Biomolecolare Detection impiega il sensore di immagine interferometrica riflettanza (IRIS)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare il legame di anticorpi ad antigeni immobilizzati sulla superficie mediante una piattaforma di rilevamento sensibile e priva di marcatura denominata Iris. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un array di sonde di prova e di controllo su una superficie uniforme di biossido di silicio chimicamente funzionalizzata, al fine di catturare proteine target dalla soluzione. Le sonde immobilizzate possono essere anticorpi o antigeni, DNA o RNA oppure qualsiasi altro tipo di macromolecola compatibile con le chimiche di superficie funzionalizzate, polimeriche o sane.

Il microarray preparato viene quindi incubato con un campione contenente le proteine di interesse, consentendo il legame in condizioni specificate dal ricercatore. Successivamente, l'intero array sensoriale viene immaginato a diverse lunghezze d'onda della luce. Con il sistema IRIS, le intensità riflesse di ciascun pixel vengono elaborate mediante algoritmi codificati su misura.

Per quantificare la quantità di biomateriale legato a ciascuna condizione sperimentale o di controllo, si ottengono risultati post-incubazione che mostrano un rilevamento efficace e una quantificazione assoluta di anticorpi in una miscela complessa, basata su misurazioni interferometriche senza etichette di questo sistema. Sviluppando oltre un decennio di ricerca e sviluppo su dispositivi ottici a interferenza e cavità in resina, abbiamo elaborato questo nuovo metodo che potrebbe superare molte delle complicazioni riscontrate nei precedenti sistemi biosensori senza etichette. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di raccolta dati richiedono il rispetto di corrette procedure di normalizzazione e controllo di qualità. Per garantire un'acquisizione dati accurata e ripetibile.

Per rivestire coniugatamente i suoi substrati di biossido di silicio con copolimeri autoassorbenti NAS DMMA, preparare innanzitutto la soluzione polimerica aggiungendo 100 milligrammi del polimero a 5 millilitri di acqua deionizzata. Quindi aggiungere 5 millilitri di solfato di ammonio al 40% saturo, ottenendo una concentrazione finale di solfato di ammonio pari a 0,92 moli. Immergere le chip nella soluzione polimerica per 30 minuti su un agitatore, seguendo l'incubazione.

Sciacquare accuratamente le chip con acqua deionizzata, asciugare le chip con gas argon o azoto e quindi cuocerle a 80 gradi Celsius per 15 minuti. Conservare le chip di substrato rivestite con polimero in un ambiente asciutto, come un essiccatore sotto vuoto, per un periodo fino a due o tre mesi, fino alla procedura di deposizione delle sonde per diluire ciascuna sonda. Per prima cosa, determinare il volume corretto della soluzione madre della sonda e del tampone per raggiungere la concentrazione finale desiderata.

Un esperimento tipico utilizza l'antigene o l'IgG a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro in soluzione salina tamponata al fosfato, aggiungendo la quantità calcolata di ciascuna soluzione madre del sonda a provette piccole contenenti la quantità desiderata di tampone PBS, mescolando le soluzioni. Successivamente, si pipetta la soluzioni della sonda in una piastra da 96 pozzetti a bassa adesione proteica, che verrà utilizzata come piastra sorgente per il dispenser. Quindi, si impostano i parametri di dispense per l'array stampato determinando il numero di replicati di ciascuna condizione per ogni griglia.

La griglia definisce il numero di griglie replicate e la posizione desiderata di deposizione sul chip. Posizionare il substrato e la piastra sorgente nello spotter, quindi verificare i flaconi di rifiuto e di approvvigionamento. Avviare la corsa di stampa.

Al termine della deposizione, posizionare il substrato in un ambiente ad alta umidità per tutta la notte per consentire il completamento del processo di immobilizzazione e disattivazione dopo l'incubazione. Lavare i substrati con agitazione, posizionando prima il chip in PBS con lo 0,1% di tween per tre minuti, ripetendo l'operazione tre volte. Procedere quindi con tre incubazioni di tre minuti ciascuna in PBS e successivamente in acqua deionizzata.

Se si esegue una misurazione a secco, asciugare accuratamente il chip con gas argon. Disattivare i gruppi NHS rimanenti sulla superficie del copolimero immergendo i chip in una soluzione 50 millimolare di etanolammina con pH aggiustato a 7,4 per 30 minuti, mentre si agita sulla piastra agitatrice. Risciacquare accuratamente l'etanolammina utilizzando PBS e successivamente acqua deionizzata prima dell'inizio della procedura di incubazione.

Preparare una soluzione della concentrazione appropriata della proteina bersaglio in PBS per questa dimostrazione. Vengono utilizzati 500 nanogrammi per millilitro di anti-albumina umana, inclusi un volume equivalente di tampone senza bersaglio per l'incubazione di controllo negativo. Il sistema dell'iride è composto da alcuni elementi fondamentali, come una sorgente di illuminazione, componenti ottici per illuminare correttamente l'array della sonda sensoriale, una telecamera per registrare le intensità della luce riflessa e un supporto su cui viene posizionato il campione per le misurazioni.

Avviare con una scansione del mirror di silicio di un chip di silicio nudo e pulito per normalizzare tutti i dati raccolti successivamente prima di eseguire la scansione. Preparare il sistema dell'iride regolando i parametri per l'esperimento. Ciò include la misurazione dell'istogramma delle intensità luminose registrate dalla telecamera e l'impostazione del tempo di esposizione per ottenere intensità ottimali.

Dopo la scansione di normalizzazione, caricare la matrice di sonde preparata nel sistema iris ed eseguire l'installazione come in precedenza, impostando il fuoco per immagini correttamente la superficie del substrato. Assicurarsi che il portacampioni sia in bolla ispezionando gli istogrammi registrati per le intensità della luce riflessa. Infine, scegliere un nome file in cui salvare i dati.

Avviare il software per scansionare l'array, che illumina la superficie a diverse lunghezze d'onda molte volte e medie le immagini raccolte. Viene determinato il punto iniziale di riferimento ottico alto, consentendo un'analisi accurata delle variazioni di massa sulla superficie dopo l'incubazione successiva alla scansione iniziale; immergere il chip nella soluzione di incubazione preparata per un'ora su una piastra agitata. Il tempo di incubazione può variare notevolmente a seconda del livello di vegetazione, della concentrazione del bersaglio da rilevare e delle affinità della coppia sonda-bersaglio.

Dopo l'incubazione, ripetere la procedura di lavaggio come precedentemente eseguita. Scansionare lo stesso microarray utilizzando il sistema iris per ottenere immagini post-incubazione da confrontare con quelle pre-incubazione. Questo processo può essere ripetuto per diverse fasi di incubazione, se necessario.

Ad esempio, in un saggio in formato sandwich in cui viene utilizzato un anticorpo secondario, elaborare le immagini raccolte per ogni scansione dell'iride mediante software sviluppati commercialmente per ottenere un'immagine del proby contenente la formazione dello spessore ottico. Un'analisi qualitativa rapida del legame può essere effettuata sottraendo le immagini post e pre incubazione. Il legame si manifesterà come un cambiamento nell'intensità nei punti in cui sono state osservate variazioni di massa.

Per l'analisi quantitativa, determinare le densità di massa di ciascun spot rispetto allo sfondo calcolando la media delle informazioni sullo spessore ottico per ciascun pixel all'interno di un spot e per un anello esterno al spot. Successivamente effettuare un confronto diretto tra queste due aree mostrate qui. A titolo di esempio, schema del substrato stratificato di silicio e ossido di silicio con iride, su cui è stato depositato un array rappresentativo di anticorpi.

Ogni insieme di anticorpi viene depositato in replicati con specificità per un epitopo diverso, mirando a una proteina differente. Due virus interi diversi e una proteina virale sono rappresentati come esempi di bersagli. Gli anticorpi di controllo negativo dipendono dal saggio e possono essere non specifici e/o specifici per il virus.

Di seguito è riportato un esempio di risultati qualitativi relativi al legame di anticorpi specifici per l'albumina sierica umana con un array di punti di HSA e controlli di IgG di coniglio, come mostrato qui. Dopo l'adattamento e la determinazione dello spessore ottico delle immagini pre e post incubazione, è possibile creare un'immagine di differenza per l'array di legame al fine di valutare rapidamente il legame. Un'analisi più rigorosa di tipo quantitativo rivela che una variazione media dell'altezza ottica di 2,05 e 0,13 nanometri è stata osservata rispettivamente per i punti di HSA e di IgG di coniglio, utilizzando una concentrazione di incubazione di anti-HSA pari a 500 nanogrammi per millilitro.

Questo grafico a barre rappresenta un esempio dei dati quantitativi che possono essere ottenuti mediante misurazioni dell'iride. In questo esempio, viene mostrata la dipendenza del legame della proteina della pelliccia dalla concentrazione proteica e dalla lunghezza del ligando a doppio filamento. Questo grafico a barre mostra le misurazioni dell'altezza ottica assoluta per le altezze iniziali del ligando immobilizzato e per le condizioni successive all'incubazione per il legame.

Concentrazioni crescenti della proteina Fur fino a 5, 100 e 200 nanomolari hanno determinato un aumento del legame con le sonde di DNA. Qui viene mostrato il legame del dimero della proteina Fur per ogni tratto di DNA a doppio filamento. Il legame dimero è aumentato significativamente a una concentrazione di proteina Fur di 200 nanomolari, suggerendo un elevato livello di interazioni non specifiche con tutti i tratti oppure un meccanismo differente di legame della proteina Fur, quale l'aggregazione di più dimeri.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di iniziare con substrati uniformi e puliti dotati dello spessore di ossido appropriato e di mantenere i campioni privi di contaminazioni manipolandoli con cura mediante pinzette. È inoltre fondamentale utilizzare reagenti correttamente conservati e noti per la loro funzionalità. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare le interazioni biomolecolari in formato senza etichetta, attraverso la preparazione di array di sonde funzionali su una superficie di biossido di silicio, nonché dell'acquisizione e analisi dei dati mediante il sensore di imaging a riflettanza interferometrica, o iris.