RNA interferenza nelle zecche

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la tecnica dell'interferenza dell'RNA nelle zecche mediante iniezione. Ciò si ottiene sintetizzando prima l'RNA a doppio filamento del gene o dei geni di interesse. L'RNA viene quindi iniettato nelle zecche, dopodiché vengono tenute in una camera di umidità per 24 ore.

Dopo questo periodo di detenzione, le zecche possono nutrirsi di un animale come una pecora. Vengono determinati i parametri di alimentazione come il peso, la muta e la posizione degli ovuli e l'espressione del gene o dei geni bersaglio di interesse mediante R-T-P-C-R in tempo reale. In definitiva, è possibile ottenere risultati che dimostrano l'effetto del silenziamento di geni mirati sulla biologia delle zecche attraverso la valutazione dei parametri biologici delle zecche e dell'espressione genica mediante R-T-P-C-R in tempo reale.

Il nostro gruppo lavora con le zecche cercando di caratterizzare gli eventi molecolari all'interfaccia patogeno delle zecche per utilizzare queste informazioni di base per sviluppare metodi per il controllo dell'infestazione da zecche e la trasmissione di agenti patogeni all'uomo e agli animali. L'interferenza dell'RNA è emersa come uno strumento essenziale in questa ricerca perché è l'unico metodo disponibile per la manipolazione genetica delle zecche. La funzione di molti geni delle zecche è sconosciuta.

L'interferenza dell'RNA ci permette di definire il ruolo dei geni delle zecche e l'espressione genica in molti aspetti della biologia delle zecche, tra cui l'accoppiamento, la riproduzione, l'alimentazione, la digestione, la funzione delle ghiandole salivari e la competenza del vettore delle zecche per la trasmissione di agenti patogeni. A dimostrare la procedura sarà il team di interferenza dell'RNA delle zecche del nostro laboratorio, il Dr.Ed Lewin, studente laureato e Busby ed io. Per generare RNA a doppio filamento, sintetizzare prima primer oligonucleotidici contenenti sequenze di promotori T sette per la trascrizione in vitro dell'RNA.

Ad esempio, derma center vari lesin. Utilizzare i primer oligonucleotidici D otto A T 75 e D otto DVT 73 mostrati qui. Amplificare il gene bersaglio mediante R-T-P-C-R utilizzando 10 picomoli di ciascun primer oligonucleotidico e da uno a 10 nanogrammi di RNA totale di zecche.

Quindi, purificare il prodotto PCR. Quindi utilizzare otto microlitri o circa 100 nanogrammi per sintetizzare l'RNA a doppio filamento. Per preparare prima le zecche per l'iniezione, lavare le zecche nella seguente serie di soluzioni, acqua del rubinetto, acqua distillata al 3%, acqua distillata al 3%, etanolo al 70% e due lavaggi finali con acqua distillata.

Eseguire ogni lavaggio in una provetta da centrifuga usa e getta da 50 millilitri agitando. Quindi decantare la soluzione attraverso uno schermo metallico a maglia fine. Bloccare le zecche ad asciugare su carta assorbente, quindi aliquotare le zecche in gruppi da 20 a 50 a seconda dell'esperimento.

Metti ogni gruppo in una tazza di plastica da 1,25 once con un coperchio aderente ed etichetta ogni tazza con il gruppo sperimentale. Numero, quindi, assemblare un team RNAi composto da tre persone che eseguirà il processo di iniezione. La prima persona posiziona ogni zecca su un doppio nastro adesivo apposto su un foglio di cera dentale rossa di tre x sei pollici.

La seconda persona inietta le zecche e la terza monitora le zecche dopo l'iniezione, respira anidride carbonica sulle zecche per attivarle e conta e trasferisce le zecche vive in tazze etichettate con il numero del gruppo sperimentale. Tutti i membri del team devono indossare guanti monouso Per iniziare il processo di iniezione delle zecche, catturare una zecca utilizzando una pinza fine dumont e posizionarla con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un doppio nastro adesivo apposto sul foglio di cera dentale rossa Posizionare strettamente le zecche in gruppi di cinque. Metti una piccola striscia di nastro adesivo sulle parti della bocca di tutte e cinque le zecche.

Per trattenerli ulteriormente, lasciare la maggior parte del corpo esposta in modo che il processo di iniezione possa essere osservato dall'iniettore di zecche. Per iniettare la zecca, praticare un foro nel quadrante inferiore destro della superficie ventrale dell'esoscheletro utilizzando una siringa da insulina a espulsione singola dotata di un ago da mezzo pollice calibro 29. Quindi, iniettare immediatamente le zecche con 0,2-0,5 microlitri di soluzione di RNA a doppio filamento utilizzando una siringa Hamilton su misura e un ago da un pollice calibro 33 con una punta smussata di 45 gradi, posizionare bene l'ago nella cavità della zecca per garantire il posizionamento e la ritenzione dell'RNA a doppio filamento.

Anche se il fluido viene rilasciato dopo l'iniezione, il posizionamento profondo dell'ago per l'iniezione assicurerà che una quantità sufficiente di RNA a doppio filamento si depositi nella cavità della zecca per causare il silenziamento genico. Iniettare le zecche, che causeranno la perdita di emolinfa e la morte della zecca. Subito dopo aver iniettato le zecche, raccoglierle dal doppio nastro adesivo con la pinza fine e metterle in un contenitore di plastica per il recupero.

Le zecche rimarranno brevemente inattive dopo l'iniezione, ma dovrebbero presto iniziare a strisciare intorno al piatto. Attiva le zecche respirando anidride carbonica su di esse. Una volta che le zecche strisciano e sono attive, la ferita da iniezione guarirà rapidamente e molto probabilmente sopravviveranno.

Conta le zecche in ogni gruppo sperimentale e metti ogni gruppo in un bicchiere di plastica etichettato con un coperchio ben aderente. Sostituisci tutte le zecche che muoiono nel gruppo corrente prima di iniettare il gruppo sperimentale successivo. Pulire la siringa di Hamilton prima di iniettare il gruppo sperimentale successivo riempiendo ed espellendo la siringa con perossido di idrogeno fresco al 3%.

15 volte seguite da 15 lavaggi con acqua sterile. Fare attenzione a non piegare lo stantuffo della siringa di Hamilton, altrimenti lo stantuffo non si muoverà agevolmente e non risponderà al tocco delicato richiesto per l'iniezione di zecche. Dopo l'iniezione, mettere le zecche in una camera con un contenitore riempito con acqua e solfato di potassio, che mantiene alta l'umidità e loro per un giorno.

Successivamente, posizionare le singole zecche nelle celle di alimentazione delle zecche incollate a una pecora e consentire loro di nutrirsi con un numero uguale di zecche maschili o femminili non iniettate, a seconda del sesso che non è stato iniettato. Raccogliere e agitare le zecche femmine dalla cella di alimentazione dopo che hanno completato l'alimentazione per circa 10 giorni o quando le femmine di controllo sono cadute, l'ospite incuba ogni gruppo di zecche nella camera di umidità fino al completamento della posizione degli ovuli. Valutare la posizione degli ovuli per gruppo pesando la massa di uova prodotta da tutte le zecche di un gruppo per valutare il fenotipo della zecca dopo l'alimentazione.

Determina il numero di zecche sopravvissute e calcola il peso delle zecche, nonché la posizione degli ovuli e la fertilità delle uova. A seconda del gene bersaglio e degli obiettivi dello studio, possono essere eseguite altre analisi per confermare il silenziamento genico mediante R-T-P-C-R. Dopo l'alimentazione, sezionare le ghiandole salivari e le viscere dalle singole zecche dai gruppi di controllo iniettati con RNA a doppio filamento, quindi estrarre l'RNA totale dai singoli campioni di tessuto.

Analizza i trascritti del gene bersaglio nei singoli tessuti mediante R-T-P-C-R in tempo reale e normalizza i livelli di RNA contro l'RNA ribosomiale della zecca 16. Utilizzando il metodo della norma genetica, eseguire curve di dissociazione alla fine della reazione per garantire che si formi un solo amplicone e che gli ampliconi si denaturano costantemente nello stesso intervallo di temperatura per ogni campione, confrontare i valori CT normalizzati per i livelli di mRNA tra il controllo iniettato e il doppio filamento. Zecche iniettate con RNA utilizzando il test T dello studente.

Il protocollo qui descritto è stato utilizzato nel nostro laboratorio per l'RNAi in molte diverse specie di zecche esotiche. La quantità di RNA a doppio filamento iniettato nelle zecche varia con le dimensioni della zecca. Le specie di zecche più grandi possono ospitare un volume maggiore.

I riferimenti bibliografici sono riportati nella parte scritta del protocollo che accompagna. Se il protocollo viene eseguito correttamente, si dovrebbe ottenere meno del 5% di mortalità dalla procedura di iniezione dopo 24 ore. Un tipico fenotipo dopo il knockdown genico nelle zecche è mostrato qui, dove un pannello di zecche è stato iniettato con pool di RNA a doppio filamento che sono stati utilizzati per lo screening degli antigeni protettivi delle zecche.

Nelle zecche esaminate al microscopio ottico, si può osservare una degenerazione cellulare nei tessuti delle zecche. I cambiamenti fenotipici possono anche essere accompagnati da perdita di funzionalità. Ad esempio, l'RNAI di SUBIN produce maschi sterili che non possono accoppiarsi con successo con le femmine a seguito dell'interferenza dell'RNA e delle zecche.

Altri metodi possono essere utilizzati per determinare l'impatto del silenziamento genico sull'espressione genica e proteica e sulla biologia delle zecche, tra cui la microscopia R-T-P-C-R in tempo reale, la microscopia elettronica ottica o confocale. Genomica o proteomica. L'interferenza dell'RNA può essere effettuata anche in colture cellulari di zecche e fornisce un metodo in vitro per lo studio delle interazioni tra patogeni e cellule di zecca.