Un multi-parametrica Perifusion Sistema isolotto all'interno di un dispositivo Perifusion Microfluidic

In questa presentazione, introdurremo un sistema di perfusione palpebrale basato su microfluidica per la misurazione simultanea della secrezione dinamica di insulina, dell'afflusso di calcio e delle variazioni del potenziale mitocondriale degli occhielli pancreatici in risposta ai cani che secernono insulina. Il sistema di perfusione è composto da un dispositivo microfluidico a tre strati, pompe a siringa e un collettore di insulina a frazione. L'afflusso di calcio indotto dai secretagoghi e i potenziali mitocondriali vengono visualizzati utilizzando una configurazione al microscopio fluorescente.

Ciao, mi chiamo Ola, una Waller del laboratorio del Dr.Val Holter nel Dipartimento di Chirurgia dei Trapianti dell'Università dell'Illinois a Chicago. Ciao, sono Don Lee, anche lui del laboratorio di ottobre. Ciao, sono Tricia Hart, anche lei del laboratorio di Dr.Al Holster.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging simultaneo delle palpebre utilizzando un gradiente lineare di glucosio. Abbiamo utilizzato questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le immagini e la funzione degli occhielli. Quindi iniziamo.

Il dispositivo microfluidico utilizzato per questa procedura è assemblato da tre strati di PDMS polimerizzato generato dalla fotolitografia standard. Il primo strato generato da un master in silicone ha i pozzetti del dispositivo microfluidico che manterrà delicatamente gli occhielli in posizione, profondi 150 micrometri e con un diametro di 500 micrometri. Il secondo strato ha canali alti 500 micrometri e larghi due millimetri.

Il centro del canale viene espanso per distribuire il flusso per un migliore scambio di soluzione All'interno del dispositivo, in cambio viene effettuato praticando un foro alto tre millimetri e largo sette millimetri al centro dello strato. Il terzo strato è una spessa lastra di PDMS. Per preparare questo strato, praticare piccoli fori su entrambi i lati che si allineano con l'ingresso e l'uscita del canale.

Sul secondo strato, una volta che tutti e tre gli strati sono stati generati, il primo strato viene incollato a un vetrino con i pozzetti rivolti verso l'alto. Il secondo strato viene quindi incollato al primo strato con la spaziatura dei canali verso l'alto. Infine, il terzo strato viene incollato al secondo strato.

Una volta che gli strati sono stati incollati, il dispositivo è pronto per l'uso per gli esperimenti. Utilizzando una siringa da 10 millilitri riempita con etanolo al 70% e collegata alla porta di ingresso del dispositivo con Tai sul tubo, sterilizzare il dispositivo microfluidico facendo scorrere l'etanolo attraverso i canali del dispositivo. Quindi, utilizzando lo stesso flusso di configurazione, acqua deionizzata per lavare via l'etanolo.

Una volta sterilizzato il dispositivo, posizionarlo su un tavolino da microscopio riscaldato utilizzando un tubo tigon, collegare le pompe a siringa contenenti soluzioni ad alto e basso contenuto di glucosio a un connettore a Y. Quindi collegare all'ingresso del dispositivo microfluidico. Collegare l'uscita del dispositivo microfluidico a un collettore di frazioni.

Assicurarsi che il tubo poggi su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius. È molto importante mantenere le soluzioni a temperatura fisiologica durante tutto l'esperimento. Successivamente, utilizzare il programma lab view per avviare il gradiente di glucosio che verrà perfuso attraverso la rete microfluidica durante l'esperimento.

Questo software varia la portata di due soluzioni di glucosio. Controllando le pompe a siringa, è possibile creare vari profili di gradiente di glucosio, profili di gradiente di glucosio lineari, a campana e di forma quadrata. Rispetto ai valori attesi calcolati mostrati in questo esperimento, verrà utilizzato il gradiente lineare da due millimolari a 25 millimolari di glucosio con una velocità di flusso variabile di 0,01 millilitri al minuto delle due soluzioni di glucosio e una velocità di flusso costante di 0,25 millilitri al minuto che entra nel dispositivo dopo che le soluzioni sono state miscelate.

Una volta selezionato il profilo di gradiente appropriato, testare la stabilità del gradiente. Innanzitutto, avvia il sistema di gradiente. Quindi avviare il collettore di frazioni e raccogliere il perfuso otto in un millilitro e incassare tubi di orph.

Quindi, utilizzando un glucometro, testare la concentrazione di glucosio in ciascuna provetta utilizzando Excel. Analizza i risultati ottenuti dal glucometro. Successivamente, sostituire la siringa ad alto contenuto di glucosio con una siringa contenente una soluzione di BSA allo 0,5% nel tampone ringer Krebs PERFUSE 50 millilitri attraverso il dispositivo alla velocità di un millilitro al minuto.

Ciò impedirà l'assorbimento aspecifico dell'insulina sulle pareti dei microcanali per garantire l'accuratezza quando si misurano successivamente i livelli di insulina secreta dopo la perfusione con BSA. Sostituirlo con la soluzione ad alto contenuto di glucosio reus. Sospendere da 25 a 30 occhielli di topo selezionati a mano in un tampone ringer Krebs a due millimolari di glucosio contenente il colorante indicatore di calcio fira 2:00 AM e il colorante indicatore dei potenziali mitocondriali rumina 1 2 3, incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, scollegare il dispositivo dal sistema di perfusione e caricare con cura gli occhielli nel dispositivo microfluidico inserendo la punta della pipetta, contenente le isole nella porta di ingresso, e dispensando lentamente le isole dopo il caricamento, ricollegare il dispositivo al sistema di perfusione. Facendo attenzione a non introdurre bolle. Quindi, avviare la pompa a siringa per iniziare a perfondere gli occhielli con KRB contenente due millimolari di glucosio.

Questo passaggio laverà il colorante in eccesso dal mezzo, designerà i set di filtri di eccitazione ed emissione e i tempi di esposizione da utilizzare durante l'esperimento. Quindi impostare il collettore di frazioni in modo che raccolga a intervalli di un minuto mentre si para utilizzando gli occhielli con la soluzione a basso contenuto di glucosio. Utilizza lo strumento regione di interesse o ROI del semplice software di imaging PCI per definire le aree o gli occhielli che desideri visualizzare.

Inoltre, cerchiare l'area di sfondo che verrà sottratta dopo che le cellule sono state lavate per 10 minuti, avviare il collettore della frazione di gradiente di glucosio e avviare l'imaging time-lapse. Dopo 30 minuti, spegnere il software e la pompa a siringa ad alto contenuto di glucosio. Continua a perfondere con glucosio basso per eliminare l'effetto del glucosio alto.

Dopo 10 minuti, interrompere il flusso di glucosio basso spegnendo la pompa a siringa. Dopo la perfusione, esportare i dati in Excel per l'analisi. La quantità di insulina secreta nel perfu otto può essere determinata dagli occhielli di topo ELA.

Sono stati perfusi con un gradiente lineare da due a 25 millimolari di glucosio come mostrato qui. L'afflusso di calcio e la secrezione di insulina si innescano dopo circa 13 minuti di perfusione, corrispondenti a sei millimolari. Glucosio. I cambiamenti nei potenziali mitocondriali si osservano prima, come previsto a circa 11 minuti.

Questi dati dimostrano il vantaggio dell'utilizzo di questa rete microfluidica per caratterizzare la fisiologia degli occhielli. Ti abbiamo appena mostrato come utilizzare il nostro dispositivo microfluidico per para fusione per lo studio della fisiologia degli occhielli. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che non ci siano bolle nel dispositivo, in quanto ciò potrebbe causare lo spostamento degli occhielli durante un esperimento.

Inoltre, la flury può essere regolata fino a un ml al minuto senza disturbare gli occhielli. Quindi questo è tutto. Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.