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La spettroscopia a infrarossi, o IR, è una tecnica utilizzata per caratterizzare i legami covalenti.
Le molecole con determinati tipi di legami covalenti possono assorbire le radiazioni IR, provocando la vibrazione dei legami. Uno spettrofotometro IR può misurare quali frequenze vengono assorbite. Questo è generalmente rappresentato con uno spettro della percentuale di radiazione IR trasmessa attraverso il campione a una data frequenza in numeri d'onda. In questo tipo di spettro, i picchi sono invertiti, in quanto rappresentano una diminuzione della luce trasmessa a quella frequenza.
Le frequenze assorbite dipendono dall'identità e dall'ambiente elettronico dei legami, conferendo a ciascuna molecola uno spettro caratteristico. Tuttavia, ogni tipo di legame assorbirà la radiazione IR all'interno di un intervallo di frequenza specifico e avrà una forma di picco e una forza di assorbimento comuni. I picchi possono quindi essere assegnati a legami specifici, consentendo l'identificazione di un composto sconosciuto dallo spettro IR.
Questo video illustrerà la caratterizzazione di un composto organico sconosciuto con la spettroscopia IR e introdurrà alcune altre applicazioni della spettroscopia IR in chimica organica.
Un legame covalente tra due atomi può essere modellato come una molla che collega due corpi con masse m1 e m2. Questa "molla" ha una frequenza di risonanza, che, in questo caso, è la frequenza della luce corrispondente al quanto di energia necessaria per eccitare un'oscillazione del legame a quella stessa frequenza, ma con ampiezza ancora maggiore.
La frequenza di risonanza di un legame dipende dalla forza e dalla lunghezza del legame, dall'identità degli atomi coinvolti e dall'ambiente. Ad esempio, un legame coniugato vibrerà in una gamma di frequenze diversa rispetto a un legame non coniugato.
La frequenza di risonanza dipende anche dal modo vibrazionale, che è il modello di oscillazione degli atomi all'interno di una molecola. Le modalità vibrazionali più comuni osservate dalla spettroscopia IR sono lo stretching e la flessione. Le molecole lineari hanno 3N meno 5 modi vibrazionali, dove N è il numero di atomi, e le molecole non lineari hanno 3N meno 6 modi vibrazionali.
La spettrofotometria IR viene eseguita principalmente illuminando una sorgente luminosa ad ampio spettro attraverso un interferometro, che blocca tutte le lunghezze d'onda della luce in un dato momento, tranne alcune, sul campione. Un rivelatore IR misura l'intensità della luce per ogni impostazione dell'interferometro. Una volta che i dati sono stati raccolti nell'intervallo di frequenza desiderato, vengono elaborati in uno spettro riconoscibile dalla trasformata di Fourier.
Il campione può essere gassoso, liquido o solido, a seconda della costruzione dello strumento. Per un rivelatore standard, i gas e i liquidi vengono posti in una cella con finestre trasparenti IR e i solidi vengono sospesi in olio o pressati in un pellet trasparente con bromuro di potassio. La luce IR viene quindi diretta attraverso il campione verso il rivelatore.
Un metodo alternativo per campioni solidi e liquidi è la riflettanza totale attenuata, o ATR. In questo metodo, il campione puro viene posto a contatto con una superficie cristallina. La luce IR viene quindi riflessa dalla parte inferiore del cristallo in un rivelatore, con le frequenze assorbite che si riflettono più debolmente. Il campione non deve essere prima elaborato, poiché la luce non lo attraversa.
Ora che hai compreso i principi della spettroscopia IR, esaminiamo una procedura per identificare un composto organico sconosciuto utilizzando la tecnica di campionamento ATR su uno strumento FTIR.
Per iniziare la procedura di caratterizzazione, accendere lo spettrometro FTIR e lasciare che la lampada si riscaldi alla temperatura di esercizio.
Assicurarsi che il cristallo ATR sia pulito. Quindi, senza alcun campione, utilizzare il software dello spettrometro per registrare uno spettro di fondo.
Successivamente, ottenere un campione solido di un composto organico sconosciuto e annotarne l'aspetto. Utilizzando una spatola metallica pulita, posizionare con cura il campione sulla superficie del cristallo. In alternativa, per i campioni liquidi, viene utilizzata una pipetta per trasferire i campioni sulla superficie del cristallo.
Avvitare con cautela la sonda finché non si blocca in posizione per fissare il campione contro la superficie del cristallo.
Quindi, raccogliere almeno uno spettro IR del campione sconosciuto. Al termine della raccolta dei dati e sottratto lo sfondo, utilizzare gli strumenti di analisi del software per identificare il numero d'onda dei picchi.
Al termine dell'utilizzo dello spettrometro, rimuovere il campione e pulire la sonda con acetone. Salvare gli spettri, chiudere il software e spegnere lo spettrometro.
In questo esperimento, il campione sconosciuto potrebbe essere uno dei dieci composti organici, ciascuno con cinque picchi IR caratteristici. In base alla fase e all'aspetto visivo dell'ignoto, 8 delle possibilità possono essere eliminate.
Lo spettro del composto sconosciuto mostra un ampio picco vicino alla regione del numero d'onda 3.300, indicativo di un assorbimento di stretching -OH o -NH. I picchi a destra indicano la presenza di doppi legami carbonio-carbonio e legami carbonio-ossigeno. Dei due composti rimanenti, solo uno ha un gruppo -OH, quindi il composto è il fenolo.
La spettrofotometria IR è uno strumento di caratterizzazione ampiamente utilizzato in biologia e chimica. Diamo un'occhiata ad alcuni esempi.
In questa procedura, la spettroscopia FTIR eseguita con il metodo ATR è stata utilizzata per ottenere immagini di assorbanza IR del tessuto introducendo un componente di microscopia nello strumento. Ogni pixel nell'immagine aveva uno spettro IR corrispondente, che consentiva di determinare la composizione molecolare del tessuto con un'eccellente risoluzione spaziale. L'immagine del tessuto potrebbe anche essere visualizzata a frequenze diverse per visualizzare la distribuzione dei tipi di molecole in tutto il tessuto.
Le vibrazioni molecolari dei gruppi peptidici in una proteina sono influenzate dai cambiamenti conformazionali delle proteine. Monitorando un campione di proteina con FTIR step-scan, che ha una risoluzione temporale dell'ordine di decine di nanosecondi, la dinamica delle proteine può essere monitorata attraverso le variazioni dei loro spettri di assorbanza. I dati possono essere presentati come spettri individuali o come grafici 3D di intensità, frequenza e tempo per l'identificazione dei picchi e ulteriori analisi.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla spettroscopia IR. A questo punto dovresti avere familiarità con i principi alla base della spettroscopia IR, la procedura per la spettroscopia IR di composti organici e alcuni esempi di come la spettroscopia IR viene utilizzata in chimica organica. Grazie per l'attenzione!
