Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule In Vivo

Le mappe del destino cellulare vengono generate marcando e tracciando le cellule in vivo per determinare come i progenitori contribuiscano a specifiche strutture e tipi cellulari nei tessuti in via di sviluppo e in quelli adulti. Un progresso in questo campo è rappresentato dal tracciamento genetico inducibile del destino cellulare, o GIFM, che associa l'espressione genica e i comportamenti cellulari in vivo per creare mappe del destino basate sulla linea genetica. Ciao, mi chiamo Deborah Ellisor del laboratorio di Mark Services e del dipartimento di Biologia Molecolare, Biologia Cellulare e Biochimica della Brown University.

Oggi i miei colleghi Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown e io illustreremo una procedura per la mappatura genetica indotta del destino cellulare. Utilizziamo questa procedura in laboratorio per studiare lo sviluppo precoce del cervello. Possiamo inoltre applicare questa tecnica a studi di inattivazione genica e a modelli animali di malattie umane.

Iniziamo con gli embrioni X cre, E-R-M-G-F-P. L'allele reporter MGFP LAE è presente in tutte le cellule, rappresentate dagli ovali grigi X cre, er, dove X indica elementi regolatori del gene. L'espressione di C ER è controllata in modo spazialmente ristretto al dominio di espressione del gene X, mostrato in blu, e la proteina CRE ER è sequestrata nel citoplasma da HSP 90.

In assenza di Tamoxifene, il reporter sarà spento. L'amministrazione di Tamoxifene determina la marcatura delle cellule in un determinato destino nel dominio X poiché il CER viene rilasciato dall'HSP 90, si trasloca nel nucleo ed elimina il cassetto di stop dall'allele reporter. La ricombinazione permanente ed ereditabile assicura che le cellule esprimano costitutivamente MG FP LA Z. La combinazione dell'allele reporter CER e del Tamoxifene consente la marcatura quando una popolazione cellulare viene inizialmente etichettata in una regione cerebrale primordiale dell'embrione sulla base dell'espressione genica; queste cellule marcate nel loro destino vengono seguite anche dopo che l'espressione genica iniziale utilizzata per attivare il CER si è interrotta.

In questo modo, la distribuzione finale e il destino terminale di una linea cellulare geneticamente definita possono essere identificati nell'adulto. Questa procedura inizia con la preparazione di una soluzione di tamoxifene a 20 milligrammi per millilitro, sciogliendo 200 milligrammi di tamoxifene in 10 millilitri di olio di mais preriscaldato in un flacone di vetro per inalazione.

Quindi incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per due ore su un vortice Tator. Proteggere occasionalmente la soluzione stock di Tamoxifene preparata dalla luce avvolgendo il flacone con della pellicola di alluminio e conservarla a quattro gradi Celsius. La soluzione stock può essere utilizzata per un periodo fino a un mese.

Per esperimenti di mappatura del destino cellulare, costituire una coppia riproduttiva composta da una femmina wild type Swiss Webster e da un maschio portatore di un allele CreER specifico per un gene e di un allele reporter. Ai fini di questa dimostrazione, utilizzeremo un maschio win to one CreER MG FP. Controllare ogni mattina la femmina Swiss Webster per verificare la comparsa di un tappo vaginale.

Indicare la mattina del giorno in cui si osserva il tappo vaginale come 0,5 giorni post coitum e calcolare la data di somministrazione del Tamoxifene. A partire da questo punto iniziale, in questo esperimento, il Tamoxifene verrà somministrato al giorno embrionale 8,5. Utilizzando una siringa da un millilitro con un ago per alimentazione animale, aspirare 200 microlitri della soluzione stock di Tamoxifene.

Trattenere saldamente la femmina Swiss Webster gravida cronometrata afferrando la pelliccia del collo e della schiena per immobilizzare la testa e girare il topo in modo che il lato ventrale sia rivolto verso l'alto. Tenere la coda tra le dita libere per mantenere il corpo in linea retta. Successivamente, inserire l'ago da alimentazione nell'angolo della bocca e guidare delicatamente l'ago parallelamente al palato fino a quando la punta dell'ago da alimentazione si trova approssimativamente all'altezza dell'occhio.

Inclinare delicatamente la testa all'indietro per accedere all'esofago. Guidare l'ago oltre l'epiglottide e lungo l'esofago verso lo stomaco. Prestare attenzione a non entrare nella trachea.

Una volta che l'ago di somministrazione è nello stomaco, somministrare il tamoxifene ed estrarre l'ago. Quindi restituire la femmina alla sua gabbia fino alla data della dissezione. Alla data della dissezione, gli embrioni a 12,5 giorni di sviluppo (E 12.5) della femmina gravida con tempo controllato vengono dissecati liberamente e quindi valutati per la marcatura GFP.

In un embrione positivo per GFP, osserviamo che i neuroni derivati dal wind one contribuiscono al mesencefalo, al rombencefalo e al midollo spinale. Il reporter MG FP etichetta le proiezioni assonali, che possono essere osservate anche in embrioni trasferiti, positivi per GFP, montati in casa su una piastra di Petri contenente PPS e fotografati utilizzando un picture frame. Dopo aver fotografato gli embrioni, utilizzare pinzette per staccare un piccolo pezzo di coda da ciascun embrione e posizionare ogni frammento in una provetta PCR. I tessuti verranno sottoposti a genotipizzazione mediante PCR per entrambi gli alleli per confermare i risultati osservati tramite analisi whole mount.

Le seguenti procedure ci consentono di analizzare come le cellule marcate derivate da regioni embrionali si distribuiscono nel cervello adulto prima di iniziare la craniotomia. Verificato mediante pinzatura del dito del piede che il topo è completamente anestetizzato, si eseguono incisioni per accedere al cuore attraverso la gabbia toracica.

Successivamente inserire un ago a farfalla nell'apice o nel ventricolo sinistro del cuore e fissarlo con la pinza a C. Creare un sito di uscita del liquido nell'atrio destro con le forbici, quindi perfondere da 10 a 15 millilitri di soluzione salina ghiacciata fino a quando il liquido non diventa limpido. Seguire con 20-25 millilitri di paraformaldeide al 4%.

Una volta completata la perfusione intracardiaca, rimuovere la testa con le forbici recidendo la colonna vertebrale appena sopra le spalle. Passare un bisturi lungo la linea mediana dorsale della testa, dalla regione rostrale fino al cottle, per tagliare il cuoio capelluto ed esporre il cranio. Con il bisturi, raschiare via tutti i tessuti in eccesso o muscolatura residua dai lati e dalla parte posteriore del cranio.

Con una pinzetta, perforare il cranio lungo la linea mediana, appena a livello rostrale ai bulbi olfattivi, creando un piccolo foro per inserire le punte di un paio di forbici fini. Inserire le forbici fini in questo foro ed effettuare due incisioni bilaterali partendo dalla linea mediana, seguendo la lunghezza dei bulbi olfattivi. Questo taglio fratturerà il cranio all'incrocio tra l'osso nasale e l'osso frontale, consentendo un buon accesso alle forbici.

Tagliare lungo le suture sagittali del cranio, avendo cura di mantenere le punte delle forbici orientate lontano dal cervello per evitare di danneggiare il tessuto sottostante. Successivamente, afferrare delicatamente il cranio con una pinzetta ed eliminare l'osso lungo l'incisione mediale per esporre il cervello. Il cranio può staccarsi in piccoli frammenti o rompersi in sezioni più grandi.

Continuare a utilizzare la pinzetta per rimuovere tutte le ossa frontali parietali, interparietali e occipitali. Liberare i paraoculi situati lungo i margini laterali del cervello a livello del cervelletto pizzicando delicatamente le ossa sferiche su ciascun lato. Utilizzare le forbici per tagliare con attenzione la parte dorsale dell'osso che circonda il tronco encefalico.

Inserire un lato delle forbici appena al di sotto del margine dorsale dell'osso, partendo dal punto in cui è stato reciso il midollo spinale e tagliando in direzione del cervelletto. Per liberare il tronco encefalico e il cervelletto. Rimuovere l'osso residuo attorno al tronco encefalico con la pinzetta.

Allontanare delicatamente le ossa, girare la testa con il lato dorsale verso il basso e utilizzare la pinzetta per recidere i nervi cranici e liberare il cervello dal cranio. Posizionare il cervello in una capsula di Petri contenente ghiaccio. Valutare il cervello adulto per la marcatura GFP in PPS freddo, utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza e fotografare con un telaio per immagini.

In questo esempio, il mesencefalo è marcato da GFP oltre al suo utilizzo per l'analisi della linea cellulare durante l'embriogenesi e nell'adulto; inoltre, la GIFM può essere combinata con altre applicazioni comunemente usate in biologia dello sviluppo, come la microdissezione e gli esperimenti su espianti di tessuto. Ad esempio, il mesencefalo ventrale rappresenta la zona progenitrice per i neuroni dopaminergici in via di sviluppo, che esprimono il gene wind one. Pertanto, l'isolamento del mesencefalo ventrale mediante microdissezione consente di creare un ambiente in vitro per studiarne ulteriormente lo sviluppo.

Questo rappresenta solo un esempio di utilizzo della GIFM per isolare una zona progenitrice di interesse definita dalla storia genetica. Per iniziare questa procedura, trasferire gli embrioni positivi per GFP precedentemente identificati in PBS sterile freddo di ghiaccio in una piastra per colture cellulari utilizzando forbici fini. Rimuovere la porzione cefalica di un embrione tagliando trasversalmente coddled a rommy.

Successivamente, rimuovere la porzione rostrale della testa effettuando un taglio coronale attraverso il cefalone. Questo esporrà una struttura tubulare in cui il quarto ventricolo, attraverso la vescicola mesencefalica, forma un condotto tra i tessuti dorsale e ventrale. Inserire con attenzione le punte delle forbici nel quarto ventricolo e praticare un'incisione lungo la linea mediana dorsale, estendendola fino alla regione rostrale per aprire completamente il tubo, ottenendo così una preparazione a libro aperto.

Ora il mesencefalo ventrale sarà esposto medially. Mentre le due metà dorsali del mesencefalo si troveranno lateralmente, potrebbe essere necessario rimuovere qualsiasi tessuto non neurale residuo al di sotto del mesencefalo ventrale. Affinché l'espianto giaccia piatto, dovrebbe ora assomigliare a una farfalla in cui il mesencefalo dorsale rappresenta le ali e il tronco mesencefalico la coda.

Per isolare ulteriormente il mesencefalo ventrale per analisi mediante fax o esperimenti di coltura cellulare, rimuovere le porzioni laterali del tessuto. Ora mostreremo alcuni risultati rappresentativi della GIFM. In questo esperimento, le cellule che esprimono WINT una marcata a E 8,5 vengono visualizzate per determinare in che modo le cellule dirette da wint una contribuiscono alle strutture neurali durante lo sviluppo.

Ad esempio, embrioni C EER MG FP ottenuti a E 12,5 mostrano fluorescenza GFP principalmente nel mesencefalo, nell'encefalo posteriore e nel midollo spinale; a ingrandimento elevato si osservano fini proiezioni neuronali che innervano. Le cellule marcate nel mesencefalo, nella parete del corpo, nelle estremità e nella regione cranio-facciale possono essere visualizzate e analizzate a livello cellulare mediante immunoistochimica. Come mostrato in questa sezione ottica spessa un micrometro di un embrione a E 12,5 marcato mediante somministrazione di tamoxifene a E 8,5, l'etichettatura con anticorpo anti-beta-galattosidasi nucleare in rosso e l'etichettatura con anticorpo anti-GFP in verde indicano cellule il cui destino è stato tracciato, visibili nel mesencefalo ventrale.

Qui le cellule combinate sono doppiopositive a causa della natura del reporter condizionale MGFP nel cervello adulto. La densità del tessuto maturo può oscurare la fluorescenza GFP proveniente da strutture cerebrali interne. Pertanto, la microscopia a fluorescenza su preparato intero rivela solo una debole fluorescenza GFP nella CUI superiore dell'adulto durante la valutazione del risultato.

Una linea cellulare marcata all'E 8,5 su sezioni di adulto osservate con microscopia a basso ingrandimento rivela che la linea cellulare WIN dà origine a strutture del mesencefalo, inclusi il collicolo superiore e il collicolo inferiore. In questa immagine ad alto ingrandimento ottenuta dalla regione ventrale del mesencefalo in prossimità dei neuroni dopaminergici, si possono osservare cellule positive per il beta-cal nucleare e un ricco plesso assonale positivo per GFP, in contrasto. Il marcamento all'E 9,5 determina un'etichettatura GFP sostanziale, facilmente osservabile nel collicolo inferiore del mesencefalo mediante fluorescenza su preparato intero. La linea cellulare WINT marcata all'E 9,5 su sezioni di adulto risulta concentrata nel collicolo inferiore, come visibile con microscopia a basso ingrandimento.

In questa immagine ad ingrandimento maggiore, ottenuta dalla regione ventrale del mesencefalo dei neuroni dopaminergici, si possono osservare cellule positive per la beta-gal nucleare e una ricca plessiformazione assonale positiva per GFP. Pertanto, mentre i neuroni derivati da WIN uno, marcatori all'E 8,5 rispetto all'E 9,5, sono progressivamente limitati nel contribuire al mesencefalo dorsale, la linea cellulare di WIN uno persiste nel contribuire al mesencefalo ventrale.

È stato appena illustrato il procedimento per il mappaggio genetico inducibile della linea cellulare, utile per etichettare e seguire le linee cellulari in vivo. Questo approccio consente di marcare le cellule in base alla loro linea genetica e di tracciarle nel tempo, anche dopo che l'espressione genica si è interrotta. Somministrando tamoxifene a otto giorni e mezzo, abbiamo dimostrato che il dominio wit uno contribuisce allo sviluppo del mesencefalo, oltre a formare l'intero mesencefalo nell'adulto.

Al contrario, l'amministrazione di tamoxifene a nove giorni e mezzo, quando il dominio wit1 diventa ristretto, determina un contributo più limitato allo sviluppo del mesencefalo durante l'embriogenesi, che persiste nell'adulto. Quando si esegue questa procedura, è importante considerare che il sistema marca le cellule in modo mosaicale e, pertanto, non tutte le cellule di una determinata struttura potrebbero essere etichettate. Ciò è probabilmente dovuto alla linea CRE er o all'allele reporter condizionale utilizzata.

È importante notare che, sebbene l'etichettatura cellulare sia mosaicica, il modello e la distribuzione delle cellule mar è altamente riproducibile. Abbiamo scoperto che l'amministrazione di tamoxifene mediante gavaggio orale è vantaggiosa rispetto alla somministrazione mediante iniezione intraperitoneale, poiché minimizza l'infiammazione dello spazio intraperitoneale nonché i danni meccanici agli embrioni. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.