Name: Ad alta efficienza di trasduzione delle cellule tumorali del fegato da adeno-associato ricombinante sierotipo Virus 3 Vettori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Scopri come produrre vettori AAV3 per trasdurre efficacemente le cellule tumorali epatiche umane. Questo protocollo dettagliato permette di ottenere un'alta efficienza di trasferimento genico per applicazioni terapeutiche.

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Ringraziamo Drs. R. Jude Samulski e Xiao Xiao per i loro doni tipo di ricombinante AAV3 e AAV-EGFP plasmidi, rispettivamente, e il dottor Tomlinson Gail generosamente per fornire cellule Hep293TT. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Public Health Service concedere borse di R01 HL-076901, R01 HL-097088, e DK P01-058327 (Progetto 1) dal National Institutes of Health (AS).

1. Confezionamento di virus ricombinante adeno-associato sierotipo 3 (rAAV3) Vettori <ol><li> Vai al sito: " <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "e calcolare la quantità di DNA. </li><li> Pre-mix plasmidi pHelper (helper Adenovirus), pACG2c3 (AAV helper) e pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vettoriale) in mezzo senza FBS e antibiotici. Volume totale dovrebbe essere 8750 microlitri per una decina di 15 cm 2 piastre. </li><li> Aggiungere direttamente 1.250 ml di PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) in soluzione di DNA al punto 1.2. Vortex il DNA-PEI soluzione per alcuni secondi. </li><li> Incubare DNA-PEI soluzione per formare un complesso per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). </li><li> Aggiungere 1 ml di DNA-PEI soluzione per 15 cm 2 piastre. </li><li> Rimuovere media dopo 4 ore, sostituendo con fresche 25 ml di mezzo di completa +10% FBS (C-DMEM). </li><li> Settantadue ore dopo la trasfezione, le cellule raschiare e versare in una provetta per centrifuga da 250 ml. </li><li> Rotazione a 3000 rpm, a 4 ° C per 10 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di RB TMS buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Trasferimento in un nuovo tubo di 15 ml. </li><li> Congelamento in ghiaccio secco-etanolo bagno per 10 minuti e scongelare a 37 ° C per 10 min. Ripetete tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di 4,8 M MgCl 2 e 2 l di benzonasi (25 U / mL, Novagen, Cat # 70664-3). Vortex e incubare a 37 ° C per 40 min. </li><li> Spin down a 4.000 giri, a 4 ° C per 40 minuti e raccogliere il surnatante (lisato chiarificato). </li><li> In una ML 13 Quick-Seal provetta da centrifuga (Beckman, Cat # 342413), carico gradiente Iodixanolo (OptiPrep, Cat # 1114542) da cima a fondo: 2 ml di 15%, 2 ml di 25%, 1,5 mL di 40% e 1,5 mL di 60% Iodixanolo. Caricare il surnatante (Passo 1.12) sulla parte superiore del gradiente Iodixanolo. Riempire i tubi con tampone RB TMS. </li><li> Centrifugare a 75.000 rpm per 1 ora a 16 ° C con rotore Beckman 90TI. </li><li> Raccogliere la frazione Iodixanolo 40% con l'inserimento di una siringa al 40-60% confine. </li><li> Trasferire la frazione Iodixanolo 40% in un tubo da 50 ml e portare a 40 ml con tampone A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5). </li><li> Montare l'apparato di filtrazione con HITRAP Q HP colonna (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Lavare la colonna con le seguenti tampone: 25 ml di tampone A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5); 25 mL di tampone B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5), 50 ml di tampone A; 40 ml di campione virus nel tampone A, 50 ml di tampone A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 20 ml di tampone C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5); </li><li> Raccogliere C in un buffer da 20 ml Apollo concentratori (Orbital Biosciences). Centrifugare a 3.000 giri, a 4 ° C per 10 min. </li><li> Gettare il flow-through e aggiungere 20 ml di acqua refrigerata PBS e centrifugare a 3.000 giri, a 4 ° C per 10 min. </li><li> Gettare il flow-through e aggiungere 500 ml di PBS freddo. Lavare i vettori fuori dalla membrana e trasferimento siliconata provette Eppendorf e conservare congelata in piccole aliquote a -80 ° C. </li></ol> 2. Determinazione del rAAV3 Titoli Vector <ol><li> Scongelare 10 L del virus purificato in una provetta Eppendorf sul ghiaccio. Aggiungere 40 ml di DDH 2 O. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di benzonasi (25 U / mL, Novagen, Cat # 70664) e incubare a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Prelevare 50 ml di standard di plasmide (0,2 ng / mL) in un'altra provetta Eppendorf. </li><li> Aggiungere 50 ml di 100 mM NaOH in ogni provetta e incubare a 65 ° C per 30 min. </li><li> Freddo su ghiaccio immediatamente per almeno 5 minuti. </li><li> Tagliare a membrana di trasferimento (Millipore, Cat # INYC00010) secondo Bio-Dot filtro di carta (Bio-Rad, Cat # 1620161). Sciacquare membrana in SSC 10x con tre filtri di carta per 20 min. </li><li> Set di slot blot SF Apparatus (Bio-Dot, Cat # 170-6542). Connettersi a un fiasco vuoto e aggiungere 100 ml di SSC 10x a cancellare apparato slot. </li><li> Aggiungere 100 ml di SSC 20x e 1 ml di colorante di caricamento 6x a ciascuno dei campioni al punto 2.5. </li><li> Carico di 100 l di ciascun campione sulla membrana nell'apparato macchia slot. </li><li> Aggiungere altri 100 ml di SSC 10x in ciascuno dei campioni. </li><li> Ripetere i punti 2.9 e 2.10 fino a tutto il campione passa attraverso la membrana. </li><li> Smontare l'apparato macchia slot e rimuovere la membrana. Metterlo in Linker ispettore SL-1000 Crosslinker UV. Girare su "Energia", "Optimal Crosslink" (mostra 1200) e premere "Start". </li><li> Far bollire 1 ml di sperma di salmone (SS) DNA (Fisher, Cat # NC9753983) per 5 min. Freddo in ghiaccio per almeno 5 minuti. </li><li> Preparare la pre-ibridazione soluzione mescolando 27,5 mL di DDH 2 O, 15 ml di SSC 20x, 5 ml di soluzione di 50x Denhardt, 1,25 ml di SDS 20%, 0,25 ml di Polya e 1 ml di SS DNA dal punto 2.13. </li><li> Sospendere la membrana in 25 mL di soluzione pre-ibridazione in un cilindro di vetro ricoperti e incubare a 65 ° C in una camera di ibridazione durante la notte. </li><li> Diluire 50 modelli ng di DNA in 10 ml di DDH 2 O. Fate bollire a 100 ° C per 5 minuti e raffreddare immediatamente in ghiaccio per almeno 5 minuti. </li><li> Centrifugare a 3.000 rpm a temperatura ambiente per 1 min. Aggiungere 2 ml di 10 mM dNTPs 3 (manca dCTP), 2 ml di Mix Hexanucleotide (Roche, Cat # 11277081001), 1 l di Klenow (Roche, Cat # 11008404001) e 5 ml di α -32 P-dCTP. Incubare a 37 ° C per 10 min. </li><li> Centrifuga G-50 colonne (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) a 3.000 rpm per 2 minuti. caricare la sonda nel passo 2,17 nella colonna. Centrifugare a 3.000 rpm per 2 minuti e raccogliere i flow-through. </li><li> Conte radioattività. Lessare la sonda a 100 ° C per 5 minuti e chill su ghiaccio immediatamente per almeno 5 minuti. </li><li> Aggiungere la sonda (6x10 5 cpm / ml) nel pre-ibridazione soluzione con membrana. </li><li> Incubare per una notte a 65 ° C in una camera di ibridazione. </li><li> Gettare la soluzione di ibridazione e risciacquare la membrana in 2x SSC +0,1% SDS a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Scartare la soluzione e lavare la membrana in 0.1x SSC +0,1% SDS a 65 ° C per 30 min. </li><li> Scartare la soluzione e lavare la membrana in 0.1x SSC a breve RT. </li><li> Esporre il film a -80 ° C per 6 ore e sviluppare il film. Un risultato tipico è mostrato in Figura 1. </li></ol> 3. rAAV3 Vector-mediata trasduzione e l'espressione del transgene nelle cellule umane di cancro del fegato <ol><li> Semi di 1x10 4 celle (sia Huh7 o Hep293TT) in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti. Incubare in un incubatore umidificato CO 2 per almeno 18 ore. </li><li> Togliere terreno dalla piastra a 96 pozzetti. </li><li> Lavare le cellule due volte con 50 ml di mezzo senza FBS e antibiotici e rimuovere. </li><li> Aggiungere 50 ml di mezzo senza FBS e antibiotici e vettori rAAV a 5.000 VGS / cell. </li><li> Incubare le piastre in incubatore CO 2 per 4 ore. </li><li> Gettare il mezzo. Lavare le cellule due volte con 50 ml di terreno completo e rimuovere. </li><li> Aggiungere 150 ml di DMEM-C in ciascun pozzetto e incubare la piastra di CO 2 incubatore per 72 ore, e visualizzare l'espressione EGFP utilizzando un microscopio a fluorescenza (DMI 4000B, Leica Microsystems). </li><li> Immagini da tre pozzi di cellule infettate da virus sono analizzate quantitativamente mediante analisi software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). </li><li> Espressione del transgene è valutato come superficie complessiva di fluorescenza verde (pixel 2) per campo visivo. Un risultato tipico è illustrato nella figura 2. </li><li> Espressione del transgene può anche essere determinata mediante citometria di flusso. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Seguendo il protocollo di cui sopra, si può generare vettori AAV sierotipo in modo efficiente. Il rendimento tipico è ~ 500 microlitri contiene ~ 10 11 vgs / mL di purificato magazzino vettore. La purezza dello stock vettore è determinato dal confronto segnali di ibridazione su macchine di slot quantitativa del DNA, con e senza digestione benzonasi. Purificata rAAV3 vettori cancro al fegato umano trasdurre - epatoblastoma (HB) e del carcinoma epatocellulare (HCC) - linee cellulari in modo efficiente. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Quantitativa del DNA slot-blot analisi per la determinazione del titoli di rAAV3 vettori. Una diluizione di purificato scorte virale, digerito con benzonasi (riga in alto) sono stati analizzati su macchine di slot quantitativa del DNA con 32 P-etichettati EGFP-sonda specifica del DNA. Il titolo di AAV3 vettore è stato determinato in rapporto con 1 ng (riga centrale) o 10 ng (riga inferiore) di AAV-EGFP standard plasmide caricato sulla membrana. I numeri corrispondono alle copie del DNA. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Vettore ricombinante AAV-mediata espressione del transgene nelle cellule umane di cancro del fegato. Cellule Hep293TT, un recente costituzione linea cellulare umana epatoblastoma 4, erano o mock-infettate (a sinistra del pannello), oppure trasdotte con 5.000 VGS / cella di uno scAAV2-EGFP o scAAV3-EGFP vettori a 37 ° C per 2 ore. Espressione del transgene è stata visualizzata 72 ore post-trasduzione utilizzando un microscopio a fluorescenza.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vettori ricombinanti sulla base di una non patogeno parvovirus umano, il virus adeno-associato (AAV) sono stati sviluppati e sono attualmente in uso in un certo numero di studi clinici di terapia genica 5. In precedenza, dei 10 sierotipi più comunemente utilizzati AAV, l&#39;efficienza di trasduzione del AAV3 vettori in genere è stato segnalato per essere particolarmente bassi, sia in vitro che in vivo 1. Tuttavia, la nostra recente osservazione che AAV3 vettori trasdurre fegato umano linee cellulari tumorali estremamente bene, come determinato quantitativamente mediante citometria di flusso 2 e che AAV3 utilizza il recettore umano di crescita degli epatociti (fattore hHGFR) come un cellulare co-recettore per l&#39;iscrizione vincolante e in questi cellule 3, suggeriscono fortemente una selettiva dei tessuti di AAV3 tropismo per le cellule di fegato umano in generale, e cellule umane di cancro del fegato in particolare. Tuttavia, poiché AAV3 vettori anche trasdurre normali epatociti umani in modo efficiente 2, il loro potenziale utilizzo in applicazione della terapia genica del cancro in vivo sarebbe negativamente. Una possibile strategia per aggirare questo potenziale problema coinvolge trascrizionale-targeting delle cellule tumorali attraverso l&#39;identificazione di un prodotto gene che è selettivamente prodotta dal tumore, ma non dagli epatociti normali. Per esempio, studi precedenti hanno dimostrato che i livelli sierici di α-fetoproteina (AFP) è utilizzato come marcatore specifico per il monitoraggio della presenza, la progressione, e / o la recrudescenza di alcuni tipi di tumori del fegato, dato che epatociti normali generalmente producono piccole quantità di questa proteina. Infatti, abbiamo utilizzato AAV3 vettori contenenti il promotore AFP per indirizzare l&#39;espressione del transgene nelle cellule di cancro al fegato, ma non negli epatociti normali 2, e gli studi sono attualmente in corso per testare l&#39;efficacia di questo approccio in un modello murino xenotrapianto di cancro al fegato. Nei nostri studi ulteriori, abbiamo osservato che l&#39;efficienza di trasduzione di vari vettori AAV sierotipo può essere significativamente aumentata da mutagenesi sito-diretta di superficie esposti residui di tirosina nel capsidi virale 6-14. Dal 6 di 7 superficie esposta tirosine sono inoltre conservati in AAV3, abbiamo svolto mutagenesi sito-diretta di detti residui e osservato che l&#39;efficienza di trasduzione di tirosin-mutante AAV3 vettori è significativamente migliorata nelle cellule umane di cancro del fegato (dati non pubblicati). Gli studi sono attualmente in corso per valutare la sicurezza el&#39;efficacia della tirosin-mutante AAV3 vettori nei modelli di xenotrapianto mouse per epatoblastoma umano e il carcinoma epatocellulare, e in caso di successo, l&#39;ottimale tirosina-mutante vettori sierotipo AAV3 potrebbe rivelarsi utile per indirizzare fegato umano tumori per la terapia genica potenziale.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasi</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HiTrap Q HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>DNA di sperma di salmone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente di iodixanolo</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>Colonne G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

ad alta efficienza di trasduzione delle cellule tumorali del fegato da adeno-associato ricombinante sierotipo virus 3 vettori

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Vettori ricombinanti sulla base di una non patogeno parvovirus umano, il virus adeno-associati 2 (AAV2) sono stati sviluppati e sono attualmente in uso in un certo numero di studi clinici di terapia genica. Più recentemente, una serie di ulteriori sierotipi AAV sono stati anche isolati, che hanno dimostrato di esporre selettivo-trofismo dei tessuti in vari modelli animali piccoli e grandi 1. Dei 10 sierotipi più comunemente utilizzati AAV, AAV3 è di gran lunga il meno efficiente in trasduzione cellule e tessuti in vitro e in vivo. Tuttavia, nei nostri studi di recente pubblicazione, abbiamo documentato che AAV3 vettori trasdurre il cancro del fegato umano - epatoblastoma (HB) e di carcinoma epatocellulare (HCC) - linee di cellule estremamente efficiente perché utilizza AAV3 umano recettore del fattore di crescita degli epatociti come un cellulare co-recettore per il legame e l&#39;ingresso in queste cellule 2,3. In questo articolo, si descrivono i passaggi necessari per ottenere alta efficienza di trasduzione di cellule umane di cancro del fegato da ricombinante AAV3 vettori che trasportano un gene reporter. L&#39;uso di vettori ricombinanti AAV3 portatrice di un gene terapeutico può portare alla terapia genica potenziale dei tumori del fegato negli esseri umani.

In questo articolo, si descrive l&#39;identificazione del sierotipo del virus adeno-associati 3 (AAV3) come il vettore più efficace per le cellule umane di cancro del fegato.

Ad alta efficienza di trasduzione delle cellule tumorali del fegato da adeno-associato ricombinante sierotipo Virus 3 Vettori

Sono stati sviluppati vettori ricombinanti basati su un parvovirus umano non patogeno, il virus adeno-associato 2 (AAV2), che sono attualmente in uso in un...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre vettori attivi del virus adeno-associato sierotipo tre in grado di trasdurre in modo efficiente cellule tumorali umane del fegato. Questo risultato si ottiene innanzitutto trasfettando simultaneamente tre plasmidi diversi in cellule 2 9 3. Il secondo passaggio della procedura consiste nella purificazione delle particelle virali del virus adeno-associato tre assemblate all'interno delle cellule 2 9 3.Il terzo passaggio della procedura consiste nel determinare il titolo del ceppo purificato del vettore AAV trivalente. L'ultimo passaggio della procedura è la trasduzione di cellule umane di cancro al fegato utilizzando i vettori AAV trivalenti purificati. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano la proteina EGFP fortemente espressa nelle cellule umane di cancro al fegato mediante microscopia a fluorescenza.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nel raggiungere un'elevata efficienza di trasferimento genico ed espressione nelle cellule tumorali epatiche umane. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla produzione dei tre vettori AAV, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i vettori AAV2 più comunemente utilizzati. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà a causa della presenza di numerose fasi che possono risultare noiose; la procedura sarà dimostrata da un biologo del nostro laboratorio.Le manipolazioni sperimentali in questa sezione del protocollo vengono eseguite all'interno di una cappa a flusso laminare 48 ore prima di iniziare questa procedura. Seminare 10 piastre da coltura tessutale da 15 centimetri con la linea cellulare di rene embrionale umano 2, 9 3 in modo che le cellule siano confluenti al 70-80% il giorno della trasfezione. Utilizzare il sito web www.ge shae. com/calc per calcolare la quantità di DNA plasmidico da utilizzare per la trasfezione. Una volta calcolati i volumi corretti di DNA plasmidico, procedere alla trasfezione prelevando con una pipetta un volume adeguato di mezzo di coltura cellulare privo di FBS e antibiotici e trasferendolo in un tubo sterile da 15 millilitri.Quindi pipettare i volumi richiesti di P helper, PACG due, C3 e PDSA AAV C-B-E-G-F-P nel mezzo. Il volume totale deve essere di 8.750 microlitri per 10 piastre da 15 centimetri; pipettare 1.250 microlitri di PEI nel mezzo contenente il DNA plasmidico. Vortexare la soluzione D-N-A-P-E-I per alcuni secondi, quindi incubare la soluzione D-N-A-P-E-I per cinque minuti a temperatura ambiente per permettere la formazione dei complessi D-N-A-P-E-I. Recuperare le 10 piastre da 15 centimetri di cellule HEC 2 9 3 dall'incubatore per colture cellulari.Quindi pipettare un microlitro di soluzione D-N-A-P-E-I in ciascuna delle piastre. Incubare le piastre in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro-sei ore. Dopo quattro-sei ore, aspirare con attenzione il mezzo dalle piastre.Quindi pipettare 25 millilitri di mezzo completo con 10% di FBS in ogni piastra. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per circa 72 ore. Trascorse le 72 ore, rimuovere le piastre dall'incubatore e tornare alla cappa a flusso laminare per colture cellulari.Quindi, senza aspirare il mezzo dalla piastra, utilizzare un raschietto per cellule per staccare lo strato cellulare dal fondo della piastra nel mezzo di coltura. Versare il mezzo contenente le cellule in un tubo conico da centrifuga da 250 millilitri. Ripetere questa procedura per ciascuna delle piastre trasfettate, versando il contenuto di ogni piastra nello stesso tubo conico da centrifuga da 250 millilitri.Centrifugare il tubo contenente le cellule e il mezzo in una centrifuga refrigerata. A quattro gradi Celsius per 10 minuti a 3000 giri al minuto. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante, quindi pipettare cinque millilitri di tampone RB TMS sul pellet e risospendere. Trasferire la soluzione cellulare in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.Posizionare il tubo da 15 millilitri in un bagno di etanolo con ghiaccio secco per congelare per 10 minuti. Trascorso il tempo di incubazione, rimuovere il tubo e posizionarlo a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Per scongelare, ripetere questo ciclo di congelamento e scongelamento ulteriori due volte.Vortexare il tubo per alcuni secondi. Dopo ogni scongelamento, al termine del periodo di scongelamento finale, pipettare un microlitro di cloruro di magnesio 4,8 M e due microlitri di 25 unità per microlitro. Aggiungere la benonasi nella soluzione cellulare e vortexare per omogeneizzare.Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 40 minuti dopo l'incubazione. Posizionare il tubo in una centrifuga refrigerata a quattro gradi Celsius e centrifugare a 4.000 giri al minuto per 40 minuti. Verso la fine del periodo di centrifugazione, preparare il gradiente IAL da utilizzare per la purificazione del virus. Per fare ciò, pipettare due millilitri di 15%, due millilitri di 25%, 1,5 millilitri di 40% e 1,5 millilitri di 60% di IAL in un tubo da centrifuga sigillabile da 13 millilitri.Dopo la centrifugazione, pipettare il sopranatante S dal tubo da centrifuga, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare; trasferire il sopranatante sul gradiente IAL, quindi aggiungere nel tubo una quantità sufficiente di tampone RB TMS da riempirlo completamente. Posizionare il tubo in un rotore Beckman 90 TI, verificando attentamente che il rotore sia correttamente bilanciato. Centrifugare a 75.000 giri al minuto per un'ora a 16 gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, raccogliere la frazione IAL al 40% inserendo una siringa da cinque millilitri dotata di un ago da 18 gauge nel gradiente idal al confine tra il 40% e il 60%. Aspirare con attenzione mediante la siringa e raccogliere la frazione idal al 40%.Espellere la frazione 40% IAL dalla siringa in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi portare il volume a 40 millilitri finali con il buffer A. Assemblare l'apparato di filtrazione utilizzando una colonna High Trap Q HP seguendo le istruzioni del produttore.Quindi lavare la colonna con le seguenti soluzioni: 25 millilitri di tampone A, 25 millilitri di tampone B, 50 millilitri di tampone A, 40 millilitri del campione virale idal preparato in tampone A, 50 millilitri di tampone A e infine 20 millilitri di tampone C. Raccogliere il tampone C in un concentratore Apollo da 20 millilitri. Successivamente, centrifugare il campione in una centrifuga refrigerata impostata a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 3000 rotazioni al minuto; al termine della centrifugazione, scartare il flusso passante.Quindi aggiungere 20 millilitri di PBS freddo al concentratore Apollo e centrifugare nuovamente in una centrifuga refrigerata a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 3000 giri al minuto dopo la centrifugazione. Scartare nuovamente il flusso passante e pipettare 500 microlitri di PBS freddo sulla membrana per risospendere il virus dalla membrana. Quindi pipettare aliquote da 10 microlitri del vettore virale in provette di silicone trattate e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso; scongelare una delle aliquote da 10 microlitri del virus purificato su ghiaccio.Pipettare 40 microlitri di acqua bidistillata nel tubo per diluire il virus. Quindi aggiungere 0,2 microlitri di Ben Nase a 25 unità per microlitro e incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora. Nel frattempo, pipettare 50 microlitri di standard plasmidico a 0,2 nanogrammi per microlitro in un tubo eppendorf pulito.Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di idrossido di sodio 100 millimolare al tubo contenente il virus. Aggiungere anche la miscela Bens aase al tubo contenente lo standard plasmidico. Incubare entrambi i tubi a 65 gradi Celsius per 30 minuti.Trascorsi i 30 minuti, raffreddare immediatamente entrambe le provette in ghiaccio per almeno cinque minuti. Quindi ritagliare un pezzo di membrana di trasferimento delle stesse dimensioni di un pezzo di carta filtrante per bio dot. Posizionare la membrana di trasferimento e tre pezzi di carta filtrante per bio dot in un vassoio basso.Riempire il vassoio con SSC 10 volte e lasciare in ammollo per 20 minuti mentre la membrana è in ammollo. Impostare l'apparato a blocchi a fessura SF seguendo le istruzioni del produttore. Collegare l'apparato a un pallone da vuoto, quindi pipettare 100 microlitri di SSC 10 volte in ciascuna delle fessure in cui verranno caricate la diluizione del campione virale e il campione standard di plasmide.Rimuovere i tubi dalla centrifuga refrigerata a ghiaccio impostata a quattro gradi Celsius per un minuto a 13.000 giri al minuto. Quindi aggiungere 100 microlitri di SSC 20 volte e un microlitro di colorante di carico 6 volte a ciascun tubo. Successivamente, pipettare ulteriori 100 microlitri di SSC 10 volte in ciascun tubo e caricare 100 microlitri di ciascun campione in fessure adiacenti.Ripetere la procedura di diluizione e caricamento fino a quando l'intero volume di ciascun campione non è stato caricato nell'apparecchio a fessure e fino ad aggiunte ulteriori di 10 volte SSC, del volume di 100 microlitri o inferiore. Una volta che tutti i campioni sono passati attraverso la membrana, smontare l'apparecchio a fessure e rimuovere la membrana con pinzette. Prestare attenzione a manipolare la membrana solo ai bordi e posizionarla nella camera dell'Inspector Linker SL 1000 UV crosslinker.Quindi selezionare l'incrocio energetico ottimale; l'incrocio dovrebbe richiedere circa 30 secondi. Prepararsi ora per l'ibridazione portando a ebollizione un millilitro di DNA di sperma di salmone per cinque minuti. Dopo l'ebollizione per cinque minuti, il DNA di sperma di salmone deve essere immediatamente raffreddato su ghiaccio per almeno cinque minuti.Quindi preparare la soluzione di pre-ibridazione seguendo il protocollo scritto. Pipettare 25 millilitri della soluzione di pre-ibridazione contenente DNA di sperma di salmone in un tubo per ibridazione. Trasferire con attenzione la membrana cross-linkata nel tubo per ibridazione, quindi chiudere il tubo con il tappo, assicurandosi che la soluzione di pre-ibridazione ricopra completamente la membrana.In posizione orizzontale, incubare in una camera di ibridazione a 65 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, iniziare la preparazione della sonda pipettando 50 nanogrammi di DNA stampo in una provetta einor e aggiungendo 10 microlitri di acqua doppio-distillata per diluire; bollire il DNA diluito per cinque minuti, quindi raffreddare immediatamente in ghiaccio per almeno cinque minuti. Centrifugare il DNA stampo diluito a 13.000 giri al minuto per un minuto a temperatura ambiente.Quindi procedere seguendo le linee guida per la sicurezza delle radiazioni dell'istituto. Preparare la sonda radioattiva aggiungendo due microlitri di DN TPS 10 millimolare senza DCTP e due microlitri di esanucleotide. Mescolare un microlitro di AU e cinque microlitri di 32 P-D-C-T-P, quindi incubare a 37 gradi Celsius per un'ora dopo l'incubazione.Preparare le colonne G 50 mediante centrifusione a 3000 giri al minuto per due minuti. Quindi caricare il sonda sulla colonna e centrifugare il campione a 3000 giri al minuto per due minuti, raccogliendo il flusso passante. A questo punto, l'attività radioattiva del flusso passante viene misurata utilizzando procedure standard per determinare i conteggi al minuto per millilitro della sonda.Successivamente, far bollire la sonda per cinque minuti. Dopo questo, raffreddare immediatamente la sonda sul ghiaccio per cinque minuti. La sonda è quindi pronta per essere utilizzata nell'ibridazione senza rimuovere la membrana.Aggiungere il sonda mediante pipetta a una concentrazione di sei volte il valore centrale di cinque conteggi al minuto per millilitro direttamente nella soluzione di pre-ibridazione nel tubo di ibridazione. Incubare la camera di ibridazione durante la notte a 65 gradi Celsius. Il giorno successivo, scartare la soluzione di ibridazione seguendo i protocolli istituzionali per le sostanze radioattive e pipettare 25 millilitri di SSC 2X più 0,1% SDS nel tubo, quindi lavare la membrana per 15 minuti a temperatura ambiente.Scartare la soluzione e pipettare 25 millilitri di SSC 0,1 volte più 0,1% SDS nel tubo. Lavare la membrana a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo questo lavaggio, scartare la soluzione e risciacquare brevemente la membrana in 25 millilitri di SSC 0,1 volte a temperatura ambiente.Avvolgere la membrana con pellicola trasparente e posizionarla in una cassetta per esposizione, operando in stanza buia. Posizionare un foglio di pellicola sopra la membrana e chiudere la cassetta per proteggerla dalla luce. Collocare la cassetta per esposizione nel congelatore a meno 80 gradi Celsius per sei ore.Dopo sei ore, sviluppare la pellicola e determinare il titolo dei ceppi virali confrontando la densità delle bande virali con quelle dei campioni plasmidici. Una volta determinato il titolo, il virus può essere utilizzato per trasdurre le cellule, seminando inizialmente 1 × 10⁴ cellule Hep 293 TT.In ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, incubare le cellule per almeno 18 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo da ogni pozzetto e pipettare con attenzione 50 microlitri di mezzo privo di antibiotici e FBS in ciascun pozzetto. Aspirare quindi questo mezzo e ripetere la procedura per lavare le cellule.Diluire i vettori ricombinanti a a v nel mezzo privo di siero fetale bovino e antibiotici fino a una concentrazione finale di 5.000 VGS per cellula. Aggiungere 50 microlitri di questa soluzione oppure 50 microlitri di mezzo privo di siero fetale bovino come controllo negativo nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e incubare per due ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, rimuovere il mezzo contenente il virus e lavare le cellule due volte come in precedenza, utilizzando 50 microlitri di mezzo completo per ogni pozzetto.Dopo aver eliminato l'ultimo lavaggio, aggiungere 150 microlitri di mezzo completo in ogni pozzetto e incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 72 ore. Infine, visualizzare l'espressione di EGFP mediante microscopia a fluorescenza. L'intensità della fluorescenza può essere quantificata utilizzando il software Image J, valutando l'espressione del transgene come area totale di fluorescenza verde per campo visivo.Un esempio di blocco quantitativo per slot di DNA per la determinazione del titolo di vettori RAV tre è mostrato qui. Questa membrana è stata sottoposta a ibridazione con una sonda di DNA specifica per EGFP marcata con P 32. La riga superiore del blocco comprende diluizioni doppie di stock virali purificati digeriti con Ben Nase.Le righe centrale e inferiore sono composte da standard A-A-V-E-G-F-P diluiti rispettivamente da un nanogrammo o da dieci nanogrammi di plasmide. La titolazione delle scorte virali viene determinata mediante confronto con gli standard plasmidici. I numeri mostrati nella blot corrispondono al numero di copie di DNA plasmidico.Questo è un esempio di espressione di un transgene mediata da un vettore AAV ricombinante. In una linea cellulare di epatoblastoma umano, le cellule sono state visualizzate 72 ore dopo la trasduzione utilizzando un microscopio a fluorescenza. La prima immagine illustra i risultati di un'infezione controllo.L'immagine centrale mostra cellule HEP 2 93 TT transdotte con 5.000 VGS per cellula di tutti i vettori AAV due EGFP a 37 gradi Celsius per due ore. L'ultima immagine mostra la trasduzione con 5.000 VGS per cellula di R AAV tre EEG FP nelle stesse condizioni. Si può osservare che RAAV tre è molto più efficiente nella trasduzione di questo tipo cellulare rispetto a R AAV due.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della terapia genica, ad esempio come indirizzare le cellule del cancro del fegato umano. Le implicazioni di questa tecnica riguardano il trattamento del cancro del fegato umano, poiché un V tre ha la capacità di esprimere un gene terapeutico specificamente nelle cellule tumorali del fegato umano a un livello elevato.

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