Anisotropia di fluorescenza per determinare l'affinità di legame tra fattore di trascrizione e DNA

Il fattore di trascrizione, TF, è una proteina che si lega alla regione specifica del DNA di un gene e regola la trascrizione.

Per misurare le interazioni TF-DNA mediante anisotropia di fluorescenza, prendere una piastra a più pozzetti. Aggiungere al pozzetto il gel fuso miscelato con una soluzione tampone, contenente concentrazioni note di DNA di riferimento marcato con fluorofori comprendente un sito di legame TF e una maggiore concentrazione di molecole di TF, e incubare.

Poiché il DNA di riferimento marcato si distribuisce nel gel, una maggiore concentrazione di molecole di TF assicura che tutte le molecole di DNA siano legate al TF. Aggiungere una soluzione tamponata contenente DNA concorrente non marcato con una mutazione a punto singolo.

Analizza il gel della piastra utilizzando la microscopia anisotropia a fluorescenza ad alte prestazioni.

La luce polarizzata eccita il fluoroforo di riferimento legato al DNA, che si riorienta a causa del tumbling molecolare ed emette luce depolarizzata multidirezionale, un fenomeno chiamato anisotropia di fluorescenza, FA.

Dopo il legame con il TF, il peso molecolare del fluoroforo legato al DNA di riferimento aumenta e cade più lentamente, emettendo più luce polarizzata che aumenta la FA.

Il DNA concorrente non marcato si diffonde attraverso la matrice di gel nel tempo, formando un gradiente di concentrazione da alto a basso. Una maggiore concentrazione di DNA concorrente non marcato sostituisce il DNA di riferimento marcato, legandosi al TF. Gli oligomeri di riferimento marcati rilasciati cadono più velocemente, diminuendo l'FA.

Traccia il gradiente di concentrazione del DNA del fluoroforo e del DNA concorrente nel tempo, che diminuisce man mano che più molecole di DNA concorrenti sostituiscono il DNA di riferimento.