Espressione genica basata su un sistema regolabile inducibile Tet-On in vivo: un sistema di espressione genica indotta da tetraciclina per l'attivazione della trascrizione genica bersaglio in un modello murino

Il sistema tetraciclina-On o Tet-On è un sistema di espressione genica condizionale che attiva l'espressione del gene di interesse in presenza di tetraciclina o del suo analogo, la doxiciclina.

Iniziare con un topo geneticamente modificato con un genoma modificato contenente un gene che codifica per la proteina attivatrice trascrizionale controllata da tetraciclina inversa, o rtTA, guidata da un promotore specifico del fegato nelle cellule epatiche o negli epatociti. Inoltre, il topo contiene un gene di interesse sotto il controllo dell'operatore della tetraciclina o sequenze di tetO situate a monte e fuse selettivamente in un promotore minimo. Il tetO e il promotore sono chiamati elemento responsivo alla tetraciclina, o TRE.

L'rtTA espresso - una proteina di fusione che comprende il repressore tet, il tetR e il dominio di transattivazione VP16 della proteina virale - forma dimeri, che sono inattivi e non possono legarsi alla sequenza tetO del TRE, impedendo l'attivazione dell'espressione genica bersaglio.

Preparare una soluzione contenente doxiciclina e saccarosio. L'aggiunta di saccarosio aumenta l'appetibilità. Dopo il filtraggio, fornire al topo la soluzione di doxiciclina-saccarosio come acqua potabile. La doxiciclina somministrata si accumula nel fegato.

Negli epatociti, la doxiciclina si lega all'rtTA, causando un cambiamento conformazionale e un aumento dell'affinità per il sito di legame del DNA tetO. Il dominio di legame al DNA tetR di rtTA legato alla doxiciclina si lega alla sequenza tetO dell'elemento TRE. Il dominio VP16 recluta ulteriormente l'RNA polimerasi, portando alla trascrizione, alla formazione dell'mRNA e alla successiva espressione del gene bersaglio reporter a valle.