Name: Biomolecolare Detection impiega il sensore di immagine interferometrica riflettanza (IRIS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Scopri il rilevamento biomolecolare senza etichette con il sensore IRIS. Questo metodo ottico quantifica l'interazione antigene-anticorpo su superfici di biossido di silicio in tempo reale.

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Gli autori desiderano ringraziare Zoiray Technologies Inc., una co-sponsor e partner di commercializzazione, per il suo sostegno.

1. Preparazione del substrato <ol><li> Cappotto a strati di silicio SiO 2 supporti con auto-adsorbente copolimeri (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> Sintesi di copolimero, struttura chimica e processo di rivestimento sono pubblicati in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caratterizzazione di rivestimento in polimero adsorbito per DNA vetrini microarray. Anale. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> In breve, preparare la soluzione di polimeri con l'aggiunta di 100 mg di polimero a 5 ml di acqua deionizzata (DI) acqua e aggiungere 5 ml di solfato di ammonio al 40% saturi ((NH 4) 2SO 4) la soluzione per raggiungere una concentrazione finale di 0,92 M. </li><li> Chip Immergere in soluzione per 30 minuti su un agitatore e poi sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata. Asciugare accuratamente con Argon / N 2 gas. </li><li> Chip Cuocere in forno a 80 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Conservare con rivestimento polimerico substrati / chip in un ambiente asciutto (essiccatore a vuoto) per un massimo di 3 mesi fino alla sonda spotting procedura. </li></ol> 2. Preparazione di Array Sonda: anticorpi, antigeni, ss / dsDNA, RNA, ecc <ol><li> Diluire sonda (s) a concentrazione adeguata nel buffer desiderato. Questa fase può essere variare notevolmente, ma un tipico esperimento utilizza antigene o IgG ad una concentrazione di 0,5 mg / ml (range da 0,1 -1 mg / mL) in tampone fosfato (PBS) a pH ≈ 7.4. </li><li> Luogo soluzioni in un 96 - o 384-pozzetti (o la targa fonte standard per la spotter in uso) </li><li> Impostazione parametri per spotting desiderato serie stampato: determinare i parametri appropriati spotting per la superficie e le soluzioni in uso (tempi di sosta, velocità di avvicinamento, ecc.) Determinare il numero di repliche di ogni condizione per griglia, il layout della griglia, il numero di griglie di replicare, e la posizione desiderata spotting sul chip. Substrati luogo e la piastra fonte nelle posizioni appropriate, verificare che le bottiglie dei rifiuti e la fornitura sono pronti, e iniziare a eseguire la stampa. </li><li> Dopo spotting è finito substrati svolge in un ambiente di elevata umidità durante la notte (4-18 ore) per consentire processo di immobilizzazione e la disattivazione di procedere. </li><li> Lavare substrati: metterli in le seguenti soluzioni per tre minuti per tre lavaggi separati: PBS con 0,1% Tween (PBST), PBS e infine deionizzata (DI). A seconda del tipo di esperimento (umido rispetto a secco), il chip asciugare accuratamente con gas Argon e iniziare l'incubazione o posto il chip in una camera di flusso e assemblare. </li><li> Disattivare rimanenti gruppi NHS sulla superficie copolimero immergendo i chip in una soluzione 50 mM di etanolamina con il pH regolato a 7,4 per 30 minuti, mentre su un piatto shaker. Un primario ammina composto contenente come idrossilammina o Tris può anche essere usato, purché la soluzione preparata è sicuro da usare con le proteine. Sciacquare la soluzione di disattivazione utilizzando PBS poi acqua deionizzata. </li><li> Passaggio facoltativo (a seconda della chimica di superficie è occupata): superficie di blocco utilizzando una soluzione di BSA, caseina, o latte reidratato per 30 minuti. Per la chimica attuale superficie polimerica che usiamo, non eseguire questo passaggio come la spina dorsale polimero atti a prevenire le non-specifico legame con le proteine. </li></ol> 3. Acquisizione Dati e incubazione Procedura: formato Endpoint <ol><li> Ottenere una soluzione del target di interesse nel buffer desiderato. Qui, sarà una soluzione della concentrazione appropriata di anti-BSA in PBS (es: fare ML 1-10 di 10 ng / mL di soluzione di Anti-BSA in PBS). Inoltre, assicurarsi di avere una quantità equivalente di tampone (senza obiettivo) per l'incubazione di controllo negativo. </li><li> Prendete una scansione specchio di silicio per la normalizzazione di tutti i dati successivamente raccolti. </li><li> Scansione dell'array preparato sonda con il sistema IRIS prima della fase di incubazione per determinare l'altezza iniziale ottico (massa) ad ogni punto. Ciò consentirà di un'adeguata analisi delle variazioni di massa sulla superficie, ossia il livello di legame, dopo l'incubazione. Qui, alcuni parametri saranno modificate per l'esperimento in corso, come il tempo di esposizione, campo di vista, concentrandosi prospera, ecc </li><li> Immergere chip (s) in soluzione preparata per 1 ora su un piatto shaker. Il tempo di incubazione può variare notevolmente a seconda del livello di agitazione, la concentrazione del target di essere rilevato, le caratteristiche di trasporto della camera di flusso (se in tempo reale la modalità di rilevazione viene utilizzato), le affinità del target-sonda di coppia, ecc . </li><li> Dopo l'incubazione, ripetere la procedura di lavaggio descritta al punto 2.5) </li><li> Scansione dello stesso array sonda utilizzando il sistema IRIS e ottenere post-incubazione delle immagini per la pre-incubazione confronto. </li><li> Ripetere questo processo per le fasi di incubazione diverso se necessario, ad esempio in un formato saggio a sandwich in cui un anticorpo secondario viene utilizzato. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Montare le immagini raccolte per ogni scansione IRIS (sequenza di immagini di intensità), utilizzando il laboratorio sviluppato un software di proprodurre un'immagine della serie sonda contenente informazioni ottiche spessore. Una rapida analisi qualitativa del legame può essere effettuata sottraendo (registrati) post e pre-incubazione delle immagini. Vincolanti apparirà come un cambiamento di intensità in quei punti in cui sono state osservate variazioni di massa. Per l'analisi quantitativa, determinare la densità di massa di ciascun punto rispetto al fondo facendo la media informazioni ottiche spessore per ogni pixel all'interno di un luogo e un anello al di fuori del posto e facendo un confronto diretto di queste due aree. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: La Figura 1 mostra uno schema esempio di strati Si-SiO 2 substrato IRIS macchiato con una vasta rappresentanza degli anticorpi. Ogni ensemble anticorpo è macchiato di replicare con specificità per un epitopo diverso targeting proteine ​​diverse. Due virus diversi intero e una proteina virale sono rappresentati come bersagli esempio. Anticorpi di controllo negativo dipende dal dosaggio e può essere non-specifici e / o virus-specifici. La Figura 2 mostra il legame di albumina sierica umana (HSA)-anticorpi specifici per una serie di gattuccio HSA e IgG di coniglio (controllo) punti. Come si vede qui, dopo il montaggio e la determinazione delle ottico spessori per le immagini pre-e post-incubazione, un'immagine differenza per l'array legame può essere creato per valutare qualitativamente vincolanti. L'analisi quantitativa rivela che un 2,05 e 0,13 nanometri variazione media altezza ottica è stata osservata per la HSA e il coniglio IgG punti, rispettivamente, per un anti-HSA incubazione concentrazione di 500 ng / ml. La figura 3 mostra una misurazione IRIS di dipendenza Fur legame con le proteine ​​sulla concentrazione delle proteine ​​e la lunghezza oligomeri dsDNA. Il grafico in alto mostra in assoluto le misure di altezza ottica per altezze oligomero iniziale immobilizzato sonda e post-incubazione vincolante Fur. Concentrazioni crescenti di Fur (50, 100, 200 nM) ha determinato un aumento vincolante per sonde di DNA. La lunghezza del oligomeri impatti anche vincolante pelliccia con sequenze più lunghe con conseguente più vincolanti. Qui, le barre di errore rappresentano una deviazione standard dalla media. Il diagramma in basso mostra calcolato dimero proteine ​​Fur vincolante per ogni filza dsDNA. Dimero vincolante era significativamente aumentata ad una concentrazione di proteine ​​Fur di 200 Nm suggerendo un alto livello di legame non specifico. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica di un array sonda esempio normalmente usato in un esperimento per rilevare virus e componenti specifici virale in modo multiplex con il sistema IRIS. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Post-incubazione immagine differenza per il legame di albumina sierica umana anticorpi specifici per macchiato HSA raccolti con questo sistema privo di etichetta ad una concentrazione di 500 ng / mL. La densità di massa biomateriale per ogni spot è determinata calcolando la media dello spessore informazioni ottiche all'interno di un punto e poi confrontandola con la media di un anello intorno al punto che rappresenta lo sfondo. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Terreno di associazione dati per le interazioni proteina con pelliccia maculata doppio filamento oligomeri con una sequenza consenso noto in base alla lunghezza oligomero, la posizione della sequenza di consenso all'interno della oligomero, e concentrazione di proteine ​​Fur. Informazioni circa la quantità assoluta di proteine ​​Fur legato a ogni sequenza macchiato (in alto) possono essere usati per stimare il numero di dimeri Fur legato a ogni tipo di oligomeri (in basso).

<ol><li>Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li>
<li>Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li>
<li>Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed%2C+high-throughput%2C+label-free%2C+and+dynamic+biosensing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li>
<li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La piattaforma IRIS è un sistema semplice e veloce da utilizzare per la raccolta di associazione dati ad alta velocità in un formato microarray. Da covalentemente immobilizzare diverse sonde funzionali proteine ​​o di DNA su una superficie, gli antigeni target / biomarcatori / etc. possono essere catturati da una soluzione, come in un immunodosaggio. Misurazione di queste interazioni tra condizioni sonda in un endpoint o in tempo reale in formato con il sistema IRIS permette di informazioni altamente sensibili e quantitativi da raccogliere per ogni interazione. L&#39;esperimento rappresentante disponibili a questo link è solo un esempio dei tipi di interazioni che possono essere studiati con questa tecnica. Rilevazione dei fattori di trascrizione, antigeni virali e virus intero è stato dimostrato in precedenza e rappresenta solo alcuni esempi dei tipi di analisi che il IRIS può facilmente gestire.

<ol><li> Wafer di silicio con 500 nm di biossido di silicio cresciuto termicamente, nella Silicon Valley Microelectronics, ordine personalizzato <li> Polvere di solfato di ammonio, Sigma-Aldrich cat. # A5132 <li> Tampone fosfato (PBS) concentrato 10X pronto, Fisher Scientific cat. # BP665-1 <li> Anticorpi anti-albumina sierica umana (anti-HSA), Sigma-Aldrich cat. # A0433 <li> Albumina sierica umana (HSA), Sigma-Aldrich cat. # A9511 <li> Argon o azoto gas (ultra-elevata purezza), cat Airgas. # # O AR UHP300 NI UHP300 <li> Piastre di Petri, 60 mm x 15 mm, cat Fisher Scientific. # 0875713A <li> Scienceware ® vuoto essiccatore, Sigma-Aldrich cat. # Z119016 <li> Microprovette, Fisher Scientific cat. # 05-408-120 <li> Piastre a 96 pozzetti, rilegatura cellulare bassa, Nalgene Nunc gatto International. # 145399 <li> BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Etanolammina, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Idrossilammina, Thermo Scientific cat. # 26103 <li> Multi-purpose dei rotatori, Thermo Scientific (Barnstead International), modello # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga 2000R fotocamera, cat QImaging. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> Illuminazione fonte ACULED, PerkinElmer, ordine personalizzato <li> Componenti ottici (lenti, obiettivi, aperture, rotaie, pali, ecc), Thorlabs </ol>

biomolecolare detection impiega il sensore di immagine interferometrica riflettanza (iris)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

La misura sensibile delle interazioni biomolecolari ha un uso in molti campi e settori come la biologia e microbiologia di base, monitoraggio ambientale / agricolo / biodifesa, nanobiotecnologie e altro ancora. Per applicazioni diagnostiche, monitoraggio (rilevazione) la presenza, assenza, o l&#39;espressione anormale di mirati biomarcatori proteomici o genomiche trovati nei campioni dei pazienti può essere utilizzato per determinare un approccio di trattamento o di efficacia della terapia. Nel campo di ricerca, informazioni sulle affinità molecolare e specificità sono utili per caratterizzare completamente i sistemi oggetto di indagine. Molti degli attuali sistemi utilizzati per determinare le concentrazioni molecolari o affinità contare sull&#39;utilizzo di etichette. Esempi di questi sistemi includono saggi immunologici, come l&#39;enzima-test immunoenzimatico (ELISA), reazione a catena della polimerasi (PCR), saggi di elettroforesi su gel e spettrometria di massa (MS). Generalmente, queste etichette sono fluorescenti, radiologiche, o colorimetrica in natura e sono direttamente o indirettamente collegata al bersaglio molecolare di interesse. Sebbene l&#39;uso di etichette è ampiamente accettato e ha alcuni vantaggi, non ci sono inconvenienti che sono stimolando lo sviluppo di nuovi senza etichetta metodi per misurare queste interazioni. Questi svantaggi includono aspetti pratici come il costo del test un aumento, Reattivo vita e le preoccupazioni usabilità, storage e sicurezza, perdita di tempo e fatica per l&#39;etichettatura, e la variabilità fra i diversi reagenti per i processi di etichettatura o etichette stesse. Su una base di ricerca scientifica, l&#39;uso di queste etichette possono anche introdurre tali difficoltà per quanto riguarda gli effetti sulla funzionalità delle proteine ​​/ struttura per la presenza delle etichette allegate e l&#39;incapacità di misurare direttamente le interazioni in tempo reale. Qui presentata è l&#39;uso di una nuova etichetta senza biosensore ottico che è suscettibile di microarray studi, definito il sensore interferometrico Imaging riflettanza (IRIS), per rilevare le proteine, DNA, materiale antigenico, patogeni intero (virioni) e altro materiale biologico. Il sistema IRIS ha dimostrato di avere sensibilità, precisione e riproducibilità delle interazioni biomolecolari diversi [1-3]. I vantaggi includono la capacità di imaging multiplex, in tempo reale e funzionalità di misura degli endpoint, e altri prodotti high-throughput attributi quali il consumo di reagente ridotti e una riduzione dei tempi di analisi. Inoltre, la piattaforma IRIS è semplice da usare, richiede attrezzature poco costose, e utilizza a base di silicone solido componenti saggio fase che lo rende compatibile con gli approcci superficiali molti contemporanea chimica. Qui, vi presentiamo l&#39;utilizzo del sistema IRIS dalla preparazione degli array sonda incubazione e la misurazione di obiettivo vincolante per l&#39;analisi dei risultati in un formato endpoint. Il sistema modello sarà la cattura di anticorpi bersaglio che sono specifici per albumina sierica umana (HSA) su HSA-macchiato substrati.

Quantitativa, high-throughput in tempo reale, e l&#39;etichetta-libero di rilevamento biomolecolare (DNA, proteine, ecc) su SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Superfici può essere raggiunto utilizzando una semplice tecnica interferometrica, che si basa sulla illuminazione a LED, numero minimo di componenti ottici, e una macchina fotografica. Il sensore interferometrico Imaging riflettanza (IRIS) è poco costoso, semplice da usare, e suscettibili di microarray formati.

Biomolecolare Detection impiega il sensore di immagine interferometrica riflettanza (IRIS)

La misurazione sensibile delle interazioni biomolecolari trova applicazione in molti campi e industrie, quali la biologia di base e la microbiologia, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare il legame di anticorpi ad antigeni immobilizzati sulla superficie mediante una piattaforma di rilevamento sensibile e priva di marcatura denominata Iris. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un array di sonde di prova e di controllo su una superficie uniforme di biossido di silicio chimicamente funzionalizzata, al fine di catturare proteine target dalla soluzione. Le sonde immobilizzate possono essere anticorpi o antigeni, DNA o RNA oppure qualsiasi altro tipo di macromolecola compatibile con le chimiche di superficie funzionalizzate, polimeriche o sane.Il microarray preparato viene quindi incubato con un campione contenente le proteine di interesse, consentendo il legame in condizioni specificate dal ricercatore. Successivamente, l'intero array sensoriale viene immaginato a diverse lunghezze d'onda della luce. Con il sistema IRIS, le intensità riflesse di ciascun pixel vengono elaborate mediante algoritmi codificati su misura.Per quantificare la quantità di biomateriale legato a ciascuna condizione sperimentale o di controllo, si ottengono risultati post-incubazione che mostrano un rilevamento efficace e una quantificazione assoluta di anticorpi in una miscela complessa, basata su misurazioni interferometriche senza etichette di questo sistema. Sviluppando oltre un decennio di ricerca e sviluppo su dispositivi ottici a interferenza e cavità in resina, abbiamo elaborato questo nuovo metodo che potrebbe superare molte delle complicazioni riscontrate nei precedenti sistemi biosensori senza etichette. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di raccolta dati richiedono il rispetto di corrette procedure di normalizzazione e controllo di qualità. Per garantire un'acquisizione dati accurata e ripetibile.Per rivestire coniugatamente i suoi substrati di biossido di silicio con copolimeri autoassorbenti NAS DMMA, preparare innanzitutto la soluzione polimerica aggiungendo 100 milligrammi del polimero a 5 millilitri di acqua deionizzata. Quindi aggiungere 5 millilitri di solfato di ammonio al 40% saturo, ottenendo una concentrazione finale di solfato di ammonio pari a 0,92 moli. Immergere le chip nella soluzione polimerica per 30 minuti su un agitatore, seguendo l'incubazione.Sciacquare accuratamente le chip con acqua deionizzata, asciugare le chip con gas argon o azoto e quindi cuocerle a 80 gradi Celsius per 15 minuti. Conservare le chip di substrato rivestite con polimero in un ambiente asciutto, come un essiccatore sotto vuoto, per un periodo fino a due o tre mesi, fino alla procedura di deposizione delle sonde per diluire ciascuna sonda. Per prima cosa, determinare il volume corretto della soluzione madre della sonda e del tampone per raggiungere la concentrazione finale desiderata.Un esperimento tipico utilizza l'antigene o l'IgG a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro in soluzione salina tamponata al fosfato, aggiungendo la quantità calcolata di ciascuna soluzione madre del sonda a provette piccole contenenti la quantità desiderata di tampone PBS, mescolando le soluzioni. Successivamente, si pipetta la soluzioni della sonda in una piastra da 96 pozzetti a bassa adesione proteica, che verrà utilizzata come piastra sorgente per il dispenser. Quindi, si impostano i parametri di dispense per l'array stampato determinando il numero di replicati di ciascuna condizione per ogni griglia.La griglia definisce il numero di griglie replicate e la posizione desiderata di deposizione sul chip. Posizionare il substrato e la piastra sorgente nello spotter, quindi verificare i flaconi di rifiuto e di approvvigionamento. Avviare la corsa di stampa.Al termine della deposizione, posizionare il substrato in un ambiente ad alta umidità per tutta la notte per consentire il completamento del processo di immobilizzazione e disattivazione dopo l'incubazione. Lavare i substrati con agitazione, posizionando prima il chip in PBS con lo 0,1% di tween per tre minuti, ripetendo l'operazione tre volte. Procedere quindi con tre incubazioni di tre minuti ciascuna in PBS e successivamente in acqua deionizzata.Se si esegue una misurazione a secco, asciugare accuratamente il chip con gas argon. Disattivare i gruppi NHS rimanenti sulla superficie del copolimero immergendo i chip in una soluzione 50 millimolare di etanolammina con pH aggiustato a 7,4 per 30 minuti, mentre si agita sulla piastra agitatrice. Risciacquare accuratamente l'etanolammina utilizzando PBS e successivamente acqua deionizzata prima dell'inizio della procedura di incubazione.Preparare una soluzione della concentrazione appropriata della proteina bersaglio in PBS per questa dimostrazione. Vengono utilizzati 500 nanogrammi per millilitro di anti-albumina umana, inclusi un volume equivalente di tampone senza bersaglio per l'incubazione di controllo negativo. Il sistema dell'iride è composto da alcuni elementi fondamentali, come una sorgente di illuminazione, componenti ottici per illuminare correttamente l'array della sonda sensoriale, una telecamera per registrare le intensità della luce riflessa e un supporto su cui viene posizionato il campione per le misurazioni.Avviare con una scansione del mirror di silicio di un chip di silicio nudo e pulito per normalizzare tutti i dati raccolti successivamente prima di eseguire la scansione. Preparare il sistema dell'iride regolando i parametri per l'esperimento. Ciò include la misurazione dell'istogramma delle intensità luminose registrate dalla telecamera e l'impostazione del tempo di esposizione per ottenere intensità ottimali.Dopo la scansione di normalizzazione, caricare la matrice di sonde preparata nel sistema iris ed eseguire l'installazione come in precedenza, impostando il fuoco per immagini correttamente la superficie del substrato. Assicurarsi che il portacampioni sia in bolla ispezionando gli istogrammi registrati per le intensità della luce riflessa. Infine, scegliere un nome file in cui salvare i dati.Avviare il software per scansionare l'array, che illumina la superficie a diverse lunghezze d'onda molte volte e medie le immagini raccolte. Viene determinato il punto iniziale di riferimento ottico alto, consentendo un'analisi accurata delle variazioni di massa sulla superficie dopo l'incubazione successiva alla scansione iniziale; immergere il chip nella soluzione di incubazione preparata per un'ora su una piastra agitata. Il tempo di incubazione può variare notevolmente a seconda del livello di vegetazione, della concentrazione del bersaglio da rilevare e delle affinità della coppia sonda-bersaglio.Dopo l'incubazione, ripetere la procedura di lavaggio come precedentemente eseguita. Scansionare lo stesso microarray utilizzando il sistema iris per ottenere immagini post-incubazione da confrontare con quelle pre-incubazione. Questo processo può essere ripetuto per diverse fasi di incubazione, se necessario.Ad esempio, in un saggio in formato sandwich in cui viene utilizzato un anticorpo secondario, elaborare le immagini raccolte per ogni scansione dell'iride mediante software sviluppati commercialmente per ottenere un'immagine del proby contenente la formazione dello spessore ottico. Un'analisi qualitativa rapida del legame può essere effettuata sottraendo le immagini post e pre incubazione. Il legame si manifesterà come un cambiamento nell'intensità nei punti in cui sono state osservate variazioni di massa.Per l'analisi quantitativa, determinare le densità di massa di ciascun spot rispetto allo sfondo calcolando la media delle informazioni sullo spessore ottico per ciascun pixel all'interno di un spot e per un anello esterno al spot. Successivamente effettuare un confronto diretto tra queste due aree mostrate qui. A titolo di esempio, schema del substrato stratificato di silicio e ossido di silicio con iride, su cui è stato depositato un array rappresentativo di anticorpi.Ogni insieme di anticorpi viene depositato in replicati con specificità per un epitopo diverso, mirando a una proteina differente. Due virus interi diversi e una proteina virale sono rappresentati come esempi di bersagli. Gli anticorpi di controllo negativo dipendono dal saggio e possono essere non specifici e/o specifici per il virus.Di seguito è riportato un esempio di risultati qualitativi relativi al legame di anticorpi specifici per l'albumina sierica umana con un array di punti di HSA e controlli di IgG di coniglio, come mostrato qui. Dopo l'adattamento e la determinazione dello spessore ottico delle immagini pre e post incubazione, è possibile creare un'immagine di differenza per l'array di legame al fine di valutare rapidamente il legame. Un'analisi più rigorosa di tipo quantitativo rivela che una variazione media dell'altezza ottica di 2,05 e 0,13 nanometri è stata osservata rispettivamente per i punti di HSA e di IgG di coniglio, utilizzando una concentrazione di incubazione di anti-HSA pari a 500 nanogrammi per millilitro.Questo grafico a barre rappresenta un esempio dei dati quantitativi che possono essere ottenuti mediante misurazioni dell'iride. In questo esempio, viene mostrata la dipendenza del legame della proteina della pelliccia dalla concentrazione proteica e dalla lunghezza del ligando a doppio filamento. Questo grafico a barre mostra le misurazioni dell'altezza ottica assoluta per le altezze iniziali del ligando immobilizzato e per le condizioni successive all'incubazione per il legame.Concentrazioni crescenti della proteina Fur fino a 5, 100 e 200 nanomolari hanno determinato un aumento del legame con le sonde di DNA. Qui viene mostrato il legame del dimero della proteina Fur per ogni tratto di DNA a doppio filamento. Il legame dimero è aumentato significativamente a una concentrazione di proteina Fur di 200 nanomolari, suggerendo un elevato livello di interazioni non specifiche con tutti i tratti oppure un meccanismo differente di legame della proteina Fur, quale l'aggregazione di più dimeri.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di iniziare con substrati uniformi e puliti dotati dello spessore di ossido appropriato e di mantenere i campioni privi di contaminazioni manipolandoli con cura mediante pinzette. È inoltre fondamentale utilizzare reagenti correttamente conservati e noti per la loro funzionalità. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare le interazioni biomolecolari in formato senza etichetta, attraverso la preparazione di array di sonde funzionali su una superficie di biossido di silicio, nonché dell'acquisizione e analisi dei dati mediante il sensore di imaging a riflettanza interferometrica, o iris.

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Questo protocollo è una guida per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza su un microscopio a fluorescenza standard per l'imaging senza etichette, ad alto contrasto e ad alta velocità dei microtubuli utilizzando analisi in vitro.

Implementazione della microscopia di riflessione delle interferenze per l'imaging ad alta velocità e senza etichetta dei microtubuli

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Questo articolo descrive l'uso di un nuovo imager ottico veloce per l'imaging macroscopico della durata della fotoluminescenza di campioni che emettono lungo decadimento. Vengono descritte le procedure di integrazione, acquisizione delle immagini e analisi, insieme alla preparazione e caratterizzazione dei materiali del sensore per l'imaging e l'applicazione dell'imager nello studio dei campioni biologici.

Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche

Questo articolo descrive un protocollo per lo studio delle interazioni DNA-proteina utilizzando un sistema di interferometria a biostrato (BLI) basato su streptavidina. Delinea i passaggi e le considerazioni essenziali per l'utilizzo della cinetica di legame di base o avanzata per determinare l'affinità di legame all'equilibrio (KD) dell'interazione.

Analisi delle interazioni DNA-proteina con l'interferometria a biostrato basata su streptavidina

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza l'ibridazione in situ a fluorescenza fototermica ottica a infrarossi (OPTIR-FISH), nota anche come FISH fototermica nel medio infrarosso (MIP-FISH), per identificare le singole cellule e comprenderne il metabolismo. Questa metodologia può essere ampiamente applicata per diverse applicazioni, tra cui la mappatura del metabolismo cellulare con la risoluzione di una singola cellula.

Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Scopri il rilevamento biomolecolare senza etichette con il sensore IRIS. Questo metodo ottico quantifica l'interazione antigene-anticorpo su superfici di biossido di silicio in tempo reale.

Biomolecolare Detection impiega il sensore di immagine interferometrica riflettanza (IRIS)

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