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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule In Vivo

Full Text

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13:36 min

December 30, 2009

DOI: 10.3791/1687-v

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Fate mappatura genetica inducibile (GIFM) segna e cellule brani con fini di controllo spaziale e temporale

Transcript

Le mappe del destino vengono generate marcando e tracciando le cellule in vivo per determinare in che modo i progenitori contribuiscono a strutture e tipi di cellule specifici nei tessuti in via di sviluppo e adulti. E l'avanzamento in questo concetto è la mappatura genetica del destino inducibile o GIFM che collega l'espressione genica al solfato e ai comportamenti cellulari in vivo per creare mappe del destino basate sul lignaggio genetico. Ciao, mi chiamo Deborah Ellisor del Mark Services Laboratory e del dipartimento di Biologia Molecolare, Biologia Cellulare e Biochimica della Brown University.

Oggi i miei colleghi Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown ed io dimostreremo una procedura per la mappatura genetica del destino inducibile. Usiamo questa procedura in laboratorio per studiare lo sviluppo precoce del cervello. Possiamo anche applicare questa tecnica a studi di inattivazione genica e modelli animali di malattie umane.

Quindi iniziamo in X cre, embrioni E-R-M-G-F-P. MGFP LAE è un allele reporter presente in tutte le cellule rappresentate da ovali grigi X cre, er, dove X rappresenta gli elementi regolatori genici. Il controllo dell'espressione di C ER è spazialmente ristretto al dominio di espressione del gene X mostrato in blu e la proteina CRE ER è sequestrata nel citoplasma da HSP 90.

In assenza di tamoxifene, il reporter sarà spento. La somministrazione di tamoxifene provoca cellule mappate sul destino nel dominio X perché la CER viene rilasciata da HSP 90 trasloca nel nucleo e rimuove la cassetta di arresto dall'allele reporter. La combinazione dell'allele reporter CER e del tamoxifene provoca la marcatura quando una popolazione cellulare viene inizialmente contrassegnata in una regione cerebrale primordiale dell'embrione in base all'espressione genica, queste cellule mappate sul destino vengono tracciate anche dopo che l'espressione genica iniziale utilizzata per guidare la CER si è estinta.

In questo modo. La distribuzione finale e il destino terminale di un lignaggio cellulare geneticamente definito possono essere identificati nell'adulto. Questa procedura inizia con la preparazione di una soluzione di gambo da 20 milligrammi per millilitro di tamoxifene: sciogliere 200 milligrammi di tamoxifene in 10 millilitri di olio di mais prebellico in una fiala di vetro per inalazione.

Quindi incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per due ore su un vortice di Tator. La soluzione protegge in modo intermittente la soluzione madre di tamoxifene preparata dalla luce avvolgendo la fiala con un foglio e conservandola a quattro gradi Celsius. Il brodo può essere utilizzato per un massimo di un mese.

Per gli esperimenti di mappatura del destino, stabilire una coppia riproduttiva composta da una femmina di Swiss Webster wild type e da un maschio portatore sia di un allele CreER specifico del gene che di un allele reporter. Ai fini di questa dimostrazione, utilizzeremo una vittoria per un maschio CreER MG FP. Controlla la femmina di Webster svizzera ogni mattina per la comparsa di un tappo vaginale.

Designare la mattina del giorno del tappo vaginale come visto come 0,5 giorni dopo cotus e calcolare la data di somministrazione del tamoxifene. Sulla base di questo punto di partenza in questo esperimento, il tamoxifene verrà somministrato il giorno embrionale 8,5. Utilizzando una siringa da un millilitro con un ago per l'alimentazione degli animali, aspirare 200 microlitri della soluzione di gambo di tamoxifene.

Trattenere saldamente la femmina di Webster svizzera incinta a tempo afferrando il pelo del collo e la schiena per immobilizzare la testa e girare il mouse in modo che il lato ventrale sia rivolto verso l'alto. Tieni la coda tra le dita libere per mantenere il corpo in linea retta. Quindi, posiziona l'ago di alimentazione nell'angolo della bocca e guida delicatamente l'ago parallelamente al palato fino a quando la punta dell'ago di alimentazione non si trova approssimativamente nella posizione dell'occhio.

Inclinare delicatamente la testa all'indietro per accedere all'esofago. Guidare l'ago oltre l'epiglottide e lungo l'esofago verso lo stomaco. Fare attenzione a non entrare nella trachea.

Una volta che l'ago di alimentazione è nello stomaco, somministrare il tamoxifene e rimuovere l'ago. Quindi riporta la femmina nella sua gabbia di casa fino alla data della dissezione. Alla data della dissezione, gli embrioni E 12,5 della femmina incinta vengono sezionati liberi e quindi valutati per la marcatura GFP.

In un embrione GFP positivo, osserviamo che i neuroni derivati dal vento contribuiscono al mesencefalo, coccolano il cervello posteriore e il midollo spinale. Il reporter MG FP etichetta le proiezioni assonali, che possono anche essere viste trasferire gli embrioni positivi alla GFP montandoli a casa su una capsula di Petri contenente PPS e fotografarli utilizzando una cornice Dopo che gli embrioni sono stati fotografati, utilizzare una pinza per staccare un piccolo pezzo di coda da ciascun embrione e posizionare ogni pezzo in una provetta per PCR. I tessuti saranno genotipizzati mediante PCR per entrambi gli alleli per confermare i risultati osservati tramite l'analisi dell'intera montatura.

Le seguenti procedure ci permettono di analizzare come le cellule marcate derivate dalle regioni embrionali popolano il cervello adulto prima di iniziare la craniotomia. Confermato da un pizzico di dita dei piedi che il mouse è completamente innu. I ized con nembutal eseguono incisioni per accedere al cuore attraverso la gabbia toracica.

Quindi posiziona un ago a farfalla nell'apice o nel ventricolo sinistro del cuore e fissalo con il morsetto a C. Creare un sito di uscita del fluido nell'atrio destro con le forbici, quindi perfondere con 10-15 millilitri di soluzione salina ghiacciata fino a quando il fluido non scorre limpido. Seguito da 20-25 millilitri di aldeide paraforme al 4%.

Quando la profusione intracardiaca è completa, rimuovere la testa con le forbici tagliando la colonna vertebrale appena sopra le spalle. Fai scorrere un bisturi lungo la linea mediana dorsale della testa, rostral de cottle per tagliare il cuoio capelluto ed esporre il cranio S. Usando il bisturi, raschiare via il tessuto o il muscolo in eccesso lungo il lato e la parte posteriore del cranio.

Con una pinza, perforare il cranio sulla linea mediana, appena rostrale ai bulbi olfattivi e creare un piccolo foro per accogliere le punte delle forbici sottili. Inserire le forbici sottili in questo foro e praticare due incisioni bilaterali dalla linea mediana seguendo la lunghezza dei bulbi olfattivi. Questo taglio romperà il cranio all'intersezione tra l'osso nasale e l'osso frontale e fornirà un buon accesso per le forbici.

Taglia lungo le suture sagittali nel cranio, assicurandoti di mantenere le punte delle forbici angolate lontano dal cervello per evitare di danneggiare il tessuto sottostante. Quindi, afferra delicatamente il cranio con una pinza e stacca l'osso lungo l'incisione mediale per esporre il cervello. Il cranio può scheggiarsi in piccoli pezzi o staccarsi in sezioni più grandi.

Continuare a usare la pinza per rimuovere tutte le ossa parietali frontali, interparietali e occipitali. Libera il para oculi situato lungo i bordi laterali del cervello a livello del cervelletto pizzicando delicatamente le ossa sferiche su ciascun lato. Usa le forbici per tagliare con cura la parte dorsale dell'osso che circonda il tronco encefalico.

Inserire un lato delle forbici appena sotto il bordo dorsale dell'osso, iniziando da dove è stato tagliato il midollo spinale e tagliando verso il cervelletto. Per liberare il tronco encefalico e il cervelletto. Rimuovere l'osso rimanente intorno al tronco encefalico con la pinza.

Estrarre delicatamente le ossa, girare la testa con il lato dorsale verso il basso e usare la pinza per recidere i nervi cranici e liberare il cervello dal cranio. Metti il cervello in una capsula di Petri di ghiaccio. PPS a freddo Valutare il cervello adulto per la marcatura GFP, utilizzando un cannocchiale da dissezione fluorescente e fotografare utilizzando una cornice.

In questo esempio, il mesencefalo è contrassegnato dalla GFP oltre al suo utilizzo per l'analisi del lignaggio durante l'embriogenesi e nell'adulto la GIFM può essere combinata con altre applicazioni comunemente utilizzate nella biologia dello sviluppo come la micro dissezione e gli esperimenti di espianti di tessuti. Ad esempio, il mesencefalo ventrale è la zona progenitrice per lo sviluppo dei neuroni della dopamina che esprimono il gene wind one. Pertanto, l'isolamento del mesencefalo ventrale mediante micro dissezione consente di stabilire un ambiente in vitro per indagare ulteriormente il suo sviluppo.

Questo rappresenta solo un esempio dell'utilizzo di GIFM per isolare una zona progenitrice di interesse definita dalla storia genetica. Per iniziare questa procedura, trasferire gli embrioni positivi alla GFP precedentemente identificati in PBS sterili ghiacciati in un piatto di coltura cellulare utilizzando forbici sottili. Rimuovere la parte della testa di un embrione tagliandolo trasversalmente coccolato a rommy.

Successivamente, rimuovere la parte rostrale della testa con un taglio coronale attraverso il cephalon. Ciò esporrà una struttura tubolare in cui il quarto ventricolo attraverso la vescicola mesocefalica forma un condotto tra i tessuti dorsale e ventrale. Inserire con cautela le punte delle forbici nel quarto ventricolo e tagliare lungo la linea mediana dorsale coccolata fino all'apertura rostrale completa del tubo, creando una preparazione a libro aperto.

Il mesencefalo ventrale sarà ora esposto medialmente. Mentre le due metà dorsali del mesencefalo risiederanno lateralmente, potrebbe essere necessario rimuovere qualsiasi tessuto non neurale rimanente sotto il mesencefalo ventrale. Affinché l'explan rimanga piatto, l'explan dovrebbe ora assomigliare a una farfalla in cui il mesencefalo dorsale rappresenta le ali e il thrombo solo la coda.

Per isolare ulteriormente il mesencefalo ventrale per l'analisi via fax o gli esperimenti di coltura cellulare, rimuovere gli aspetti laterali del tessuto. Ora mostreremo alcuni risultati rappresentativi di GIFM. In questo esperimento, vengono visualizzate le cellule che esprimono WINT one marcate con E 8.5 per determinare in che modo le cellule wint one direct contribuiscono alle strutture neurali durante lo sviluppo.

Ad esempio, wint uno, gli embrioni C EER MG FP a E 12,5, mostrano fluorescenza GFP principalmente nel mesencefalo, posteriore, encefalo e midollo spinale ad alto ingrandimento, si osservano proiezioni neuronali fini innervanti. Le cellule marcate della parete corporea del mesencefalo, dell'arto e della regione cranica facciale possono anche essere visualizzate e analizzate a livello cellulare mediante immunoistochimica. Come mostrato in questa sezione ottica spessa un micrometro di un embrione E 12,5 contrassegnato dalla somministrazione di tamoxifene a E 8,5, la marcatura degli anticorpi beta galatto-nucleari in rosso e la marcatura degli anticorpi GFP in verde indica le cellule mappate del destino mostrate nel mesencefalo ventrale.

Qui abbiamo combinato le cellule sono doppiamente positive a causa della natura del reporter condizionale MGFP nel cervello adulto. La densità del tessuto maturo può oscurare la fluorescenza GFP emanata dalle strutture cerebrali interne. Pertanto, la microscopia a fluorescenza a montatura intera rivela solo una debole fluorescenza GFP nella CUI superiore dell'adulto che valuta la vittoria.

Un lignaggio contrassegnato a E 8,5 su sezioni adulte con microscopia a basso ingrandimento rivela che il lignaggio WIN one dà origine a strutture mesencefaliche, tra cui il cui superiore e inferiore. In questa immagine di ingrandimento più elevato presa dal mesencefalo ventrale in prossimità dei neuroni dopaminergici, si possono vedere cellule beta cal positive nucleari e un ricco plesso assonale positivo alla GFP nella marcatura di contrasto a E 9,5 che si traduce in una sostanziale marcatura GFP che è prontamente osservabile nel colus inferiore del mesencefalo mediante fluorescenza dell'intera montatura. Il lignaggio WINT one marcato a E 9.5 sulle sezioni adulte è concentrato nel kaulu inferiore come si vede con la microscopia a basso ingrandimento.

In questa immagine con ingrandimento più elevato presa dal mesencefalo ventrale nei neuroni dopaminergici, si possono vedere cellule beta gel nucleari positive e un ricco plesso assonale GFP positivo. Così, mentre i neuroni derivati da win one marcati a E 8.5 rispetto a E 9.5 sono progressivamente limitati dal contribuire al mesencefalo dorsale. Il lignaggio WIN one persiste nel contribuire al mesencefalo ventrale.

Vi abbiamo appena mostrato la procedura per la mappatura genetica del destino inducibile per marcare e tracciare le linee cellulari in vivo. Questo ci permette di marcare le cellule in base al loro lignaggio genetico e di tracciarle nel tempo anche dopo che l'espressione genica si è estinta. Con il tamoxifene somministrato a otto anni e mezzo, abbiamo dimostrato che il dominio dell'ingegno contribuisce allo sviluppo del mesencefalo oltre all'intero mesencefalo nell'adulto.

Al contrario, la somministrazione di tamoxifene a nove anni e mezzo, quando il dominio di uno diventa ristretto, si traduce in un contributo più limitato allo sviluppo del mesencefalo durante l'embriogenesi, che persiste nell'adulto. Quando si esegue questa procedura, è importante considerare che il sistema contrassegna le cellule, a mosaico, e quindi non tutte le cellule in una particolare struttura possono essere etichettate. Ciò è probabilmente dovuto alla linea CRE er o allele del reporter condizionale che viene utilizzato.

È importante sottolineare che, sebbene la marcatura cellulare sia a mosaico, il modello e la distribuzione delle cellule di mare sono altamente riproducibili. Abbiamo scoperto che la somministrazione di tamoxifene per via orale è vantaggiosa rispetto alla somministrazione per iniezione interperitoneale perché riduce al minimo l'infiammazione nello spazio interperitoneale e il danno meccanico agli embrioni. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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