La Rete di Valutazione Preclinica dell'Ictus Modello Multilaboratorio dell'Ictus Tromboembolico con Trombolisi: TE-MCAo

Sommario

Per simulare l'ictus tromboembolico, sono stati iniettati emboli preparati con sangue di ratto eterologo nell'arteria cerebrale media, seguiti dalla somministrazione di trombolisi sistemica per la ricanalizzazione. Questa versione del modello è ottimizzata per l'uso in una rete multi-laboratorio e supporta il test di più candidati terapeutici.

Abstract

I modelli attuali di ictus traslazionale nei roditori inducono l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) utilizzando filamenti di nylon, emboli iniettati, trombomba intraluminale o endotelina-1 perivascolare per simulare l'ictus umano. Tra questi metodi, l'iniezione di tromboemboli seguita da trombolisi imita meglio gli eventi neuroinfiammatori osservati nei pazienti umani e può essere preferibile al metodo del filamento di nylon inerte più diffuso. I modelli tromboembolici standard, utilizzati nei principali laboratori singoli, possono però richiedere tempo, produrre risultati variabili e necessitare di notevole abilità per essere padroneggiati. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un modello MCAo tromboembolico che mira all'occlusione dei vasi e utilizza la trombolisi endovenosa per ottenere la recanalizzazione, parallelamente alla trombolisi sistemica somministrata in scenari clinici. Per ridurre il numero di animali, abbiamo sviluppato un metodo per immagazzinare il sangue degli animali donatori per la successiva preparazione degli emboli per più soggetti. Il nostro utilizzo di microcateteri Doccol prefabbricati semplifica la preparazione e l'iniezione dei trombo caricando i tromboemboli nei microcateteri che vengono poi inseriti nell'arteria carotide interna. Per ottenere la recanalizzazione, abbiamo infuso Tenecteplase per via endovenosa a una dose di 1,5 mg/kg. Per promuovere la riproducibilità, abbiamo preparato e testato sul campo procedure operative standard, video di formazione e workshop pratici di formazione chirurgica. Il modello utilizza un approccio chirurgico standard che dovrebbe essere familiare a tutti i ricercatori che utilizzano il modello ampiamente accettato a filamento di nylon. Il passaggio del microcatetere nell'arteria carotide interna distale, evitando l'arteria pterigopalatica, avviene in modo simile all'inserimento del filamento di nylon. Le valutazioni di recupero e post-ictus possono essere effettuate con protocolli comportamentali, radiografici e istologici tipici. Questo modello offre un approccio pratico, riproducibile e accessibile per i ricercatori che cercano un modello MCAo tromboembolico con ricanalizzazione controllata.

Introduzione

L'ictus è una delle principali cause di morte e disabilità a livello^{mondiale 1}. Molti pazienti traggono beneficio dalla trombolisi endovenosa, e alcuni pazienti selezionati traggono beneficio dalla tromboscimia meccanica. Poiché non tutti i pazienti arrivano in ospedale in tempo per la trombolisi o la trombectomia, e poiché non tutti beneficiano di un recupero completo, rimane una notevole necessità di ulteriori sviluppi di terapie cerebroprotettive aggiuntive o aggiuntive o aggiuntive per la loro parte. Il modello di ictus ischemico nei roditori più diffuso è l'occlusione monofilamentosa dell'arteria cerebrale media (MCA) seguita da una riperfusione completa. Questo modello simula l'occlusione di grandi vasi (LVO), modellando pazienti con ictus di grandi dimensioni che si sottopongono con successo a una trombomia meccanica completa. Tuttavia, questo modello copre una piccola percentuale di ictus clinici. Al contrario, più pazienti subiscono ictus tromboembolici secondari all'aterosclerosi (rottura aterosclerotica in situ o atero-emboli da malattia sistemica), e vengono trattati solo con trombolisi sistemica, che il modello in nylon non riesce a^{replicare 2,3}. Inoltre, il modello MCAo in filamento di nylon manca della cascata infiammatoria associata all'occlusione^{trombotica 4,5}. I modelli animali che impiegano tromboemboli seguiti da somministrazione sistemica di trombolisi rappresenterebbero la fisiopatologia e la biologia di base che si verificano in molti pazienti con^{ictus 4,6}. Finora, tuttavia, i modelli di ictus tromboembolico nei roditori sono noti per essere complessi e difficili da riprodurre. In laboratori isolati con esperti dedicati, un modello tromboembolico può essere ottenuto con una ragionevole riproducibilità. Un modello del genere non si presta facilmente a un uso diffuso, come necessario nei progetti multilaboratorio.

In questo caso, forniamo protocolli dettagliati per un'occlusione tromboembolica dell'arteria cerebrale media aggiornata e standardizzata (TE-MCAo) seguita da un modello di trombolisi sistemica. In particolare, abbiamo semplificato la preparazione del trombo, standardizzato il carico del trombo nei cateteri e validato la scalabilità di questo modello per studi multilaboratorio. Abbiamo sviluppato questo modello per l'uso nella Stroke Preclinical Assessment Network (SPAN). Intendevamo, tuttavia, che il modello fosse utile a qualsiasi rete che intendesse implementare studi preclinici ad alto volume di nuovi trattamenti candidati. Utilizzando il nostro modello standardizzato, siamo riusciti a indurre TE-MCAo in 6 ratti al giorno per ogni sito di studio durante il periodo di studio.

SPAN e reti simili sono cresciute in risposta a ripetuti e continui fallimenti nel tradurre promettenti cerebroprotettivi dal contesto preclinico al successo nella pratica^{clinica 7}. Nel 2019, i National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) hanno avviato SPAN⁸. SPAN mira a selezionare in modo più efficace le potenziali terapie minimizzando i bias attraverso mascheramento centralizzato, randomizzazione e analisi automatizzata e centralizzata degli esiti. SPAN 1 utilizzò il modello a filamento di nylon nelle sue prime due iterazioni perché tutti i laboratori partecipanti lo utilizzavano già, ed era facile da^{implementare 9}. Per modellare più fedelmente molti aspetti della tromboembolia e della trombolisi, SPAN ha cercato di creare il modello TE-MCAo descritto qui. Questo modello sarebbe utile per i chirurghi preclinici che stanno passando dal modello in filamento di nylon al modello TE-MCAo. Raccomandiamo che i laboratori preclinici confermino la presenza di ictus 24/48 ore dopo MCAo (o TE-MCAo) utilizzando una tecnica di imaging, ad esempio risonanza magnetica (MRI).

La Rete SPAN è stata descritta completamente in studi^{precedenti 9}, e tutte le Procedure Operative Standard (SOP) SPAN sono disponibili sul sito web di SPAN. In breve, la rete è gestita da un centro di coordinamento (CC) che si occupa della distribuzione dei farmaci, del controllo della qualità dei dati, della verifica dell'aderenza al protocollo e della comunicazione di rete. Tutte le SOP sono redate dal CC e approvate da un Comitato Direttivo dopo la revisione. In SPAN, tutti i roditori hanno un cartellino auricolare compatibile con codice a barre con risonanza magnetica posizionato all'arrivo nei laboratori di ricerca, e tutti i soggetti sono registrati nel database SPAN Research Electronic Data Capture (REDCap). Gli animali vengono randomizzati dal CC utilizzando tabelle di randomizzazione stratificate per sito e sesso. In SPAN 1 e SPAN 2, sono state studiate terapie presunte per l'efficacia in sei laboratori di ricerca partecipanti. Tutti i farmaci di prova venivano confezionati in fiale identiche, etichettati presso il centro di coordinamento e spediti ai laboratori di ricerca all'inizio del progetto.

Protocollo

Tutti i laboratori SPAN partecipanti, incluso il centro di coordinamento della USC, hanno seguito le linee guida NIH e AAALAC per il trattamento umano ed etico degli animali. L'approvazione dell'IACUC locale è stata ottenuta in tutti i siti.

1. Preparazione del trombo

NOTA: Tutto il sangue e il trombo devono essere gestiti secondo tutte le linee guida istituzionali locali per i rischi biologici. Tutti i materiali che entrano in contatto con il sangue dovrebbero essere smaltiti come rifiuti biopericolosi o, nel caso degli strumenti chirurgici, puliti e disinfettati accuratamente tramite autoclave. Per ridurre l'uso di animali donati di sangue in questo studio, abbiamo sviluppato un metodo per conservare il sangue dei donatori e poi utilizzare il sangue per produrre tromboemboli secondo necessità.

1. Prelevare sangue fresco di donatore da un'arteria in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL o in microtubi pediatrici di etilenediamine tetra-acetico (EDTA), riempiendo solo fino al livello di 500 μL.
   NOTA: Preferiamo la canulazione dell'arteria femorale per i prelievi di sangue, poiché l'arteria femorale ha un diametro luminale grande che permette la cateterizzazione, è bilaterale e consente 2 prelievi separati ed è un intervento chirurgico sopravvissuto per i roditori. Secondo la nostra esperienza, il sangue può essere conservato a 4 °C per 4 settimane.
2. Aggiungi 1 mL di soluzione di_{CaCl 2} (5 mg/mL) a 500 μL del sangue anticoagulato immagazzinato.
3. Immediatamente dopo la inversione dell'anticoagulazione con_{CaCl 2}, aspirare il sangue dal tubo della microcentrifuga in un tubo di PE-50 di 100 cm usando una dolce aspirazione.
   NOTA: Il ritardo causerà coagulazione del sangue prima che possa essere prelevato nel tubo del PE-50.
4. Incubare il tubo avvolto in soluzione salina preriscaldata con fosfato (PBS) a 37 °C per 2 ore in forno da tavolo.
   NOTA: Posizionare la piastra di Petri su una piastra riscaldante aperta produce un risultato incoerente a causa di una distribuzione del calore incoerente.
5. Al termine dell'incubazione di 2 ore, trasferire immediatamente il tubo di PE-50 pieno di sangue a 4 °C per la conservazione. Rimarrà utilizzabile per i prossimi passaggi tra 20 e 72 ore.

2. Caricamento del catetere

1. Collega il tubo in espirale di PE-50 (diametro interno: 0,58 mm) a una siringa da 3 o 5 cc riempita di soluzione salina ed espelle delicatamente il trombo in una piastra di Petri contenente PBS.
   NOTA: Questo potrebbe richiedere una forza considerevole. Trattieni la pressione sul sito di connessione per assicurarti che catetere e siringa non si stacchino all'estrusione. Il catetere PE-50 può essere tagliato in segmenti più piccoli (10-50 cm) se necessario per facilitare l'estrusione.
2. Taglia sezioni di trombo lunghe circa 6 cm con una lametta.
3. Lava ogni segmento di trombo aspirandolo delicatamente in un catetere PE-50 ed espellendolo completamente 5 volte.
4. Successivamente, lava il trombo tirandolo delicatamente in un catetere PE-10 (diametro interno: 0,279 mm) ed espellendolo completamente 15 volte.
   NOTA: Se durante questo passaggio si verificano rotture frequenti, si consideri l'utilizzo dell'ingrandimento con un microscopio chirurgico o una lupa chirurgica per assicurarti che il trombo venga aspirato in linea con l'apertura del catetere.
5. OPZIONALE: Usare il blu di Evan per visualizzare i tromboni
   1. Prepara Evan's Blue al 4% in una soluzione PBS 1x.
   2. Aggiungi 200 μL del blu di Evan al 4% in una piastra di Petri riempita con 10 mL di PBS 1x. Questa sarà la soluzione più concentrata = diluizione blu di Evan #1.
   3. Prendi 400 μL di Evan's Blue Dilution #1 e mescola in una piastra di Petri separata riempita con 20 mL di 1x PBS. Questa è una soluzione diluita di Evan's Blue = Evan's Blue Dilution #2.
   4. Inserisci il coagulo nella soluzione più concentrata di Evan's Blue Petri (diluizione #1) per 1 secondo, poi trasferisci nella piastra di Petri Evan's Blue diluita (diluizione #2).
6. Carica un trombo lavato in microcateteri prefabbricati (diametro interno: 0,2 mm, diametro esterno: 0,360 mm, lunghezza: 300 mm, collegato al blocco Luer femmina) senza emboli d'aria utilizzando il metodo wet-to-wet.
   NOTA: Consigliamo di usare l'ingrandimento (ad esempio, lenti 2,5x) per questo passaggio.
7. Una volta che il trombo è completamente caricato, si estrusce abbastanza trombo in modo che esattamente 5,0 cm rimangano nel microcatetere. Taglia l'eccesso con una lametta.
   NOTA: La lunghezza del trombo carico può essere adattata a diverse applicazioni a seconda della dimensione del brato desiderato.
8. Segna il microcatetere a 16 mm dalla punta, per delimitare l'estensione del catetere che deve essere avanzata intraluminalmente oltre la biforcazione dell'arteria carotide comune.

3. Chirurgia e anestesia animale

1. Indurre anestesia con isoflurano al 4% in miscela ossigeno:protossido di azoto 30:70 e mantenere l'anestesia con isoflurano all'1-2% nella stessa miscela gassosa.
2. Somministrare analgesici carprofene 5 mg/kg sottocutaneamente e atropina 0,05 mg/kg intraperitoneale per mantenere il comfort dell'animale durante l'intervento.
   NOTA: Molti chirurghi infondono il sito dell'incisione con 1,0 mL di bupivacaina (2,5 mg/mL).
3. Mantieni la temperatura corporea a 37 ± 0,5 °C durante tutto l'intervento utilizzando un cuscinetto riscaldante controllato con una sonda di temperatura rettale.

4. Raccolta del sangue dei donatori

1. Raccogliere sangue donato tramite cateterismo arterioso femorale. Confronta il sesso biologico del donatore e dei riceventi.
2. Se il sangue deve essere usato lo stesso giorno:
   1. Prepara tre tubi centrifughe da 1,5 mL. Segna ogni tubo al punto dei 500 μL con una penna da laboratorio indelebile.
   2. Prepara tre serie di tubi PE-50, ciascuno lungo 100 cm, fissati a una siringa da 1,0 mL tramite un ago smussato calibro 23.
3. Se il sangue deve essere conservato per un uso successivo, prepara sei microtubi EDTA pediatrici. Allenta i tappi per facilitarli l'uso in seguito.
4. Prepara un tubo PE-50 lungo 10,0 cm, serrato a un'estremità con una pinza calzata in gomma e smussato all'altra estremità.
   1. Per realizzare una pinza calzata in gomma, inserisci una dentina di una pinza emostatica standard nel tubo PE-100 e rifila per adattarla. Ripetere sull'altro lato.
   2. Per rendere il PE-50 smussato smussato con smussazione, prima si taglia l'estremità con un angolo smussato. Poi taglia la punta del punto bisellato usando microforbici.
      NOTA: È importante rimuovere la punta per evitare perforazioni della parete posteriore dell'arteria dopo l'inserimento, ma se viene rimossa troppa punta, la perdita dell'effetto bisellato renderà molto difficile inserire il catetere intraluminalmente.
5. Esegui un taglio standard sull'arteria femorale.
6. Preparare l'animale (radere l'area interna della coscia), posizionarsi in posizione dorsale sdraica sul tavolo chirurgico. Sterilizza la pelle con 3 lavaggi di etanolo al 70% seguiti da 1 lavaggio con betadine o altra soluzione antisettica.
7. Fissa le zampe posteriori in modo distaccato usando restrizioni morbide.
8. Effettuare un'incisione verticale sulla coscia interna di circa 1,5-2 cm lungo la piega naturale dell'intersezione inguinale con la gamba. Questa incisione sarà ortogonale rispetto al percorso anatomico previsto dell'arteria femorale.
9. Con la dissezione contundente, sezionare con attenzione fino ai vasi femorali. Separare con cura l'arteria femorale dalla vena e dal nervo che corrono nello stesso fascio.
10. Occluse distalmente l'arteria femorale con una legatura di seta 5-0 e si utilizzano le code della sutura per fornire una leggera tensione distale con gli emostati.
11. Schelettizzare l'arteria femorale il più prossimamente possibile, tracciando l'arteria fino alla sua origine retroperitoneale. Posiziona in modo svolto un anello di seta 5-0 intorno all'arteria femorale e usa di nuovo le code per fornire una lieve tensione all'estremità prossimale dell'arteria. Non stringere il nodo di seta a questo punto. Questa tensione provoca l'emostasi dopo la realizzazione dell'arteriotomia.
    NOTA: L'ansa può essere spostata più in posizione prossimale con una pinza per aneurisma.
12. A circa due terzi della distanza dal punto di sutura prossimale, si posiziona un pezzo di punto di seta sotto l'arteria e si fa una piccola arteriotomia distale rispetto al punto sciolto usando microforbici. La sutura allentata verrà fissata per fissare il catetere intraluminale dopo la canulazione.
13. Con una pinza affilata, solleva l'apertura superiore dell'arteriotomia e inserisci il catetere smussato smussato all'interno dell'apertura. Avanza il catetere il più prossimamente possibile.
    NOTA: Potrebbe esserci attrito tra il catetere e la parete interna del vaso. Due cose possono aiutare in questo: 1) rivestire l'esterno dell'estremità del catetere con un liquido sieroso dall'interno della gamba subito prima di introdurlo nel vaso, e 2) usare pinze smussate e scanalate, tenere l'esterno del vaso mentre si avanza contemporaneamente il catetere. Questo impedisce al vaso di avanzare semplicemente insieme al catetere.
14. Una volta che la punta del catetere è stata avanzata quasi fino al punto dell'anello prossimale, si rilascia la tensione dalle code di quella sutura. Il sanguinamento dovrebbe essere prevenuto dalla stretta incastrazione del catetere all'interno del vaso.
15. Avanza il catetere abbastanza in modo che l'anello allentato, una volta stretto, inglobi il catetere. Stringi delicatamente la sutura, assicurandoti che non sia così stretta da occludere il catetere. Inoltre, assicurati che la sutura non sia sulla smussatura del catetere, data la natura affusolata di questo segmento del catetere.
16. Rilascia la pinza calzata in gomma. Il catetere dovrebbe riempirsi immediatamente di sangue.
17. Riempire i tubi aperti delle centrifughe o i microtubi EDTA pediatrici, inserendo non più di 500 μL in uno dei contenitori di raccolta.
18. Una volta riempiti i microtubi, rimuovere il catetere PE-50 dall'arteria femorale, legare l'estremità prossimale e chiudere l'incisione con la sutura interrotta 5-0 prolene.
19. Se in seguito si deve usare il sangue, posizionare i tappi sui tubi EDTA pediatrici pieni e conservarli a 4 °C.
20. Se il trombo deve essere preparato per l'uso nello stesso giorno, procedi al passo 1.2 sopra.
21. Ripeti immediatamente con i tubi centrifughe rimanenti.
22. I donatori di sangue arterioso possono essere restituiti al vivarium dopo il recupero dall'anestesia se è stata eseguita una cateterizzazione unilaterale. L'arteria femorale controlaterale potrebbe essere cateterizzata successivamente, ma dopo la cateterizzazione bilaterale dell'arteria femorale, i donatori dovrebbero essere eutanasiati in conformità con le normative IACUC.

5. TE-MCAo

NOTA: L'approccio TE-MCAo utilizza il taglio standard sull'arteria carotidea comune. La scelta dell'anestesia e dell'approccio a taglio è dipende dall'utilizzatore. Il protocollo qui inizia nel punto in cui il chirurgo ha già isolato l'arteria carotide comune (CCA), l'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria carotide esterna (ECA).

1. Espone il CCA e ritrae con una legatura di seta 3-0. Fai lo stesso per l'ECA e l'ICA.
2. Utilizzando una legatura o cauterizzazione, espone e occlusa l'arteria occipitale.
3. Espone e ritrae o occlusa l'arteria pterigopalatina (PPA).
   NOTA: Con abbastanza esperienza, questo passaggio può essere omesso. Consigliamo di eseguire sempre questo passaggio quando si apprende la procedura.
4. Utilizzando una dolce retrazione, sposta l'ECA e l'ICA in una configurazione a "T".
5. Lega la legatura CCA solo dopo aver completato tutti i passaggi sopra elencati.
6. Fai un'arteriotomia nell'ECA (Zea Longa CCA open^{methodology 10}) usando microforbici.
7. Utilizzando il metodo del bisello smussato descritto nel passo 4.4.2, preparare la punta di uno dei microcateteri già caricati (diametro interno: 0,2 mm, diametro esterno: 0,360 mm, lunghezza: 300 mm, collegato al blocco femmina di Luer).
8. Inserire con cura il microcatetere con il trombo pre-caricato nell'ECA. Allentare il circuito di contenimento dell'ICA e avanzare il microcatetere intracranicalmente a 16 mm nella biforcazione carotide sotto visualizzazione diretta per evitare una canulazione accidentale della PPA extracranica.
   NOTA: Se il catetere preferisce entrare nella CCA, una pressione delicata con un applicatore a punta di cotone appuntita può aiutare a orientare il catetere in avanzamento nell'ICA.
9. Fissa il microcatetere intraluminale a ICA e CCA usando seta 3-0, facendo attenzione a non stringere troppo.
10. Iniettare 20 μL nella siringa da 1 mL con una pompa motorizzata a una velocità di 10 μL/min per una durata di 2 minuti.
    NOTA: Tipicamente, la pompa della siringa non avanza all'inizio finché non si accumula una pressione sufficiente.
11. Iniettare ulteriori 20 μL di soluzione salina sterile utilizzando le stesse impostazioni della pompa.
    NOTA: Durante lo studio del flusso sanguigno utilizzando immagini laser smaculate, abbiamo trovato un successo del 100% con un lavaggio a 20 μL.
12. Rimuovere il microcatetere e legare permanentemente l'ECA con una sutura prossimale al sito arteriotomico. Rimuovi tutti i loop di contenzione. Osserva attentamente eventuali perdite di sangue e fissa con legature aggiuntive se necessario.
13. Chiudi temporaneamente l'incisione cutanea con graffette o una sutura prolene 5-0 in movimento.
14. Togliete l'animale dall'anestesia e mettetelo in una gabbia calda per il recupero.
15. Opzionale: I laboratori possono utilizzare la fluidometria Doppler laser per confermare l'occlusione MCA riuscita a essere risolta. In alternativa, si può ottenere l'imaging a risonanza magnetica a 24 o 48 ore per confermare e quantificare l'infarto cerebrale.
    NOTA: Molti utenti preferiscono somministrare 1,5 mL di soluzione salina o di Ringer lattata in via sottocutanea al termine dell'intervento.

6. Trombolisi sistemica

NOTA: La tenecteplase (TNK, 1,5 mg/mL) può essere acquistata per l'uso come trombolisi sistemica. Gli utenti possono preferire altri agenti litici. Le singole fiale da 50 mg vengono ricostituite con 50 mL di acqua distillata, e poi 2,5 mL vengono accuratamente alquotate in fiale da 3,0 mL. Le aliquote possono essere congelate a -20 °C per un uso successivo. La stabilità dell'attivatore tissutale ricombinante ricostituito del plasminogeno conservato a -20 °C è di 60 giorni^{e 11}.

1. Scongela un aliquota congelato di TNK per ogni soggetto. Scongela a temperatura ambiente per circa 15 minuti.
2. Usando una siringa da 1 cc, preleva esattamente 1,5 mg/kg. Ad esempio, un ratto da 300 g avrà bisogno di 0,45 mg.
3. Ri-anestesia l'animale e rimuovi la chiusura temporanea della pelle.
4. Esponi qualsiasi ramo della vena giugulare esterna.
   NOTA: La vena caudal potrebbe essere utilizzata se il laboratorio è più a suo agio con questa strada. Abbiamo preferito usare la vena giugulare poiché i chirurghi SPAN sono più a loro agio con la mobilizzazione della vena giugulare esterna, e questo avviene di routine nel nostro modello a filamenti.
5. Usando un ago da 30 o 32 G, somministra il TNK tramite puntura diretta nella vena.
   NOTA: All'inizio, gli utenti potrebbero voler isolare la vena tra 3-0 anelli di seta. Con la pratica, questo non sarà più necessario.
6. Chiudi l'incisione con prolene 5-0 interrotto o un'altra sutura non assorbibile.
7. Riporta l'animale nella gabbia di recupero come nel passo 5.14.

7. Metodi statistici

1. Per creare statistiche descrittive, si utilizza media e deviazione standard per dati numerici normalmente distribuiti, e si usa intervalli mediani e interquartili per dati non normalmente distribuiti. Presenta i dati categorici come distribuzioni di frequenza. Per il test di ipotesi, applicare il test t o ANOVA a seconda dei dati parametrici normalmente distribuiti; altrimenti, non effettuare test di ipotesi.

Risultati

Figura 1: Raccolta di sangue da animali donatori e preparazione del trombo. Il sangue veniva prelevato dall'animale donatore tramite cateterismo dell'arteria femorale e trasferito in un tubo microcentrifuga con (può essere conservato fino a 4 settimane) o senza EDTA (uso nello stesso giorno). Per preparare il trombo, è stata aggiunta una soluzione di cloruro di calcio ai tubi sanguigni immagazzinati e immediatamente aspirata in un catetere PE-50. Il tubo in PE-50 avvolto è stato incubato in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata a 37°C per 2 ore in un forno da tavolo. Dopo 2 ore, il tubo di PE-50 riempito di sangue veniva immediatamente trasferito a 4°C per la conservazione. Vedi la sezione 1 del protocollo per maggiori informazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caricamento del trombo nel catetere per l'iniezione. (A) Il giorno dell'intervento MCAo, il trombo è stato estruso dal tubo del PE-50 in una piastra di Petri contenente PBS. (B) Sulla piastra di Petri, il trombo veniva tagliato a circa 6 cm di lunghezza con una lametta. (C) Il trombo veniva lavato con PBS aspirandolo in un tubo PE-50 ed espulso 5 volte, poi in un tubo PE-10 15 volte. (D) Il trombo è stato trasferito in una piastra di Petri contenente una soluzione concentrata di Evan's Blue. (E) Il trombo è stato trasferito in una piastra di Petri contenente soluzione di Evan's Blue diluita e caricato in un microcatetere prefabbricato. (F) Il microcatetere veniva avanzato attraverso l'arteria carotide interna del ratto fino a 16 mm dalla punta del catetere che passava dalla biforcazione carotide dell'arteria carotidea comune e iniettato tramite una pompa a siringa motorizzata. Vedi la sezione 2 del protocollo per maggiori informazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

In uno studio pilota di fattibilità, abbiamo arruolato 135 soggetti in 6 laboratori di ricerca. Sebbene i soggetti siano stati randomizzati in uno degli 8 trattamenti, qui riportiamo dati aggregati solo per illustrare la fattibilità del modello. Su 135 soggetti arruolati, il TNK è stato somministrato alla dose e al momento corretti in 132 (98%). La risonanza magnetica è stata ottenuta 3 giorni dopo TE-MCAo in 102 (75%) a causa della morte di un animale prima della scansione in 33 (24%). La perdita di animali prima del Giorno 3 è stata costante in tutti e 6 i laboratori (Tabella 1), indicando che il modello può essere implementato su più siti. La dimensione media ± SD delle lesioni era del 13 ± 16% (l'area lesionistica include ischemia ed edema come percentuale dell'emisfero ipsilaterale) con una certa variabilità tra i laboratori (Tabella 2). Immagini rappresentative della risonanza magnetica e emboli post-mortem possono essere visti nella Figura Supplementare 1.

	Laboratorio
Variabile	AG	DK	IW	MG	SD	YL
Dimensione del campione (N)	23	30	11	28	24	19
Risonanza magnetica eseguita	19	24	9	23	14	13

Tabella 1: Fattibilità per laboratorio. I laboratori di studio erano Augusta University (AG), Duke (DK), University of Iowa (IW), Massachusetts General Hospital (MG), University of San Diego (SD) e Yale University (YL). Sono mostrati il numero di animali arruolati (N) e il numero che sono sopravvissuti per la risonanza magnetica effettuata al terzo giorno dopo l'ictus. Questi dati supportano la fattibilità del modello.

Sito	Dimensione del campione (N)	Volume della lesione (%) Media ± SD	Indice di Shift Midline (%) Medio ± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	04 ± 19
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

Tabella 2: Volume della lesione osservato nelle risonanze magnetiche del giorno 3, per sito. Per stabilire la riproducibilità del modello in sei siti di studio, sono stati confrontati il volume della lesione (ischemia più edema) e lo spostamento della linea mediana. Il volume della lesione è espresso come percentuale areale dell'emisfero ipsilaterale. Lo spostamento della linea mediana è espresso come la percentuale lineare della larghezza massima dello spazio intracranico. I dati confermano l'eterogeneità tra i laboratori.

Figura supplementare 1: Immagini rappresentative. (A-E) Varie immagini multi-eco, multi-scansione (MEMS) di cervelli di ratti scattate 48 ore dopo TE-MCAo. Le sezioni sono circa 1 mm anteriori al bregma. (F-J) Diversi esempi di emboli all'origine MCA. Clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

Abbiamo perfezionato il modello tromboembolico del roditore dell'ictus ischemico per l'uso in una rete di test preclinici multilaboratorio, SPAN. Abbiamo ridotto notevolmente il numero di animali utilizzati sviluppando un metodo per conservare il sangue dei donatori per un uso successivo. Abbiamo anche semplificato la preparazione dei tromboemboli e l'approccio chirurgico per facilitare l'esecuzione di diverse procedure MCAo in un solo giorno. La nostra intenzione è che il TE-MCAo raggiunga gli stessi livelli di comfort e volumi chirurgici possibili con la versione in filamento di nylon molto utilizzata del MCAo. Per raggiungere questo risultato, abbiamo organizzato due workshop di formazione in presenza per chirurghi e tutti i chirurghi coinvolti in questo studio avevano già diversi mesi, se non anni, di esperienza con il modello a filamento più standard. Abbiamo dimostrato fattibilità in sei diversi laboratori di ricerca e dimostrato un'eccellente conformità al protocollo.

Nel scegliere di implementare questo protocollo, un investigatore dovrebbe considerare i seguenti elementi che determinano il successo del protocollo. Innanzitutto, una cura scrupolosa nella raccolta del sangue influenzerà la formazione efficace del trombo. Il sangue arterioso, non venoso, dovrebbe essere raccolto per evitare coagulazioni precoce. In secondo luogo, è importante raccogliere più sangue di quanto sembri necessario. A volte un esemplare non si trombizza durante la notte, mentre gli altri sì. In terzo luogo, raccomandiamo fortemente che il carico del catetere venga effettuato tramite ingrandimento ottico, sia con lenti d'ingrandimento con frontale che con lente d'ingrandimento con illuminazione. In quarto luogo, è essenziale una dissezione cauta e attenta di CCA, ICA ed ECA per evitare lacerazioni e trombosi intravascolare. Inoltre, è essenziale visualizzare il PPA per assicurarsi che il catetere di consegna entri correttamente nell'ICA. In quinto luogo, è raro osservare effetti avversi nei roditori a causa dell'iniezione di trombolitici. Nei nostri studi, non abbiamo riscontrato eventi avversi, come angioedema o sanguinamento periferico, dopo l'iniezione di TNK. Questo non significa che non sia possibile, ma non siamo a conoscenza di segnalazioni di effetti collaterali sistemici dei trombolitici nei roditori. Un investigatore che sceglie di implementare questo protocollo per la prima volta potrebbe essere consigliato di consultare uno dei ricercatori nominati come coautore qui, poiché abbiamo trovato molto utile l'istruzione personalizzata.

Nella selezione di un modello di malattia animale per testare terapie candidate, è importante rappresentare accuratamente la popolazione di pazienti che il farmaco è destinato a trattare. I modelli focali di ictus ischemico includono modelli fototrombotici di Rose Bengal, occlusione dell'arteria piale corticale e iniezione stereotassica di endotelina-1 13,14,15. Questi modelli hanno il vantaggio di creare lesioni altamente riproducibili in aree prevedibili della corteccia. Questo vantaggio li rende preferibili negli studi dei meccanismi cellulari o nella correlazione della localizzazione della lesione con gli esiti comportamentali. Il costo aggiuntivo, la complessità e la mancanza di componenti di reperfusione li rendono meno utili per lo screening antidroga.

Le MCAo con monofilamento intraluminale o tromboembolismo sono i modelli consolidati preferiti per l'occlusione di grandi vasi (LVO⁾10,16,17. Il modello monofilamento rivestito al silicio è semplice da eseguire e ampiamente utilizzato. Sebbene la localizzazione e la dimensione della lesione siano meno prevedibili, nei test antidroga su larga scala questa eterogeneità è vista come un vantaggio perché anche gli ictus umani sono piuttosto^{eterogenei 18,19}. Uno svantaggio del metodo del monofilamento è che l'occlusione è biologicamente inerte. Nei pazienti, tromboni e trombolisi producono una cascata infiammatoria associata al rilascio di trombina, plasminogeno e altri elementi del trombo 20,21,22. Per superare questa limitazione, molti hanno proposto modelli di tromboembolismo in studi su coniglio, suini, canini e primati^{non umani 23,24,25,26,27}. Questi studi sono complessi e richiedono competenze specialistiche in generale. Tuttavia, abbiamo cercato di adattare il modello tromboembolico per l'uso nella nostra rete di test preclinici multi-laboratorio. Questo ha richiesto di semplificare la preparazione del tromboembolo, snellire l'approccio chirurgico e ridurre significativamente il numero di animali necessari. Abbiamo ideato un modello tromboembolico, il TE-MCAo, che poteva essere implementato con successo in sei laboratori diversi con un'eccellente aderenza al protocollo (Tabella 1) e dimensioni della lesione ragionevolmente costanti (Tabella 2). La portata era sufficiente, con una media di 6 soggetti a settimana.

Ci sono diversi passaggi di risoluzione dei problemi che possono diventare utili. Il fallimento del sangue nel trombosio è la fonte più frequente di fallimento del protocollo ed è più spesso dovuto alla contaminazione del catetere di preparazione con EDTA o eparina se posto sul tavolo operatorio. Raccomandiamo una tecnica di raccolta scrupolosa. Raccomandiamo inoltre di preparare la soluzione di cloruro di calcio utilizzata per inattivare l'EDTA fresca ogni settimana o ogni due settimane. Dopo aver eluïto il trombo dal catetere di preparazione, può essere difficile tagliare il trombo nei frammenti richiesti di 5 cm. Alcuni tromboni sono fragili e facilmente fratturabili. Consigliamo di preparare i coaguli con ingrandimento ottico e, nei casi estremi, di passare a un trombo donatore diverso. I tromboni aspiranti ed eluzionanti richiedono un livello moderato di abilità; perciò raccomandiamo un periodo di addestramento piuttosto lungo. Assicurati che la punta del catetere a aspirazione sia libera da incastri utilizzando l'ingrandimento ottico. I tromboni possono essere incastrati nel catetere di impianto: raccomandiamo una dolce alternanza 'avanti e indietro' tra aspirazione ed eluzione. Per i chirurghi esperti con il tipico modello di filamento MCAo, l'identificazione della PPA può essere un nuovo passo. Raccomandiamo vivamente di etichettare i tromboni con il blu di Evan, così che il catetere possa essere tracciato e seguito mentre sale attraverso l'ICA. La biforcazione dell'ICA/PPA può essere facilmente individuata tramite una attenta dissezione profonda seguendo l'ICA, ed è localizzata in modo affidabile in profondità fino a un ramo sottile del nervo carotide interno.

Questo protocollo presenta alcune limitazioni. È necessario un elemento di abilità chirurgica per eseguire la cannulizzazione delle arterie carotidi dei roditori. Tuttavia, questo vale altrettanto per il modello a filamento. La gestione dei tromboni sanguigni richiede anche abilità chirurgiche. Come per tutti i modelli tromboembolici, il tasso di infarto riuscito è inferiore rispetto al modello a filamento. Se l'obiettivo dell'indagine è un aumento della frequenza degli infarti, il modello dei filamenti sarebbe preferibile. D'altra parte, se l'obiettivo è replicare trombosi e trombolisi, allora questo modello è auspicabile.

Questo modello è destinato a testare i potenziali protettori cerebrali utilizzando un modello che impiega fedelmente trombosi e trombolisi. Le direzioni future potrebbero includere anche studi sulla terapia adiuvante che mira al fenomeno del non reflow. Molti hanno proposto anticoagulanti e agenti antipiastriciari a questo scopo.

In conclusione, il protocollo TE-MCAo presentato qui è adattato per consentire l'impiego in più laboratori. Abbiamo semplificato la preparazione dei tromboni e ottimizzato l'approccio chirurgico. Abbiamo ideato un metodo per conservare il sangue dei donatori, riducendo significativamente il numero di animali necessari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 ml di siringa	BD	309628
Lenti da 10x
Siringa da 1cc	Terumo	SS-01T
Ago smussato da 23g	Grainger	5FVK7
Siringa da 3,0 cc	BD	309656
Legatura di seta 3-0
Ago da 30g	BD	305128
Sutura prolene 5-0	Ethicon	8698	Per chiudere il taglio della pelle
Legatura di seta 5-0	Ethicon	A182
Pinza per aneurisma
Solfato di tropina	Vet One	NDC86136-006-10	Ridurre le secrezioni bronchiali
Pinze scanalate smussate
Bupivacaina	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	Anestetici locali
Cloruro di calcio	Sigma	C7902
Carprofen	Zoetis Inc	NADA #141-199	Analgesico
Tubi centrifughe	Eppendorf	22364111	Per la raccolta del sangue
Etanolo	Koptec	UN1170
Evan' s Blu	Sigma	E2129
Cuscina riscaldante	Apparato di Harvard	K021-435
Pinza emostatica
Isoflurano	Vet One	NDC13985-528-60
Anelli di tessitura Made By Me Ultimate	Gruppi Orizzonte	Non applicabile	Restrizioni morbide
Microforbici	F.S.T.	15000-00
Microcateteri	Doccol Corporation	PE-FL-360-200-300	Cateteri di iniezione prefabbricati
Catetere PE-10	BD	427401
Tubi PE-100	Intramedico	7426
Tubi PE-50	BD	427410
Tubi EDTA pediatrici	BD Microtainer	K2E-363706	Conserva il sangue dei donatori
Piastra di Petri	Eppendorf	30702115
Soluzione salina tamponata con fosfato	Fisher	B2438
Prevantics	PDI Inc.	NDC10189-1080-1	Antisettico
Fiocco	VWR	89031-288
Lametta di rasoio	AccuTec Pro	71960
Soluzione salina	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
Forbice	F.S.T.	14958-11
Pinze affilate
Pompa a siringa	New Era Pumps Inc.	BS-300
Forno da tavolo	Boekel	132000
Tenecteplase (TNK)	Genentech, San Francisco	NDC50242-120-47	Trombolisi
Etichetta per le orecchie	Laboratorio RapID, San Francisco, CA	Tag RapID