La stimolazione cerebrale Slice Utilizzando una rete Microfluidic e della Camera di perfusione standard

L'obiettivo principale del progetto che vi mostreremo oggi è quello di essere in grado di controllare spazialmente e temporaneamente la stimolazione del taglio cerebrale. E un altro punto importante è che utilizzando una semplice modifica nella già complicata configurazione elettrofisiologica, possiamo diffondere questo dispositivo microfluidico tra i vari laboratori che utilizzano effettivamente questa stimolazione della vita cerebrale. Ciao, sono Java Chek Mohammad del laboratorio di Edington presso il Dipartimento di Bioingegneria dell'Università dell'Illinois a Chicago.

Oggi vi mostrerò come applicheremo un semplice dispositivo microfluidico microfabbricato per la stimolazione della fetta cerebrale. Il dispositivo a fetta di cervello che dimostreremo oggi è molto utile per diversi motivi e i motivi principali sono che è così modulare che può adattarsi alla configurazione elettrofisiologica esistente senza ulteriori modifiche. Ed evita l'uso di tubi e pompaggi, il che complica qualsiasi dispositivo microfluidico.

E poiché utilizziamo il metodo di pompaggio passivo, non abbiamo bisogno di tubi o pompe. E la terza cosa è che si tratta solo di un sottile foglio di membrana PDMS che va tra un vetrino coprioggetto e una camera di profusione standard, che viene utilizzata in una configurazione standard di elettrofisiologia. La procedura che sto per illustrare oggi inizia con un master C otto, che viene fabbricato utilizzando il processo di litografia SV otto standard.

E il master che abbiamo qui oggi è un master a due livelli, con un livello che ha il design dei canali, i micro canali, e un altro design per le aperture VR che vanno sopra questi canali in modo che le soluzioni che fluiscono attraverso i canali possano uscire dalle aperture dei via. Quindi realizziamo questo master, che si trova su un wafer di silicone, e poi usiamo il silicone o il PDMS per versare sulla parte superiore di questo dispositivo e modellare le strutture che si trovano sopra questo wafer sul PDMS. Quindi faremo in modo che il PDMS si riversi sopra questo dispositivo.

E poi prenderemo la membrana PDMS che si forma dopo l'indurimento e si lega a un vetrino coprioggetti. E poi abbiamo il nostro dispositivo microfluidico. E poi modificheremo una camera di profusione standard citando un sottile strato di PDMS sul fondo della camera di perfusione.

E una volta che avremo questa camera di perfusione modificata, prenderemo il dispositivo microfluidico che abbiamo fabbricato in precedenza e lo legheremo alla camera di perfusione. Ci sono due punti critici nella fabbricazione del dispositivo microfluidico. Uno è che prima di mettere il PDMS, la piastra calda dovrebbe essere spenta in modo che il PDMS non si metta in coda all'istante quando lo versiamo sul wafer.

E un altro punto critico è che i distanziatori che usiamo ai quattro angoli del wafer di silicio dovrebbero avere un'altezza inferiore alla struttura più alta del wafer di silicio. Questo per assicurarci che le aperture VR possano essere ottenute quando eseguiamo il processo di polimerizzazione per il PDMS. Eccoci qui in questa camera bianca modulare a parete morbida e questo è il master che abbiamo fabbricato utilizzando un processo di litografia standard C otto.

Ed è un master a due livelli, con il primo livello che ha il design per i canali con quattro ingressi e un'uscita. E nella regione centrale di tutti e quattro i canali, ci sono via o pos che si trovano sopra i canali. E questi sono i segni di allineamento che sono stati creati durante il processo di fabbricazione.

E ora vi mostrerò come rimuoverlo ed eseguire l'indurimento PDMS. A causa dell'effetto perlina del bordo, lo spessore nella periferia esterna del wafer è superiore ai dispositivi effettivi al centro della carta. Quindi quello che faremo è rimuovere questi segni di allineamento usando la lama di riserva e poi per adattarsi ai pesi, useremo questi distanziatori che sono alti 140 micron e li metteremo ai quattro angoli del wafer.

Quindi è necessario assicurarsi che la lama del rasoio non raggiunga i dispositivi reali. Ora rimuoverò queste particelle SVA usando lo spolverino ad aria e il wafer è ora pronto per la preparazione dello stampo PDMS. Ma prima di farlo, dobbiamo mettere questi distanziatori che sono alti 140 micron.

Quindi posizionerò i quattro nastri ai quattro angoli dell'ostia. Quindi mi assicurerò che il nastro aderisca correttamente al wafer. Quindi il motivo per cui il nastro era alto 140 micron è che il master a due livelli con i canali e il VS è alto 150 micron.

E quando posizioniamo il peso sopra il PDMS durante l'indurimento del PDMS, vogliamo assicurarci che il foglio PDMS risulti piatto. Quindi stiamo usando quattro distanziatori sugli angoli con altezze uguali. Ora mostrerò come codificheremo il PDMS e lo cureremo per realizzare i dispositivi.

Ma prima di farlo, lasciate che vi mostri come abbiamo preparato la soluzione PDMS. Quindi prendiamo 10 parti della base e una parte dell'agente indurente e lo mescoliamo accuratamente a causa del processo di miscelazione. Vedete che generiamo molte bolle nella soluzione PDMS per rimuovere queste bolle, metteremo il PDMS nell'essiccato dopo aver messo il, dopo aver messo il PDMS nell'essiccato per 10 minuti, non ci sono bolle.

E ora il PDMS è pronto per essere utilizzato per l'indurimento. Ora vi mostrerò come metteremo il PDMS sul wafer e lo cureremo per ottenere la membrana PDMS. Quindi metterò il PDMS sul wafer e poi userò questa trasparenza per coprire il PDMS.

E questo ci aiuterà a rimuovere il dispositivo sup, separare il dispositivo dalla trasparenza, e poi andrò a posizionare i pesi sopra la trasparenza. E il motivo per cui stiamo usando i pesi è per ottenere uno spessore uniforme del PDMS. E un'altra criticità è quella di ottenere le aperture di via.

Quindi, ovunque ci siano contro, non vogliamo PDMS e i pesi ci aiuteranno a farlo. Come potete vedere qui, la piastra riscaldante è spenta e la ragione di ciò è che non vogliamo che il PDMS si indurisca all'istante, quindi lo lasciamo spegnere. E poi è necessario assicurarsi che il wafer sia piatto prima di portare il PDMS.

E ora possiamo trasferire il PDMS che abbiamo preparato in precedenza. Assicurati di erogare il PDMS abbastanza vicino al wafer in modo da non generare bolle. E il punto più critico qui è il modo in cui si mette la trasparenza sopra il PDMS.

È necessario assicurarsi di non generare bolle a causa del posizionamento del foglio. E ora ho intenzione di posizionare uno di questi laboratori di vetro e lasciare che il PDMS in eccesso PDMS si tolga di mezzo. Sto posizionando altri tre laboratori di vetro e per assicurarmi che i laboratori di vetro non si muovano per questo particolare master.

E per queste particolari caratteristiche, abbiamo scoperto che posizionando questi quattro laboratori di vetro si rende il VS. E per lasciare che il PDMS in eccesso si allontani tra la trasparenza e il wafer. Attendiamo uno o due minuti e poi possiamo avviare la piastra riscaldante per diversi master e per diversi design, potrebbe essere necessario aumentare il numero di laboratori di vetro o diminuire i laboratori di vetro per ottenere le aperture di via. Ora la piastra riscaldante è pronta per essere accesa e ho intenzione di impostare una temperatura di 75 gradi.

E una volta raggiunta la temperatura di 75 gradi, possiamo impostare il timer per un'ora e lasciare che il PDMS si indurisca. Ora che abbiamo lasciato indurire il PDMS per un'ora, possiamo spegnere la piastra riscaldante e lasciarla raffreddare a 50 gradi centigradi. La ragione per farlo è che il mare non si spezzi.

Se lo rimuoviamo immediatamente da 75 gradi a temperatura ambiente, ora possiamo spegnerlo e attendere che scenda a 50 gradi centigradi. Ora che la temperatura della piastra riscaldante è scesa a 50 gradi centigradi, possiamo rimuovere i pesi dalla trasparenza. Ora possiamo rimuovere il wafer dal lettore caldo ed è pronto per essere tagliato.

Ora il foglio PDMS è pronto per essere rimosso dal master a C eight e dobbiamo rimuovere il foglio di alluminio. Quindi dobbiamo rimuovere il foglio trasparente. Abbiamo qui la camera di perfusione standard.

L'abbiamo modificato in modo da poterlo allineare. I fori, le porte di ingresso e di uscita del dispositivo microfluidico. Quindi queste sono le quattro porte di ingresso e una porta di uscita sulla membrana PDMS.

E questi dovrebbero corrispondere con i quattro ingressi e un'uscita sulla camera di perfusione. Ora farò scorrere la camera di perfusione e poi la allineerò con i fori sulla membrana PDMS. Ora che sono allineati, è pronto per essere tagliato.

Ora puoi rimuovere la camera e usare una sonda. Assicurarsi che tutti i bordi della membrana PDMS siano liberi di essere rimossi. Una volta fatto ciò, possiamo utilizzare un congelatore per rimuovere la membrana PDMS e assicurarci che quando si rimuove il PDMS dalla parte superiore del dispositivo, si muova il PDMS molto lentamente in modo da non strappare la membrana PDMS.

Ora posizionerò la membrana PDMS con le cavità che si formano con gli otto master SC sopra e mi assicurerò che sia piatta. E il motivo per cui lo stiamo facendo è che quando facciamo i fori, le porte di ingresso e di uscita, il PDMS non è ruvido sul lato. Questo sarà incollato con il vetrino coprioggetto.

Quindi dobbiamo assicurarci che le cavità siano sul lato superiore. Ora possiamo realizzare le porte di ingresso e uscita solo in modo da poter vedere chiaramente i fori. Abbiamo messo uno sfondo nero.

Ora farò in modo che le porte di ingresso e uscita debbano assicurarmi che non ci sia PDMS rimasto sulla porta. Così è itwe, rimuovere qualsiasi PDMS. Ora trasferiremo la membrana PDMS su un altro foglio trasparente.

Quindi possiamo trattare il foglio e il vetrino coprioggetto con il plasma e stenderlo in modo che, di nuovo, le cavità siano ancora sulla parte superiore. Quindi, una volta che questa superficie è stata trattata con il plasma e il vetrino coprioggetto è stato trattato con il plasma, possiamo unire queste due superfici per formare la rete microfluidica per rimuovere le bolle d'aria tra il foglio PDMS. E la trasparenza può usare uno scotch.

Quindi questo assicurerà che il foglio PDMS sia piatto e che l'incollaggio avvenga molto meglio. E poi di nuovo, usa lo scotch sulla superficie superiore per rimuovere la polvere dalla membrana PDMS. Ora possiamo mettere il vetrino coprioggetto che legheremo con la membrana PDMS.

E ora questi due PDMS e il vetro sono pronti per essere trattati al plasma. Tratteremo al plasma il PDMS e il vetrino coprioggetto utilizzando questo sistema al plasma modificato a microonde dove potete vedere che questa camera di vetro ci permette di creare il plasma all'interno di questo forno a microonde. E lasciatemi posizionare i campioni all'interno creando il vuoto all'interno della camera.

Ora posso fluire nell'ossigeno. Ora il sistema al plasma è pronto per l'uso e userò il 10% di energia e 10 secondi per questo particolare sistema per aiutare a visualizzare il plasma. Mentre il trattamento al plasma era in corso, abbiamo girato, aumentato la potenza al cento per cento e abbiamo spento le luci.

E ora puoi vedere il plasma subito dopo il trattamento al plasma. È necessario incollare entrambe le superfici, la barbottina della vacca e il PDMS, altrimenti la superficie del PDMS perderà la sua idrofilia a causa del trattamento al plasma. Una volta posizionata la barbottina, assicurati che l'intera superficie sia incollata insieme senza bolle d'aria.

Se ci sono bolle d'aria, puoi rimuoverle. Ora lo metti da parte per cinque minuti e lo lasci legare. Quindi qui abbiamo la camera di perfusione modificata in cui abbiamo modificato la base della camera con PDMS.

E questo è stato fatto prima. Quindi abbiamo posizionato un trasparente sulla piastra riscaldante su una piastra calda che era spenta. E poi abbiamo versato il P-D-M-S-P-D-M-S che è stato preparato in modo simile a quello mostrato in precedenza.

E poi abbiamo posizionato la camera di perfusione sopra il PDMS e poi abbiamo posizionato un singolo peso come mostrato qui e l'abbiamo lasciata indurire per 30 minuti o 75 gradi centigradi. E ora dimostrerò che mentre aspettiamo che si verifichi il PDMS e l'incollaggio del vetrino coprioggetto, possiamo andare avanti e preparare la camera. In questo modo possiamo legare la camera e il dispositivo microfluidico.

Quindi dobbiamo rimuovere il PDMS in eccesso da dove non ne abbiamo bisogno. Rimuovere la trasparenza, quindi PDMS, quindi è necessario rimuovere il PDMS dalle porte di ingresso e uscita. Ora la camera è pronta per essere incollata con il dispositivo microfluidico che abbiamo preparato in precedenza.

Ora che abbiamo aspettato cinque minuti, il dispositivo microfluidico è pronto per essere separato dalla trasparenza, ma è necessario assicurarsi di rimuovere la trasparenza a una velocità lenta. Quindi il PDMS e il vetrino coprioggetti, non si separano. Ora che la camera di perfusione è pronta, dobbiamo trattare al plasma la superficie inferiore della camera dove abbiamo appena citato il PDMS e la superficie superiore del dispositivo microfluidico che ha il PDMS su di esso.

Quindi ora metteremo entrambi questi pezzi nella camera al plasma ed eseguiremo il trattamento al plasma al 10% di potenza per 10 secondi. Ora entrambe le superfici sono state trattate con il plasma e sono pronte per essere incollate. Prima di eseguire l'incollaggio, è necessario assicurarsi che le porte di ingresso e di uscita sulla camera siano allineate con il dispositivo microfluidico.

E poiché le caratteristiche che stiamo allineando sono abbastanza grandi, non abbiamo bisogno di attrezzature speciali e possiamo farlo ad occhio nudo. Una volta allineata e posizionata sulla parte superiore della camera, assicurati che tutte le superfici siano a contatto e poi puoi lasciarla riposare per cinque minuti. Quindi il legame è abbastanza buono per gli esperimenti dopo aver aspettato cinque minuti.

Ora che il dispositivo microfluidico si è legato alla camera, renderemo idrofili i canali nella superficie del canale. Quindi, quando effettivamente fluiamo la soluzione A CFS o qualsiasi altro neurotrasmettitore, le soluzioni possono fluire più facilmente. Quindi quello che farò è mettere l'intero dispositivo nel plasma e nel plasma, trattarlo per un minuto al 10% in modo che le superfici complete del canale interno diventino idrofile.

E poi lo riempirò d'acqua e poi lo porterò alla configurazione di elettrofisiologia in modo da poter fare gli esperimenti veri e propri. Ok, ora siamo pronti per passare alla configurazione dell'elettrofisiologia e utilizzare effettivamente questo dispositivo con la fetta di cervello. Ciao, il mio nome è uo.

Sto lavorando con il Dr.Arrington e il Dr.Fall, il Dipartimento di Bioingegneria dell'Università dell'Illinois. E ora lavorerò con il dispositivo micro free che ha portato e mangiato su questa piattaforma. Da un lato, possiamo vedere il tubo a profusione.

Dall'altro lato, possiamo vedere il tubo di aspirazione. Quindi il dispositivo verrà perfuso con una soluzione di liquido cerebrospinale, che viene fatta gorgogliare con il 95% di ossigeno e il 5% di CO2. Ora che il dispositivo micro V è pronto, prenderò la licenza del cervello e poi li metterò sopra il dispositivo micro.

Ora metterò la fetta di cervello, eh, in cima alle aperture circolari, e poi userò l'ancora per immobilizzare la fetta di cervello. Ora che la fetta di cervello viene immobilizzata, userò i neurotrasmettitori per stimolarla. Proprio qui abbiamo quattro ingressi, quindi metterò il neurotrasmettitore in ogni ingresso usando il pompaggio passivo da questi quattro ingressi fino a questo sbocco.

E ora il Dr.Fall parlerà di questo dispositivo. Cosa è così importante per Noi? Ciao, sono Chris Fall e ci occupiamo di fisiologia del cervello.

E il motivo per cui abbiamo bisogno di usare fette di cervello è per l'accesso con micro elettrodi e tecnologia di imaging. E fino ad ora, l'unico modo in cui potremmo cambiare l'ambiente dei neurotrasmettitori per queste fette di cervello è quello di cambiare il flusso sull'intera fetta o di soffiare i neurotrasmettitori direttamente usando una micropipetta molto piccola. Quindi siamo davvero entusiasti di lavorare con Eddington's Group.

Questa nuova tecnologia ci permetterà di affrontare ampie aree del cervello e modificare localmente l'ambiente dei neurotrasmettitori. E poi, contemporaneamente, possiamo entrare con i nostri elettrodi e la nostra tecnologia di imaging e forse alla fine costruire dispositivi di registrazione multi-elettrodo nella stessa unità. Ok, quindi qui vedete una fetta di distorsione del topo nel dispositivo microfluidico.

E si può notare anche a occhio nudo che il cervello è composto da molte regioni diverse. Queste regioni fanno cose diverse. E nell'animale vivo, queste diverse regioni del cervello avrebbero diversi toni neuromodulatori e neurotrasmettitori.

E vogliamo essere in grado di replicare questo nella nostra camera a fette mentre stiamo effettuando registrazioni elettrofisiologiche e di imaging. E quindi è davvero fantastico essere in grado di affrontare queste diverse aree con diversi neurotrasmettitori in diverse concentrazioni e con diversi corsi temporali. E anche se non possiamo davvero visualizzare i neurotrasmettitori, possiamo mostrarvi un esempio di colorante fluorescente che viene pompato nella fetta di cervello in diverse regioni.

Qui si vede un filmato in cui stiamo facendo scorrere del colorante fluorescente attraverso i canali del dispositivo e lo visualizziamo semplicemente uscendo dai pori che sono stati creati. E anche in questo primo prototipo, si può vedere quanto sia precisa la risoluzione spaziale con il flusso. Mentre guardiamo il film, vedrete il colorante fluire nei canali e poi fuori dai fori, e poi elimineremo quel colorante, dandovi un'idea di quale sia la risoluzione temporale del flusso.

Grazie per essere qui con noi oggi. Penso che siamo stati in grado di dimostrare come la microfluidica e, in effetti, le micro macchine possano essere sposate con le tecniche fisiologiche tradizionali per aiutarci a capire come funziona il cervello. Grazie.