuti agitando a 1.100 giri/min su un agitatore orbitale riscaldato. Sigillare ermeticamente i coperchi per ridurre al minimo l'evaporazione.
   4. Aggiungere IAA per raggiungere una concentrazione finale di 3,67 mM. Incubare al buio a RT per 45 minuti con agitazione a 1.100 giri/min.
      NOTA: Preparare un brodo fresco di 10 mM IAA in acqua di grado LC-MS immediatamente prima dell'uso. Aggiungere il volume necessario al campione e mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
   5. Aggiungere ulteriore DTT per estinguere l'IAA non reagito, raggiungendo una concentrazione finale di 3,67 mM. Miscelare delicatamente pipettando.
      NOTA: L'IAA non reagito all'estinzione previene l'eccessiva alchilazione, che può compromettere l'attività della proteasi e l'efficienza della digestione. Preparare il DTT fresco e calcolare il volume in base al volume del campione corrente per raggiungere la concentrazione target.
   6. Aggiungere al campione 750 ng di 0,5 mg/mL di proteasi Lys-C di grado MS. Incubare a 37 °C per 1 ora agitando a 1.150 giri/min.
      NOTA: Preparare Lys-C sciogliendolo in acqua di grado LC-MS. Conservare le aliquote enzimatiche a -80 °C ed evitare il congelamento e lo scongelamento multiplo.
   7. Aggiungere 750 ng di 0,5 mg/mL di tripsina per sequenziamento preparata al momento. Incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 1.150 giri/min. Incubare per non più di 16-18 ore per prevenire la sovradigestione e la degradazione dei peptidi.
   8. Il giorno seguente, centrifugare il campione a 1.000-5.000 × g per 1-5 minuti a RT e trasferire il surnatante pipettandolo in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 mL. Scartare le perline.
   9. Regolare il pH del digestato al di sotto di 3 aggiungendo il 50% di acido trifluoroacetico (TFA) goccia a goccia. Verificare il pH utilizzando strisce indicatrici di pH.
      NOTA: L'intervallo di pH tipico deve essere ~2,5-3,0 e i campioni devono essere acidificati prima della desalinizzazione.
      ATTENZIONE: Il TFA è corrosivo e volatile. Aggiungere una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati.
2. Desalinizzazione dei peptidi
   NOTA: Per la desalinizzazione e la pulizia dei peptidi, utilizzare puntali per pipette confezionati in C18 su piccola scala (ad esempio, StageTips)³¹. Preparare gli StageTips C18 impacchettando tre strati di materiale C18 (ad esempio, dischi di estrazione in fase solida C18) in un puntale per pipette da 200 μl. È possibile utilizzare anche colonne di centrifuga C18 prefabbricate e disponibili in commercio. Seguire il protocollo del produttore per il condizionamento, il caricamento dei campioni e l'eluizione dei peptidi. Le prestazioni (ad esempio, efficienza di ritenzione, resa di recupero) possono variare tra dispositivi fatti in casa e commerciali. I puntali per pipette confezionati in C18 su piccola scala devono essere imballati ermeticamente per evitare il flusso di bypass.
   1. Condizionare in sequenza i puntali per pipette confezionati in C18 su piccola scala con: (1) 100 μL di metanolo. Centrifugare a 400 × g e scartare il flusso continuo; (2) 100 μl di ACN al 70%/TFA allo 0,1%. Centrifugare a 400 × g e scartare il flusso; (3) 100 μl di TFA allo 0,1%. Centrifugare a 400 × g ed eliminare il flusso. Ripetere questo passaggio due volte.
      NOTA: Il condizionamento garantisce la completa bagnatura della resina C18 idrofoba. Per le colonne di centrifuga C18 prefabbricate e disponibili in commercio, è possibile utilizzare anche i collettori per vuoto. Gli utenti devono fare riferimento alle istruzioni del produttore per raccomandazioni specifiche sulla manipolazione.
   2. Caricare il peptide digestato acidificato sui puntali per pipette condizionati su piccola scala confezionati in C18 pipettando lentamente il campione direttamente nel puntale. Centrifugare a 300 × g per consentire al digestato di passare attraverso la resina e scartare il flusso. Se il volume del campione supera la capacità, caricare in più giri.
      NOTA: Pipettare il digestato direttamente sul letto di resina impaccato, evitando la formazione di bolle d'aria. Se si utilizzano puntali a bassa ritenzione, toccare la parete interna dei puntali per pipette confezionati in C18 su piccola scala per rilasciare il liquido lentamente e in modo uniforme.
   3. Pipettare 100 μl di FA allo 0,1% direttamente nel puntale per pipetta confezionato in C18 su piccola scala, assicurandosi che la soluzione saturi completamente il materiale C18. Centrifugare a 400 × g ed eliminare il flusso. Ripetere questo passaggio due volte per rimuovere i sali e le sostanze interferenti.
      NOTA: Assicurarsi che il liquido scorra completamente attraverso il materiale C18 prima di ogni centrifuga. Evitare di intrappolare le bolle d'aria erogando lentamente la soluzione di lavaggio lungo la parete del puntale della pipetta.
   4. Eluire i peptidi legati pipettando 50 μl di ACN al 70%/0,1% di FA nel puntale della pipetta confezionato in C18 su piccola scala. Centrifugare a 300 × g e raccogliere l'eluato in una provetta da microcentrifuga pulita a basso legante. Ripetere questo passaggio due volte per garantire la completa eluizione.
      NOTA: Potrebbero essere necessari più cicli di centrifugazione per recuperare completamente l'eluato. Se il liquido residuo rimane intrappolato alla base del puntale, picchiettare delicatamente il puntale della pipetta confezionato in C18 su piccola scala o eseguire brevi centrifughe aggiuntive per raccogliere il volume rimanente. Unire gli eluati e controllare il volume finale prima di procedere.
   5. Congelare ed essiccare i peptidi eluiti utilizzando un concentratore sottovuoto fino a quando non sono asciutti. Assicurarsi che il coperchio sia posizionato in modo lasco per consentire lo sfiato, ma evitare schizzi.
   6. Ricostituire i peptidi essiccati aggiungendo 12 μl di FA allo 0,1% in acqua di grado LC-MS direttamente sul fondo della provetta. Agitare delicatamente e sonicare i tubi per sciogliere completamente i peptidi.
      NOTA: Assicurarsi che l'intero pellet o la pellicola essiccata siano completamente ricostituiti. La dissoluzione basata su pipette rischia la perdita di peptidi a causa dell'aderenza alle superfici del puntale.
   7. Sonicare i peptidi ricostituiti per 5 minuti in un sonicatore da bagno riempito con acqua fredda per garantire la completa dissoluzione e prevenire il surriscaldamento.
   8. Centrifugare i peptidi a 20.000 × g a 4 °C per 10 minuti. Trasferire il surnatante peptidico in una fiala di autocampionatore appropriata per il caricamento sul sistema LC-MS. Utilizzare fiale in polipropilene a basso volume, di alta qualità, testate per gascromatografia (GC) con tappi del setto in silicone/politetrafluoroetilene (PTFE) legati per ridurre al minimo la perdita di campione. Etichettare chiaramente le fiale con l'ID del campione e l'ordine di iniezione.
   9. Stimare la concentrazione di peptidi utilizzando uno spettrofotometro a 280 nm. Si noti che questo è approssimativo e può essere influenzato dal contenuto di residui aromatici o contaminanti. In alternativa, utilizzare saggi peptidici colorimetrici per una quantificazione più accurata.
3. Parametri LC e MS
   NOTA: I seguenti parametri LC e MS sono ottimizzati per il sistema nano-LC accoppiato con lo spettrometro di massa utilizzato nel protocollo corrente. Per altri sistemi nano-LC e spettrometri di massa, i parametri devono essere regolati di conseguenza.
   1. Preparare settimanalmente le fasi mobili per garantire la compatibilità con LC-MS e ridurre al minimo la contaminazione: (1) Fase A mobile: aggiungere 1 mL di FA di grado LC-MS a 1 L di acqua di grado LC-MS e (2) Fase B mobile: aggiungere 1 mL di FA di grado LC-MS a 1 L di ACN di grado LC-MS.
      NOTA: Utilizzare solo solventi e acidi di grado LC-MS. Preparare entrambe le fasi in bottiglie di vetro pulite e degasare se richiesto dal sistema LC. Scartare le fasi inutilizzate su base settimanale per evitare la crescita o la degradazione microbica.
   2. Installare una colonna capillare in silice fusa lunga 25 cm e con diametro interno di 75 μm impacchettata con particelle in fase inversa C18 da 1,7 μm.
      NOTA: Maneggiare le colonne con cura per evitare di introdurre bolle d'aria o danneggiare il materiale di imballaggio. Seguire le istruzioni del produttore per l'installazione e l'equilibratura della colonna.
   3. Condizionare la colonna aumentando gradualmente la portata da 50 nL/min a 300 nL/min utilizzando la fase B mobile al 3%.
      NOTA: Questo passaggio garantisce che la fase stazionaria sia adeguatamente bagnata ed equilibrata prima dell'iniezione del campione. Monitorare la pressione della colonna durante la rampa della portata. Picchi di pressione improvvisi possono indicare bolle d'aria o ostruzione della colonna. L'equilibrio può essere considerato completo quando la pressione basale si stabilizza.
   4. Mantenere la temperatura della colonna a 50 °C per garantire prestazioni cromatografiche ottimali.
   5. Iniettare 100 ng di un digestato triptico di cellule HeLa come standard di controllo qualità (QC) per valutare le prestazioni del sistema.
      NOTA: Questa iniezione di QC funge da punto di riferimento per valutare la coerenza del tempo di ritenzione LC, la sensibilità alla SM e la copertura del proteoma tra le esecuzioni. Confronta i conteggi di identificazione delle proteine, la riproducibilità del tempo di ritenzione e l'intensità del segnale con un set di dati QC di riferimento per confermare la prontezza del sistema prima di analizzare i campioni sperimentali. Utilizzare gli standard commerciali di digest HeLa preparati a concentrazioni note per la riproducibilità tra gli esperimenti.
   6. Utilizzare un'eluizione in gradiente dal 2% al 35% della fase mobile B per 90 minuti a una velocità di flusso di 300 nL/min. Il gradiente di 90 minuti fornisce una separazione peptidica ad alta risoluzione adatta a proteomi complessi. Seguendo la pendenza, mantenere la velocità al 95% della Fase Mobile B per 7 minuti per lavare la colonna.
      NOTA: Includere una fase di riequilibrio (ad esempio, ritorno al 2% B per 10-15 minuti) prima dell'iniezione successiva per garantire la riproducibilità della colonna tra le corse. Evita bruschi cambiamenti di gradiente, che possono influire sulla stabilità del tempo di ritenzione e sulla forma del picco.
   7. Condurre analisi MS utilizzando uno spettrometro di massa dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray compatibile con nanoflow (ad esempio, in stile CaptiveSpray).
      NOTA: La sorgente ionica CaptiveSpray fornisce un elettrospray stabile a basse velocità di nanoflusso, migliorando l'efficienza e la sensibilità della ionizzazione. Per i laboratori che utilizzano spettrometri di massa alternativi, regolare di conseguenza i parametri di acquisizione e ionizzazione. Garantire una corretta messa a punto e calibrazione prima dell'analisi per mantenere l'accuratezza e la risoluzione. Posizionare correttamente l'emettitore di spruzzo e monitorare la stabilità dello spruzzo durante la corsa per evitare interruzioni del segnale.
   8. Utilizzare un metodo di acquisizione diaPASEF indipendente dai dati³². Per gli utenti che non hanno familiarità con diaPASEF, consultare la documentazione tecnica del produttore o i protocolli recenti che descrivono i flussi di lavoro della spettrometria di mobilità ionica intrappolata (TIMS)-DIA³³ per ottimizzare diversi tipi di campioni o lunghezze di gradiente.
      NOTA: diaPASEF combina TIMS con DIA per aumentare la velocità e la sensibilità di sequenziamento allineando ioni precursori e frammenti nella dimensione^{di mobilità 34}. Assicurarsi che il dispositivo TIMS sia correttamente calibrato e sincronizzato con il quadrupolo per evitare il disallineamento della mobilità ionica e delle finestre di massa.
   9. Utilizzare le seguenti impostazioni dello strumento: (1) Intervallo di massa: da 100 a 1700 m/z; (2) Intervallo di mobilità ionica: 0,60-1,60 V·s/cm²; (3) Energia di collisione: 20-59 eV, a rampa; (4) Tempo di percorrenza: 100 ms; (5) Tempo di accumulo: 100 ms; (6) Intervallo di massa per diaPASEF: 400-1201 Da; (7) Larghezza finestra di massa: 26 Da con 1 Da sovrapposto; (8) Numero di incrementi di massa per ciclo: 32; (9) Tempo di ciclo: ~1,8 s
      NOTA: Queste impostazioni sono ottimizzate per bilanciare la profondità di copertura e la velocità di scansione. Potrebbero essere necessarie piccole regolazioni (ad esempio, larghezza della finestra o numero di passi) a seconda della complessità del campione, della lunghezza del gradiente e delle prestazioni del sistema LC-MS. L'identificazione di oltre 7.500 proteine per il digestato HeLa indica prestazioni ottimali del sistema. Il numero di identificazioni può variare a seconda dello strumento e deve essere valutato di conseguenza.
   10. Caricare 300-400 ng di campione di peptidi per iniezione per evitare il sovraccarico della colonna analitica. Il sovraccarico può portare all'allargamento dei picchi, alla soppressione degli ioni e alla riduzione della riproducibilità. Confermare la concentrazione di peptidi prima dell'iniezione utilizzando uno spettrofotometro o un test colorimetrico dei peptidi per evitare la variabilità tra le corse.
   11. Eseguire iniezioni in bianco tra i gruppi di campioni per evitare il carryover. Utilizzare la fase A mobile al 100% (acqua con 0,1% di FA) come bianco di iniezione. In questo modo i peptidi residui vengono eliminati dalla colonna e si riduce la contaminazione tra le corse. Monitorare gli ioni di base e di fondo per confermare un'adeguata pulizia.
4. Analisi dei dati DIA
   1. Utilizzare un software adatto che supporti l'analisi dei dati utilizzando il flusso di lavoro directDIA³⁵ e l'elaborazione senza libreria dei dati di proteomica DIA. Esegui l'identificazione e la quantificazione delle proteine in base a un database UniProt FASTA³⁶, con parametri di ricerca standard e impostazioni di quantificazione predefinite.
      NOTA: Tutti i parametri, tra cui la specificità enzimatica, le impostazioni di modifica, le soglie FDR e gli output post-analisi, sono descritti in dettaglio nel File supplementare 1. Possono essere utilizzate anche piattaforme di analisi DIA alternative come DIA-NN³⁷ se supportano flussi di lavoro e output simili.
   2. Esecuzione di directDIA senza libreria con cutoff del valore q corrispondenti all'1% di FDR a livello di precursore, peptide e gruppo proteico; Escludere le identificazioni delle esche prima dell'analisi a valle.
      NOTA: non sono stati aggiunti standard iRT; le prestazioni sono state confrontate con le esecuzioni digest HeLa rispetto a criteri predefiniti di identificazione e stabilità del tempo di ritenzione.

Risultati

Dopo l'esecuzione riuscita del protocollo, gli utenti dovrebbero ottenere set di dati di interazione di alta qualità adatti per l'analisi dfPPI a valle. L'identificazione delle proteine viene eseguita a partire dai dati DIA all'1% di FDR (PSM e livelli proteici) e la quantificazione utilizza le intensità grezze o le conte spettrali MS/MS (non LFQ). Le firme QC attese includono: raggruppamento stretto di repliche tecniche mediante PCA, CV mediane di precursori/proteine di circa il 10-12%, clustering gerarchico guidato dall'origine biologica piuttosto che dalla replicazione e robusto arricchimento a livello di percorso su g:Profiler/Reactome.

Generazione di sonde a microsfere in PU e convalida dell'attività prima dell'uso

Le perle di PU sono preparate accoppiando una piccola molecola analoga dell'agarosio attivato dal NHS²⁵. Una confezione standard di resina da 25 mL produce ~25 mL di perle di PU conservate come impasto 1:1 in isopropanolo. Aliquotare in provette a basso legame e conservare a -20 °C, al riparo dalla luce (ad esempio, avvolgere in un foglio di alluminio). In queste condizioni, un lotto rimane stabile per ≥12 mesi. Prima dell'uso, rimuovere l'isopropanolo ed equilibrare le perle nel tampone legante nativo (passaggio 1.3). Ogni lotto viene qualificato al momento della sintesi e successivamente periodicamente utilizzando due saggi (Figura 2): (i) Specificità biologica: eseguire pull-down abbinati da un lisato alto di epicaperoma (ad es. MDA-MB-468) e da un lisato basso di epicaperoma (ad es. ASPC1) in condizioni identiche (40 μL di liquame di perle con 250 μg di proteina totale; 3 ore a 4 °C; lavaggi nativi), eluire/denaturare e immunoblot per HSP90, HSC70 e HOP. Accettazione: forte arricchimento nel campione epicapero-alto con segnale minimo nel campione basso; rapporti banda-intensità paragonabili a quelli di un lotto di riferimento (±20-30%). (ii) Acquisizioni parallele del profilo di carico globale da un lisato ad alto epicaperoma con perle di PU rispetto a perle di controllo inerti abbinate, carichi di volumi di eluato uguali su SDS-PAGE e colorazione di Coomassie. Accettazione: Le perline in PU mostrano un carico ricco e di peso molecolare elevato con uno sfondo minimo nella corsia di controllo delle perline. Un lotto da 25 mL supporta ~600 catture a 40 μL per campione; Ritirarsi molto se la specificità o il profilo del carico non vengono accettati dopo il rilavaggio/riequilibrio.

Risultati rappresentativi dei protocolli in-gel e on-bead

In un confronto testa a testa pilota su cellule MDA-MB-468 ad alto epicapero, i flussi di lavoro in-gel e on-bead hanno prodotto interattomi altamente concordanti: 4.616 proteine su 6.333 (73%) sono state condivise a livello di gruppo proteico, con 1.275 (20%) rilevate solo da in-gel e 442 (7%) solo da on-bead. L'accordo a livello di percorso era ancora più alto: tra 860 termini Reactomi, 727 (85%) erano comuni, con 81 (9%) unici per l'in-gel e 52 (6%) unici per l'on-bead. L'intensità mediana delle proteine era ~3× più alta per l'in-gel rispetto all'on-bead, coerentemente con la concentrazione di gel-eluizione, ma questo non ha avuto un impatto significativo sulla concordanza del percorso.

Esempio su scala di coorte e firme QC

Ad esempio, abbiamo analizzato dodici campioni biologici (Figura 3). Quattro campioni sono stati eluiti e processati mediante digestione in gel; otto campioni sono stati sottoposti a purificazione per affinità di complessi epichaperome, seguita da digestione su perlina e nano-LC-MS/MS in duplicato tecnico. Sono state osservate le firme del QC attese: raggruppamento stretto di repliche tecniche mediante PCA, CV mediane di precursori/proteine di ~10-12%, clustering gerarchico guidato dall'origine biologica piuttosto che dalla replicazione e robusto arricchimento a livello di percorso su g:Profiler/Reactome. Questi risultati illustrano la riproducibilità tra i componenti del flusso di lavoro, l'ampio rilevamento delle proteine impegnate nell'epicaperoma e la chiara interpretabilità funzionale degli interattori differenziali a livello di percorso. Gli arricchimenti del percorso derivati da entrambi i flussi di lavoro corrispondevano ai nostri output dfPPI pubblicati per questa linea, convalidati da diversi saggi ortogonali biochimici e funzionali¹⁷.

Qualità del materiale in ingresso e digestione

Un gel SDS-PAGE rappresentativo colorato con Coomassie è mostrato per quattro dei campioni processati mediante digestione in gel (Figura 3A). Il gel illustra la cattura proteica riproducibile e la distribuzione coerente del banding lungo le corsie, confermando il successo dell'arricchimento di complessi proteici da lisati nativi prima della spettrometria di massa. Questi profili interattomici denaturati dimostrano che la fase di cattura dell'affinità produce un input proteico sufficiente e coerente per l'analisi MS a valle.

Gli interattomi catturati mostrano un'ampia copertura proteica attraverso i pesi molecolari, riflettendo il successo dell'arricchimento di assemblaggi proteici da lisati nativi. Fondamentalmente, questo recupero non si limita alle proteine abbondanti, ma include interattori a bassa abbondanza, fornendo la complessità e la profondità necessarie per l'analisi a livello di sistema.

Controlli e specificità su larga scala

In questo flusso di lavoro, utilizziamo le perline di controllo solo per il pre-sdoganamento (vedere i passaggi 1.3 e 1.4); Non eseguiamo catture comparative di routine "a sonda inerte" su ciascun campione biologico. Per le grandi coorti cliniche, le catture inerti consumano materiale prezioso ma aggiungono poco valore interpretativo per dfPPI perché le statistiche a valle operano a livello di rete/percorso, non a livello di singola proteina. I contaminanti casuali o appiccicosi di resina non compaiono in modo coordinato tra i membri dello stesso percorso e quindi non sopravvivono ai test di arricchimento a livello di percorso o ai filtri di coerenza a livello di coorte. In pratica, la specificità è assicurata da (i) pre-clearing, (ii) riproducibilità della replicazione stretta (PCA/CV) e (iii) stabilità del percorso attraverso le soglie e ricampionamento. Storicamente, abbiamo valutato gli esperimenti a blocchi di cattura inerte e concorrente solubile (PU-H71) e abbiamo scoperto che non modificavano gli esiti della via dfPPI 16,17,21, pur consumando materiale clinico insostituibile; Pertanto, li riserviamo solo per la verifica pilota. Per i gruppi che preferiscono controlli espliciti a livello di esecuzione, notiamo che entrambe le opzioni sono compatibili con il protocollo, ma non sono richieste per le analisi dfPPI su scala di coorte.

Numero di replica

L'inferenza del percorso in dfPPI è basata su set e non richiede un numero di replica fisso. Con acquisizioni robuste, un singolo campione per condizione può produrre richiami di percorso esplorativi. Per le analisi di conferma, raccomandiamo ≥3 repliche biologiche per condizione per le cellule in coltura (con iniezioni di LC-MS/MS duplicate quando possibile) e N appropriate per coorte per il tessuto umano (tipicamente ≥5-10 per gruppo per la scoperta, più grandi se stratificate per covariate). Valutiamo la stabilità mediante clustering replicato (PCA), CV mediana del precursore (target ~10-15%) e bootstrap/ricampionamento dei risultati dell'arricchimento.

Riproducibilità tecnica tra le corse

La riproducibilità tecnica è stata valutata utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) (Figura 3B) dei dati sull'intensità dei peptidi provenienti da campioni digeriti su perle (otto cervelli murini, eseguiti in duplicato). Le repliche si raggruppano strettamente per ogni campione biologico, mentre i diversi campioni si separano in modo netto lungo i primi due componenti principali. Le prime due componenti principali spiegavano rispettivamente il 28,6% e il 22,0% della varianza totale e distribuivano i campioni in base alle differenze biologiche piuttosto che al rumore tecnico. Questa struttura riflette un'elevata coerenza analitica e conferma che il metodo preserva le differenze biologicamente rilevanti, il che è fondamentale per consentire a dfPPI di rilevare il ricablaggio della rete specifico per condizione.

Coerenza del rilevamento tra i campioni

Le distribuzioni del coefficiente di variazione (CV) per le intensità degli ioni precursori dimostrano che la stragrande maggioranza delle caratteristiche scende al di sotto del 20% CV, con valori mediani che variano dal 9,7% all'11,9% in tutte le condizioni (Figura 3C). Questi risultati confermano la rilevazione coerente della SM e il recupero dei peptidi tra le repliche.

Gamma dinamica e copertura del proteoma

Il raggruppamento gerarchico dei valori di abbondanza delle proteine log-trasformate (Figura 3D) ha mostrato una forte separazione dei campioni e la conservazione della variazione tra i campioni, riflettendo anche l'ampio intervallo dinamico catturato nelle esecuzioni MS. Le intensità proteiche spaziavano da interattori a bassa abbondanza a gruppi proteici altamente arricchiti, come visualizzato dal gradiente blu-giallo. I dati confermano che il protocollo consente il rilevamento di diversi assemblaggi proteici e interattori, catturando sia i componenti principali che quelli periferici.

Interpretazione funzionale tramite dfPPI

Per supportare l'interpretazione e la riproducibilità, forniamo due risorse complementari per l'analisi dei set di dati dfPPI: (i) un'applicazione web interattiva Shiny (https://epichaperomics.mskcc.org/ aggiornata a https://dfppi.mskcc.org) e (ii) flussi di lavoro aperti e scriptabili e file di sessione Cytoscape rilasciati con precedenti studi dfPPI (GitHub/Zenodo)38,39,40,41. L'app acquisisce tabelle di intensità grezza o di conteggio spettrale MS/MS, esegue il controllo di qualità (clustering di replica, controlli dei valori mancanti), la gestione opzionale di rumore/batch (regressione covariata), identifica le proteine differenzialmente impegnate e fornisce letture di percorso/rete tramite grafici interattivi e report scaricabili, senza richiedere codifica.

dfPPI tratta le intensità misurate o i conteggi spettrali come proxy per il "coinvolgimento dell'epicaperoma". Gli utenti selezionano un modello di connettività differenziale (DC) che va da un semplice test t a due code (predefinito) a modelli lineari consapevoli delle covariate; il passaggio DC può anche essere saltato. Dopo il DC, gli utenti impostano le soglie di fold-change e p-value (le impostazioni predefinite rispecchiano il lavoro precedente di dfPPI; ad esempio, FC > 1,0, p nominale ≤ 0,25) per passare i candidati all'arricchimento. Sono disponibili due motori di arricchimento: GSEA basato su rango (su statistiche con segno) e sovrarappresentazione (ipergeometrica) tramite g:Profiler con correzione di test multipli. Per un contesto chaperone-centrico, la pipeline fornisce anche l'analisi dell'arricchimento interattoma (iEA) per verificare se gli interattori diretti delle proteine dell'impalcatura chaperone sono sovrarappresentati tra le proteine differenzialmente impegnate. Le visualizzazioni di rete pesano i nodi/bordi in base alla dimensione dell'effetto e/o al supporto statistico, consentendo la visualizzazione del ricablaggio coordinato piuttosto che degli effetti di una singola proteina. Per gli utenti che preferiscono i flussi di lavoro con script, il codice R sottostante e i file di sessione Cytoscape utilizzati per costruire mappe e figure di rete sono disponibili pubblicamente (ad esempio, GitHub/Zenodo)38,39,40,41 con le pubblicazioni associate 17,18,19,20 e possono essere eseguiti localmente o adattati per nuovi set di dati.

Si raccomanda un cutoff permissivo (fold-change > 1,0; p nominale ≤ 0,25) per mantenere i segnali dello stato di interazione introdotti dall'arricchimento di affinità. Quindi spostiamo il controllo statistico a livello di percorso: le proteine candidate vengono testate per l'arricchimento attraverso ontologie curate (ad esempio, GO, Reactome) utilizzando g:Profiler e i valori p del percorso aggiustati per più test determinano la significatività e la classificazione. Questo disegno riflette l'obiettivo di dfPPI - rilevare il ricablaggio coordinato della rete, non l'espressione differenziale di una singola proteina - ed evita la normalizzazione dell'intero proteoma che può oscurare i segnali di arricchimento nei set di dati pull-down. Come mostrato in precedenti studi dfPPI ^17,20, soglie più indulgenti a livello di proteina producono richiami di pathway stabili e rilevanti per la malattia, mentre altri modelli (ad esempio, modelli lineari con restringimento empirico di Bayes) possono essere utilizzati quando la varianza o le covariate batch lo giustificano, senza alterare l'inferenza centrale centrata sul pathway.

La cattura per affinità arricchisce inevitabilmente le proteine "appiccicose" (ad esempio, cheratine, proteine del citoscheletro, proteine ribosomiali) e le perle di PU possono anche catturare gli interattori chaperoni generali. In dfPPI, questi non guidano la biologia per diversi motivi. In primo luogo, i lavaggi pre-schiariti e rigorosi rimuovono la maggior parte dei leganti non specifici. In secondo luogo, i leganti generici, inclusi molti interattori chaperone, mostrano variazioni di piega vicine a 1,0 in tutte le condizioni e/o un rilevamento incoerente e quindi falliscono gli schermi del valore FC/p. In terzo luogo, l'arricchimento del percorso è basato su set e consapevole dello sfondo: la significatività viene calcolata rispetto al proteoma rilevato specifico per l'esperimento e richiede che più membri dello stesso percorso covarino. I contaminanti casuali o ad alta abbondanza sono dispersi in molti termini e quindi non formano arricchimenti coerenti e significativi per FDR. Nessuna singola proteina, contaminante o altro, può "fare" una chiamata di percorso. In quarto luogo, dfPPI interpreta la coerenza a livello di rete, non le singole proteine; Le chiamate di percorso devono sopravvivere alla correzione di più test (ad esempio, g:Profiler adjusted p-values), alle dimensioni minime del set di geni e alla coerenza della replica. Insieme ai preclear a perline inerti abbinati e al filtraggio di contaminanti comuni, questo framework rende dfPPI robusto rispetto al fondo: anche se sono presenti centinaia di proteine non informative, esse non alterano la classificazione dei pathway perché l'arricchimento dipende dal numero di proteine concordanti all'interno di un pathway, non dalla lunghezza totale dell'elenco delle proteine. Inoltre, ogni studio dfPPI pubblicato fino ad oggi ha corroborato le previsioni a livello di percorso e di rete con un'ampia validazione sperimentale (ad esempio, biochimica mirata, letture di segnalazione, perturbazioni genetiche o farmacologiche)16,17,18,19,20, dimostrando che i risultati dfPPI non sono semplicemente elenchi di proteine rumorose, ma mappe riproducibili della disfunzione della rete PPI rilevante per la malattia.

Per valutare il panorama funzionale catturato dal set di dati dfPPI della Figura 3D, abbiamo eseguito l'analisi dell'arricchimento utilizzando g:Profiler⁴² (Figura 3E). I risultati dimostrano una solida copertura di annotazioni in tutte le principali ontologie funzionali, tra cui il processo biologico di ontologia genica (GO-BP), la funzione molecolare (GO-MF) e la componente cellulare (GO-CC), nonché risorse di percorso curate come Reactome, KEGG e WikiPathways. Questa analisi rappresentativa illustra un punto di forza chiave dell'approccio dfPPI: la sua capacità di rivelare associazioni di percorsi biologicamente significative tra diversi tipi di annotazione, anche da campioni di dimensioni relativamente piccole. L'ampia copertura di Reactome osservata qui riflette probabilmente il fatto che dfPPI si basa sul ricablaggio a livello di interazione e cattura dei cambiamenti di reti proteiche che mappano direttamente su processi multicomponente e cascate di segnalazione, che sono ben rappresentate nella struttura di Reactome. Poiché dfPPI sfrutta i cambiamenti nella connettività piuttosto che nell'espressione, è particolarmente adatto per rilevare cambiamenti funzionali a livello di sistema che potrebbero essere persi dalla trascrittomica o dalla proteomica di sola abbondanza. Questa scoperta si allinea con altri lavori in cui Reactome ha costantemente prodotto gli arricchimenti più coerenti e rilevanti per la malattia dai set di proteine derivati da dfPPI 14,15,16,17,18,20,21.

Il reattoma è organizzato attorno a processi e complessi multiproteici (cascate di trasduzione del segnale, moduli del ciclo cellulare, assemblaggi metabolici). Poiché dfPPI arricchisce gli interattori impegnati nell'epicapero, cioè gruppi di proteine che sono funzionalmente co-reclutate in scaffold di malattia, la sua produzione contiene naturalmente moduli di percorso coesivi piuttosto che hit isolati. Questa cattura coordinata produce un'ampia copertura di Reactome ad alta significatività attraverso sottopercorsi e gerarchie correlate. Al contrario, le omiche incentrate sull'abbondanza (trascrittomica; proteomica globale) riportano cambiamenti di espressione, non stati di interazione; l'AP-MS a esca singola o l'etichettatura di prossimità forniscono ai quartieri locali circa un'esca ingegnerizzata alla volta; e la reticolazione/co-frazionamento spesso forniscono una connettività scarsa. Nessuno di questi, da solo, produce abitualmente gli insiemi selezionati dal contesto a livello di sistema che dfPPI restituisce da una singola cattura endogena in cellule o tessuti. Il risultato è un arricchimento del percorso che è sia ampio (si accendono più rami del Reattoma) che meccanicisticamente coerente (le proteine si spostano insieme perché le loro interazioni, non solo le loro quantità, sono ricablate dagli epicaperomi). Tuttavia, notiamo che dfPPI è complementare, non un sostituto: ogni metodo interattomico ha punti di forza e limiti distinti, e la scelta ottimale (o combinazione) dovrebbe essere guidata dalla questione biologica, dai vincoli del campione e dalla risoluzione richiesta.

Insieme, questi risultati confermano che il protocollo produce set di dati riproducibili e biologicamente informativi che possono essere utilizzati per scoprire il rimodellamento differenziale dell'interattoma tra stati patologici o perturbazioni sperimentali. L'output dfPPI è adatto per l'integrazione con i framework di arricchimento dei percorsi e consente la mappatura di eventi di ricablaggio funzionale non rilevabili dai metodi standard basati sull'abbondanza.

Figura 1: Panoramica della piattaforma dfPPI. (A) La piattaforma dfPPI (dysfunctional Protein-Protein Interactome) consente l'identificazione di disfunzioni della rete PPI specifiche per la malattia attraverso un flusso di lavoro chemioproteomico. La sezione 1 prevede la preparazione del campione e la cattura dell'interattoma utilizzando sonde chimiche mirate all'epicaperoma immobilizzate su matrici di affinità (ad esempio, perline di PU). Le sezioni 2 e 3 delineano due flussi di lavoro di digestione compatibili, su perlina o in gel, seguiti da LC-MS/MS senza marcatura per l'identificazione dell'interattoma. Le analisi computazionali, tra cui la modellazione statistica e l'arricchimento dei percorsi, vengono eseguite utilizzando la pipeline bioinformatica dfPPI, che non è coperta da questo protocollo ma è disponibile gratuitamente all'https://epichaperomics.mskcc.org/. (B) Principio del dfPPI. In contesti rilevanti per la malattia, gli epicaperomi endogeni formano scaffold supramolecolari che riorganizzano le reti PPI. Le sonde chimiche dirette verso l'epicaperoma (ad esempio, perle di PU o equivalenti) catturano questi scaffold insieme ai loro interattori legati direttamente da cellule intatte o da lisati nativi, producendo un pull-down multi-esca in un singolo esperimento. I controlli abbinati (ad es. controllo del cordone inerte e/o competizione con sonda libera) possono essere elaborati in parallelo. Il materiale catturato viene eluito e digerito su perline o in gel, analizzato mediante LC-MS/MS e quantificato le proteine (intensità o conta spettrale MS/MS). L'interattoma risultante viene utilizzato per calcolare gli interattori differenziali tra le condizioni e per eseguire l'arricchimento di pathway/rete, rivelando la disfunzione PPI specifica del contesto a livello di sistema. Il flusso di lavoro non richiede marcatura genetica o sovraespressione, è compatibile sia con le cellule che con i tessuti e si adatta agli studi di coorte. Al contrario, la tradizionale MS di affinità-purificazione si concentra su un'esca etichettata alla volta, producendo un vicinato locale per costrutto e richiedendo tipicamente molti costrutti/esecuzioni per campionare una rete. Al contrario, dfPPI utilizza epicaperomi endogeni come esca, catturando molti PPI disfunzionali contemporaneamente dal sistema nativo, il che accelera la scoperta del ricablaggio della rete specifico per la malattia e fornisce letture a livello di percorso da una singola cattura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Validazione del lotto di perline di PU e specificità di cattura. (A) Specificità biologica e coerenza tra lotto. Le cellule MDA-MB-468 (epicapero-alto) e ASPC1 (epicapero-basso) sono state lisate in tampone nativo (20 mM Tris, pH 7,4; 20 mM KCl; 5 mM MgCl₂; 0,01% NP-40; inibitori della proteasi/fosfatasi). Per ogni cattura, 40 μL di liquame di perle di PU sono stati incubati con 250 μg di proteine totali (1 μg/μL) per 3 ore a 4 °C con rotazione. Le perle venivano lavate in tampone nativo; i complessi sono stati denaturati/eluiti in ~100 μL di tampone campione SDS. 5-10 μL di ciascun eluato sono stati risolti mediante SDS-PAGE e immunocolorati per HSP90, HSC70 e HOP. I lisati in ingresso sono mostrati come riferimento. Due lotti di perline PU (Lotto 1, fresco; Il lotto 2, invecchiato) produce un forte arricchimento in MDA-MB-468 e un segnale minimo in ASPC1, dimostrando una specificità preservata e una coerenza del lotto. (B) Carico globale rispetto alle perline di controllo. I lisati MDA-MB-468 sono stati lavorati come in (A) con perline di PU o con perline di controllo abbinate. Sono stati caricati ~20 μL di ciascun eluato, separati da SDS-PAGE e colorati con Coomassie. Le perle in PU recuperano una caratteristica complessa del carico ad alto MW degli assemblaggi legati all'epicapero, mentre le perle di controllo mostrano uno sfondo minimo. Sono indicati i marcatori di peso molecolare (kDa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati rappresentativi della cattura di affinità dfPPI, dell'identificazione degli interattomi e delle analisi bioinformatiche. (A) Gel SDS-PAGE colorato con Coomassie di proteine eluite da acquisizioni di affinità con perline di PU di interattomi legati all'epicaperoma da quattro campioni rappresentativi di cervello umano (PT1-PT4). Gli assemblaggi proteici legati a perline sono stati denaturati mediante ebollizione nel tampone del campione SDS, risolti mediante SDS-PAGE e colorati per valutare il recupero dell'interattoma attraverso i pesi molecolari. Ogni campione è stato caricato in una corsia separata, con una corsia vuota tra i campioni per ridurre al minimo la contaminazione incrociata; Un debole segnale osservato occasionalmente in queste corsie vuote riflette una minore fuoriuscita del campione durante l'elettroforesi. Questi gel sono rappresentativi dei campioni inviati alla struttura MS, dove ogni corsia è stata sezionata in cinque fette per la digestione in gel e l'identificazione delle proteine mediante MS. (B) L'analisi delle componenti principali (PCA) delle intensità proteiche identificate da interattomi epicapolema digeriti su perle da otto campioni rappresentativi di cervello murino (eseguiti in duplicato) rivela uno stretto raggruppamento di repliche tecniche e una chiara separazione biologica lungo PC1 e PC2. Ciò conferma l'elevata riproducibilità tecnica e la varianza biologica sufficiente per un'analisi dfPPI robusta. La struttura dei dati dimostra che le differenze a livello di interazione, non gli artefatti tecnici, guidano la separazione dei campioni, fornendo una solida base per la modellazione dell'interattoma differenziale a valle senza richiedere una normalizzazione artificiale. (C) Le distribuzioni del coefficiente di variazione (CV) per le intensità degli ioni precursori negli otto gruppi di campioni mostrano una varianza costantemente bassa, con CV mediane che vanno dal 9,7% all'11,9% (indicate da linee tratteggiate verticali). Questi bassi CV evidenziano la riproducibilità e la robustezza della pipeline di rilevamento e quantificazione della MS. La coerenza supporta l'uso di valori grezzi di intensità o MS/MS come input affidabili per l'analisi dfPPI, dove la varianza nella forza di interazione - non l'espressione proteica globale - è il segnale biologico di interesse. (D) Mappa termica di clustering gerarchico dei valori di intensità proteica trasformati log₂ in tutti i campioni (con duplicati tecnici mostrati). I campioni si raggruppano per origine biologica piuttosto che replicarsi, confermando una robusta cattura degli interattomi legati all'epicaperoma e la conservazione della varianza biologicamente rilevante. L'ampio intervallo dinamico e il rilevamento coerente tra le proteine supportano ulteriormente la qualità del set di dati per l'analisi dfPPI. La barra della scala rappresenta i valori di intensità proteica trasformati in log₂, compresi tra 2 (blu, bassa abbondanza) e 14 (giallo, alta abbondanza). (E) Grafico di Manhattan dell'analisi dell'arricchimento del pathway eseguita su proteine differenzialmente interagenti identificate da dfPPI. L'arricchimento è stato condotto utilizzando g:Profiler e i termini significativi sono tracciati da −log₁₀ (p-value), colorati dalla fonte di annotazione: GO Molecular Function (GO:MF), GO Biological Process (GO:BP), GO Cellular Component (GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways, e Human Phenotype Ontology (HP). Questo output rappresenta l'utilità principale di dfPPI: scoprire percorsi funzionali biologicamente significativi perturbati attraverso il rimodellamento dell'interattoma guidato dall'epicapero. L'ampia copertura delle annotazioni sottolinea le informazioni a livello di sistema ottenibili attraverso questo approccio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Metodo	Cosa cattura	Principali punti di forza	Limitazioni principali	Uso tipico	Scalabilità (coorti)
AP-MS (purificazione di affinità–MS)	Interattori diretti/quasi diretti di una singola esca	Elevata specificità; quantitativo; ottimo per composizioni complesse	Richiede esca/tag/anticorpo; un'esca alla volta; può mancare transitorio/debole	Definire i partner di una proteina di interesse	Basso-moderato (sono necessarie molte esche)
Etichettatura di prossimità (ad es. varianti BioID/APEX)	Proteine nelle vicinanze di un'esca su scala nanometrica nel tempo	Cattura i vicini transitori/deboli; funziona nelle cellule viventi	Ingegneria genetica; etichettatura fuori bersaglio; pesante per i parametri	Mappe dei quartieri locali; Dinamiche	Basso-moderato (ingegneria per esca)
XL-MS (reticolazione MS)	Prossimità/contatti spaziali all'interno/tra le proteine	Vincoli strutturali; Cattura i contatti transitori	Analisi complessa; minore ampiezza del proteoma; specifico per il campione	Topologia strutturale/contestuale	Basso (specializzato)
Co-frazionamento/MS (CF-MS)	Co-eluizione di assemblaggi nativi	Nessuna etichettatura; Assembly nativi	Laborioso; inferenza complessa; sensibilità limitata	Panorama complesso globale	Moderato
CETSA/TPP	Profili di co-stabilità/co-aggregazione	Senza etichetta; condizioni native	Indiretto per gli IPP; Vincoli di solubilità	Target engagement; Spostamenti termici	Moderato
dfPPI (epicaperomica)	Ricablaggio dell'interazione a livello di rete catturato da epicapeomi endogeni come esche multiplex	Endogeno; nessuna etichettatura; una cattura interroga migliaia di PPI disfunzionali; letture di percorsi/reti; compatibile con i tessuti; Adatto alle coorti	Applicabile solo al contesto della malattia; sonde specializzate (perline in PU, YK5-B); Non destinato alla scoperta di complessi generici	Rimodellamento dell'interattoma malattia-contesto, prioritizzazione dei pathway, generazione di ipotesi	Alto (centinaia di campioni possibili)

Tabella 1: Confronto tra gli approcci di mappatura PPI e dfPPI. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Impostazioni dei parametri Full Spectronaut. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il protocollo qui descritto consente la mappatura di PPI disfunzionali in campioni biologici nativi utilizzando la piattaforma dfPPI. A differenza dei metodi tradizionali che deducono la disfunzione dall'abbondanza o dai cambiamenti di espressione, questa piattaforma cattura il ricablaggio della rete a livello strutturale isolando gli interattori specifici della malattia attraverso la purificazione dell'affinità con sonde mirate all'epicapero, seguita da una SM quantitativa basata sull'intensità senza marcatura. Sebbene l'attuale applicazione si concentri sul tessuto cerebrale post-mortem, il metodo è ampiamente applicabile ad altri tipi di campioni e modelli di malattia, comprese le cellule coltivate e i tessuti provenienti da modelli di cancro, neurodegenerazione e disfunzione immunitaria 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI si basa su sonde che selezionano cineticamente gli epicaperomi e intrappolano gli assemblaggi con i loro interattori legati. Le perle di PU (derivate da chemiotipi leganti epicaperomi come PU-H71/PU-AD) coinvolgono gli epicapeomi nucleati da HSP90 in modo non covalente ma con un lungo tempo di permanenza, un segno distintivo della selettività cinetica per la conformazione dell'epicaferomo rispetto ai complessi chaperoni convenzionali²³. YK5-B è una sonda covalente biotinilata diretta verso HSC70 all'interno degli epicaperomi e che consente la cattura all'interno della cellula prima della lisi e preserva i PPI endogeni¹⁷. La selettività deriva da PTM associati alla malattia che rimodellano le conformazioni HSP90/HSC70 e la chimica tascabile e stabilizzano gli assemblaggi di epicapero 14,23,43,44; questi cambiamenti producono un legame k_off lento e ad alta affinità per le sonde non covalenti di tipo PU⁴⁵ (e consentono la cattura covalente con YK5-B diretto da HSC70), trattenendo così cineticamente i complessi epicaperomi e co-isolando i loro interattori diretti e indiretti per LC-MS/MS. In pratica, le perle di PU sono ottimali per i flussi di lavoro lisato/omogeneizzato, mentre YK5-B supporta la cattura di cellule vive; entrambi mantengono assembly dipendenti dal contesto che possono essere identificati da LC-MS/MS e utilizzati per l'analisi dfPPI a valle.

Per la dfPPI, è necessaria un'esperienza specializzata in chimica per sintetizzare le sonde di cattura. Tuttavia, questo requisito non è esclusivo del dfPPI: i metodi PPI ampiamente utilizzati (AP-MS, marcatura di prossimità, XL-MS) si basano anche su competenze specialistiche, ad esempio clonazione/ingegnerizzazione di esche etichettate, generazione stabile di linee cellulari, ottimizzazione della marcatura/reticolazione e complesse pipeline bioinformatiche. Al contrario, dfPPI evita la manipolazione genetica e la sovraespressione dell'esca, opera direttamente su cellule o tessuti nativi (compresi gli scarsi campioni biologici clinici) e utilizza flussi di lavoro standard di acquisizione di affinità e LC-MS già di routine nei nuclei di proteomica. Per ridurre le barriere all'adozione, il laboratorio di Chiosis offre tramite MTA perline in PU convalidate e perline di controllo abbinate, mentre le fasi di manipolazione/QA sono completamente specificate nelle fasi 1.3 e 1.4. Infine, l'analisi è supportata da un'app dfPPI basata sul web che implementa le statistiche richieste e le letture di percorso/rete, riducendo il carico bioinformatico (ad esempio, per gli utenti senza background di codifica e solo competenze bioinformatiche di base).

AP-MS, XL-MS, etichettatura di prossimità, co-frazionamento e CETSA/TPP rispondono a domande diverse (leganti diretti, prossimità spaziale, etichettatura di quartiere, co-assemblaggio o co-stabilità termica). dfPPI è il metodo di scelta quando l'obiettivo è mappare il ricablaggio endogeno e dipendente dal contesto nella malattia, specialmente nei tessuti nativi o in grandi coorti cliniche in cui il tagging genetico non è fattibile e quando si desiderano letture a livello di percorso/rete da una singola cattura. dfPPI utilizza gli epicaperoi come esche multiplex per catturare i cambiamenti di interazione coordinata tra molte proteine in un unico pull-down, consentendo l'identificazione scalabile di LC-MS/MS e l'analisi incentrata sul percorso dal materiale primario. In pratica, dfPPI può seminare a valle, una validazione focalizzata sull'esca (ad esempio, AP-MS su nodi specifici), mentre i metodi tradizionali possono perfezionare la topologia (contatti diretti, vincoli spaziali) per complessi evidenziati da dfPPI. Vedere la Tabella 1 per un confronto fianco a fianco.

Diversi passaggi critici influenzano il successo del flusso di lavoro. Innanzitutto, gli estratti proteici di alta qualità sono essenziali. Ciò richiede un'attenta manipolazione di tessuti o cellule, idealmente congelati a scatto e conservati a -80 °C, per ridurre al minimo la proteolisi e preservare i complessi nativi. L'inclusione di inibitori sia della proteasi che della fosfatasi non è negoziabile: l'integrità dell'epicaveroma, che funge da "esca" funzionale in questo test, dipende da specifiche modifiche post-traduzionali di componenti fondamentali come HSP90 ^23,43. Ad esempio, la fosforilazione di Ser226 e Ser255 è essenziale per stabilizzare la conformazione dell'epicaveero e preservare la sua funzione di impalcatura²³. L'omissione di inibitori della fosfatasi rischia il collasso strutturale e la perdita di specificità biologica.

Un altro fattore determinante è la qualità e la maneggevolezza della matrice di affinità PU-beads. Le perle devono essere conservate in isopropanolo al 100% a -20 °C e utilizzate entro una finestra di attività definita, idealmente entro 1-2 anni. L'attività deve essere convalidata prima di esperimenti critici, poiché le perle invecchiate possono mostrare una ridotta capacità di legame o un aumento delle interazioni aspecifiche. Anche il tempo di incubazione e l'input proteico devono essere ottimizzati: l'incubazione eccessiva può aumentare il fondo, mentre l'input proteico insufficiente può compromettere la profondità di rilevamento. Si consigliano incubazioni di 3 ore e pull-down pilota per calibrare l'input appropriato per ogni tipo di campione.

Due strategie di digestione sono compatibili con questo protocollo: on-bead e in-gel. Sebbene entrambi i flussi di lavoro producano risultati riproducibili, ognuno offre dei compromessi. La digestione in gel può introdurre contaminanti come la cheratina e richiede ulteriori passaggi di manipolazione. La digestione su cordone semplifica il flusso di lavoro ed è generalmente preferita quando la produttività del campione o la quantità di input sono limitanti. Tuttavia, le quantità di proteasi devono essere calibrate in base all'input proteico totale: sebbene il metodo sia progettato per 750 ng di tripsina, può verificarsi una digestione incompleta se i livelli proteici sono elevati, portando a mancate scissioni e a un ridotto recupero dei peptidi. Si consiglia di valutare l'efficienza della digestione e regolare di conseguenza l'input enzimatico. Tutte le fasi della digestione devono essere eseguite in provette a basso legame utilizzando reagenti appena preparati e privi di contaminazioni per garantire la coerenza e ridurre al minimo lo sfondo.

Il carico di proteine per iniezione di LC-MS dipende dal flusso di lavoro di cattura, dalla resa peptidica e dalla capacità della colonna. Per i digest su microsfere analizzati su colonne nano-LC C18 standard (~50-75 μm ID, ~15-25 cm), in genere carichiamo 300-500 ng per iniezione; Non abbiamo osservato miglioramenti delle prestazioni superiori a ~400-500 ng, mentre carichi più elevati rischiano la soppressione degli ioni e l'allargamento dei picchi. Per i flussi di lavoro in-gel (ad esempio, cinque fette per corsia), generalmente iniettiamo ~25% del materiale desalinizzato per fetta per replica e conserviamo ~50% come backup per la reiniezione, se necessario. In tutti i casi, misurare la concentrazione di peptidi prima dell'iniezione, verificare la risposta lineare con un digest QC e regolare il carico in modo da mantenere la forma del picco cromatografico e la profondità di identificazione senza sovraccarichi.

La quantificazione senza marcatura tramite DIA è ampiamente utilizzata in proteomica grazie alla sua riproducibilità e profondità⁴⁶. Tuttavia, nel contesto di esperimenti di cattura di affinità come questo, in cui l'obiettivo è identificare le proteine che interagiscono con gli scaffold dell'epicaveeroma piuttosto che misurare l'abbondanza proteica globale, le strategie di normalizzazione come MaxLFQ non sono appropriate. Questi approcci presuppongono un input uniforme e una somiglianza a livello di proteoma, che vengono violati dalla fase di arricchimento intrinseca a questo protocollo. Invece, i valori di intensità o le conte spettrali MS/MS forniscono una quantificazione sufficiente e biologicamente significativa per l'analisi funzionale a valle. Queste metriche riflettono la forza o la frequenza di interazione relativa delle proteine con gli epicaperoi in tutte le condizioni. Come dimostrato in studi precedenti 16,17,18,20, questi valori sono adatti per analisi interattomiche a livello di sistema come il dfPPI, che identificano percorsi biologici alterati senza fare affidamento sulla normalizzazione dell'intero proteoma. Preservando la vera varianza biologica introdotta dalla malattia o dal trattamento, la quantificazione basata sull'intensità o sulla MS/MS consente una mappatura accurata e robusta delle disfunzioni della rete PPI.

Sebbene l'acquisizione dell'affinità riduca lo spazio di ricerca rispetto all'intero lisato, i pull-down dfPPI contengono ancora centinaia di migliaia di proteine che coprono un ampio intervallo dinamico, oltre a un background co-arricchito. Per i confronti su scala di coorte, la selezione stocastica dei precursori di DDA porta a valori mancanti run-to-run e a un campionamento variabile degli interattori a bassa abbondanza¹⁸. La DIA frammenta sistematicamente tutti gli ioni in finestre predefinite, fornendo una maggiore profondità, un minor numero di valori mancanti e proprietà di riproducibilità più elevate da una corsa all'altra, che sono cruciali quando l'inferenza a valle è a livello di percorso/rete piuttosto che a singola proteina. Questo è il motivo per cui standardizziamo su DIA per dfPPI.

Come per tutti i metodi di cattura dell'affinità, il legame non specifico con le proteine è una considerazione intrinseca. Le proteine possono essere trattenute a causa della viscosità della resina, dell'elevata abbondanza o dell'aggregazione. Sebbene tali interattori non specifici possano comparire nell'eluato a discesa, la loro presenza non compromette l'obiettivo analitico a valle del presente protocollo¹⁷. Il flusso di lavoro dfPPI non è progettato per definire le interazioni binarie, ma piuttosto per estrarre modelli di ricablaggio PPI a livello di sistema. Le analisi di arricchimento funzionale vengono eseguite su interattori differenziali e sfruttano le statistiche basate sulla rete per rivelare alterazioni coordinate a livello di percorso. Come dimostrato nel precedente lavoro¹⁷, questo approccio a livello di sistema minimizza l'impatto delle proteine non specifiche isolate e consente di far emergere solide conclusioni biologiche dai dati a livello di coorte.

Rispetto agli approcci convenzionali di mappatura degli interattomi, come la co-immunoprecipitazione, la marcatura di prossimità o la reticolazione, la piattaforma dfPPI offre un netto vantaggio: cattura il rimodellamento funzionale dell'interattoma in condizioni rilevanti per la malattia senza richiedere l'ingegneria dell'esca o la sovraespressione. Poiché il metodo isola i complessi proteici formati attorno agli epicaceromi supramolecolari, rileva gli assemblaggi proteici emergenti che non sono presenti nei sistemi sani, consentendo la scoperta di nuovi driver di malattia. L'approccio è scalabile e adattabile a tessuti, specie e stati patologici e ha già fornito intuizioni uniche sul rimodellamento del proteoma nel cancro e nella neurodegenerazione. In quanto tale, questo metodo offre un potente strumento per scoprire le reti funzionali interrotte nelle malattie umane.

Al di là degli esempi qui, dfPPI è ben posizionato per (i) ampie coorti cliniche per stratificare i pazienti in base alla disfunzione di rete e scoprire biomarcatori farmacodinamici che riportano l'impegno del bersaglio e la correzione del percorso; (ii) campionamento longitudinale (ad esempio, pre/post terapia, stadiazione della malattia) per tracciare le traiettorie di ricablaggio e prevedere i responder; (iii) integrazione con fosfoproteomica e altre omiche PTM-aware per collegare i cambiamenti dello stato di interazione alla segnalazione a monte; (iv) catture spazialmente risolte da regioni microdissezionate (interfacce tumore-normali, sottoregioni cerebrali) per mappare la patobiologia della rete locale; (v) schermi di perturbazione (genetici o composti) in cui le letture dfPPI nominano nodi utilizzabili e meccanismi di azione; e (vi) modellazione grafica/AI che apprende le caratteristiche di rete specifiche della malattia dalle mappe dfPPI per la prognosi e la progettazione terapeutica. Dal punto di vista metodologico, la miniaturizzazione, l'automazione (ad esempio, i formati a 96 pozzetti) e il controllo qualità standardizzato consentiranno pipeline ad alto rendimento per studi traslazionali e sperimentazioni cliniche. Infine, i risultati di dfPPI possono seminare follow-up mirati - AP-MS, XL-MS o marcatura di prossimità - per risolvere la topologia dei moduli prioritari, sottolineando la complementarità del metodo all'interno del toolkit interattomico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M6250	Tossico, Ardente
Acetonitrile (ACN) Optima	Fisher Scientific	A955-1	Grado LC/MS (Infiammabile)
Mezzi di cromatografia ad affinità attivati Affi-Gel 10	Bio-Rad	1536099	Usata per produrre perle in PU e perle di controllo (infiammabili)
Bicarbonato di ammonio (ABC)	Sigma-Aldrich	09830-500G
Colonna UHPLC Aurora Ultimate 25x75 C18	IonOpticks	AUR3-25075C18-CSI
Film autoradiografico	EWEN-PARKER X-RAY CORP	EBA45	Alternativa per il rilevamento del segnale chemiluminescente dopo il Western blot
Microomogeneizzatore dei tessuti Biomasher	DWK Kimble Scienze della Vita	7496250010	Utilizzato per omogeneizzare tessuto cerebrale congelato per l'estrazione proteica
Blu di bromofenolo	Bioreagente Fisher	BP115-25
Centrifuga per tubi da 1,5 mL	Eppendorf	5424
Centrifuga per tubi da 1,5 mL	Eppendorf	5417R	Con controllo della temperatura
Centrifuga per tubi da 15-50 mL	Eppendorf	5810R	Uso per tubi conici
Sistema di imaging ChemiDoc MP	Bio-Rad	17001402	Usato per la densitometria gel/blot
Forno a colonna	Sonation GmBH, Germania	ES071/ES072	Mantiene la colonna nanoLC a 50 ° C per una ritenzione costante
Tubi conici (15 mL)	Fisher Scientific	352096
Sfere di controllo	Laboratorio Chiosis	N/A	Taldone et al. (PMID:  21459002)
Colorazione Coomassie G-250 (Bio-sicura)	Bio-Rad	1610786
Tubi Eppendorf scuri (1,5 mL)	USA Scientific	1415-2507
Ditiotreitolo (DTT)	Roche	10197777001	Irritante
Facile nLC 1000	Thermo Fisher Scientific	Facile nLC 1000	Sistema LC utilizzato con Q Exactive HF
Dischi di estrazione in fase solida Empore	Compagnia 3M	2215-C18 (Ottadicelo)	Utilizzato per preparare gli StageTips per la desalinizzazione dei peptidi; Attivato con metanolo al 100%
Kit di chemiluminescenza avanzata (ECL)	Thermo Fisher Scientific	32209
Tubi Eppendorf (1,5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Acido Formico (FA) Optima	Fisher Scientific	A117-10X1AMP	Grado LC/MS
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)	Gruppo BIIT-Tartu & Uuml; likool	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	Arricchimento dei percorsi
Glicerolo	Bioreagente Fisher	BP229-1	Grado in biologia molecolare
Glicina	Bioreagente Fisher	BP381-5	Polveri cristalline
Anticorpo secondario coniugato HRP anti-topo (RRID: AB_2619742)	Sothern Biotech	1030-05	Secondario per l'anticorpo H90-10
Anticorpo secondario anti-coniglio coniugato HRP (RRID: AB_2632593)	Sothern Biotech	4010-05	Secondario per l'HSP90 e alpha; e anticorpi HOP
Anticorpo secondario HRP coniugato contro il topo (RRID: AB_2716837)	Sothern Biotech	3030-05	Secondario per l'anticorpo HSC70
Shaker orbitale riscaldato	Eppendorf	ThermoMixer C (2231001127)
HeLa protein digest standard-Pierce	Thermo Fisher Scientific	88329	Utilizzato per la valutazione del controllo qualità del LC-MS
Anticorpo HOP (RRID: AB_10828378)	Segnalazione cellulare	5670	Per il controllo qualità delle perle in PU
Anticorpo HSC70 (RRID: AB_10617277)	Enzo	SPA-815	Per il controllo qualità delle perle in PU
Anticorpo HSP90 (H90-10) (RRID: AB_854214)	StressMarq	SMC-107	Per il controllo qualità delle perle in PU
Anticorpo alfa HSP90 (RRID: AB_303423)	Abcam	Ab2928	Per la normalizzazione secondo la Sezione 1.2
Linea cellulare umana: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	Linea cellulare di controllo, epichaperoma basso/accompagnatore alto
Linea cellulare umana: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	Linea cellulare di controllo, epichaperoma alto/accompagnatore alto
ImageJ (v1.54p)	Wayne Rasband	https://imagej.net/ij/	Densitometria
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Tossico
Tubi microcentrifughe a basso legame proteico	Sarstedt	72.706.600
Lys-C proteasi	Promega	VA1170	Grado LC/MS
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	63068	Grado in biologia molecolare
MaxQuant (v2.1.1.0)	Istituto Max-Planck di Biochimica	https://www.maxquant.org/	Workflow MaxDIA per l'identificazione di peptidi/proteine e la quantificazione basata sull'intensità senza marcatori
Metanolo	Fisher Chemical	A454-4	Grado HPLC, infiammabile, tossico
Mini compressa cocktail per inibitori della proteasi (Completa)	Roche	4693124001
Mini Trans Blot Cellula di Trasferimento Elettroforetica	Bio-Rad	1703930
Mini-gel per electroforesi & nbsp;	Thermo Fisher Scientific	A25977	Usato per gel prefabbricati Novex
Cellula di elettroforesi verticale tetra mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658004	Utilizzato per gel proteici prefabbricati Mini-PROTEAN o gel colati a mano
Mini-PROTEAN  TGX Precast Protein Gels (4– 20%)	Bio-Rad	4561094
NanoDrop	Agilent	BioTek Sinergia H1	Utilizzato per stimare la concentrazione peptidica prima dell'iniezione di LC-MS
NanoElute 2	Bruker	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	Utilizzato nel flusso di lavoro diaPASEF
Sorgente Nanospray Flex	Thermo Fisher Scientific	ES071	Per l'accoppiamento ESI nanospray
Nuovo obiettivo PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P	New Objective Inc.	PF360-75-10-N-5	Riempito con una pasta C18 fino a 20 cm di lunghezza
Membrana di nitrocellulosa	Cytiva Amersham	10600006
Latte crosio scremato	Laboratorio Scientifico	M0841
Gel prefabbricati Novex 8% Tris-Glycine	Thermo Fisher Scientific	XP00080BOX
NP-40	Roche	11754599001
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	10010023
Compressa cocktail per inibitori della fosfatasi PhosSTOP	Roche	4906837001
Kit di analisi proteica Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific	23225
Contenitori di plastica	Fisher Scientific	FB0875711A
Oscillatore a piattaforma	Corning	6705
Cloruro di potassio	Bioreagente Fisher	BP366-1	Cristalli Bianchi
Alimentatore universale PowerPac	Bio-Rad	1645070
Standard Proteico Proteico Proteico Proteico Proteico Prestained Precision Plus	Bio-Rad	1610375
Perle PU-	Laboratorio Chiosis	N/A	Taldone et al. (PMID:  21459002)
Q Spettrometro di massa HF Orbitrap esattivo	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	Utilizzato per DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & micro; m	Dr. Maisch GmbH, Germania	R13.aq	substrati silicei per la separazione peptidica; Miscela di polvere/Metanolo (1:3, v/v)
Unità di rotazione (rotatore end-over-end)	Barnstead  Internazionale	400110
Cartucce Sep-Pak C18 (100 mg)	Waters Corporation	WAT023590
Dodecile solfato di sodio (SDS)	Bioreagente Fisher	BP166-500	Grado di elettroforesi
Sonicator	Branson	2510
Lettore di micropiastre multimodalità SpectraMax Paradigm	Dispositivi molecolari	Paradigma SpectraMax
Spectronaut	Biognosys	https://biognosys.com/software/spectronaut/	Flusso di lavoro directDIA
Concentratore SpeedVac	Thermo Fisher Scientific	Savant SPD111V
Aspirazione a vuoto	Cardinal Health	CDL-65651-320
Spettrometro di massa TimsTOF HT	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	Utilizzato per l'analisi diaPASEF
Ottima dell'Acido Trifluoracetico (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	Grado LC/MS (Corrosivo, combustibile)
Tris	Bioreagente Fisher	BP152-5	Polvere cristallina; Grado in biologia molecolare
Tris, pH 6,8 (1 M)	Teknova	T1068
Tris, pH 7,5 (1 M)	Bioreagente Fisher	BP1757-500	Grado in biologia molecolare
Soluzione salina tris-buffer (20x TBS) tampone	VWR, Scienze della vita	97064-338
Tris-Glycine-SDS (TGS 10x) in funzione con gel buffer	Bioreagente Fisher	BP13414	Elettroforesi
Tripsina	Promega	V5111	Grado di sequenziamento
Tripsina Oro	Promega	V5280
Preadolescenti 20	Bioreagente Fisher	BP337-100
Urea	Sigma-Aldrich	U0631-500G
Vortice	Fisher Scientific	02-215-414
Acqua	Fisher Scientific	W6-1	Grado LC/MS