Visualizzazione di MG53-mediata di riparazione della membrana cellulare Utilizzando In vivo E In vitro Sistemi

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la capacità di riparazione della membrana sia nelle cellule animali che in quelle isolate. Le fibre muscolari scheletriche isolate vengono raccolte e circondate con terreni contenenti colorante FM 1 43. Un laser UV viene quindi utilizzato per irradiare e danneggiare una parte della membrana cellulare per consentire l'ingresso del colorante nella cellula.

Le cellule isolate vengono trasfettate con DNA plasmatico che esprime GFP MG 53, che si localizzerà sulla membrana plasmatica e sul citosol della cellula. La punta di un micro elettrodo viene quindi inserita nella membrana C 2 C 12 per indurre il danno. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la traslocazione della GFP MG 53 nel sito della lesione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le pratiche richiedono la padronanza delle tecniche di penetrazione dei microelettrodi e isolamento delle fibre muscolari. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Lin, il nostro responsabile di laboratorio, il Dr.Wazu, un borsista post-dottorato Matt Orange, uno studente laureato, e il Dr.Shaza, un assistente professore di ricerca nel nostro dipartimento. Per iniziare, posiziona un vassoio o un tappetino da laboratorio blu sotto il tapis roulant per raccogliere i rifiuti dagli animali durante l'esperimento.

Quindi, impostare l'angolo della superficie del tapis roulant. Alcuni tapis roulant hanno un apparato integrato per regolare l'inclinazione, mentre altri richiedono che il tapis roulant venga sollevato con altri mezzi. Viene generalmente utilizzata una superficie piana o un angolo compreso tra sette e 15 gradi in discesa o in salita.

Acclimatare i topi posizionandoli sul tapis roulant con la rete elettrica spenta e il motore di trasmissione a cinghia acceso, ma senza muoversi per 15 minuti dopo il periodo di acclimatazione, accendere la rete elettrica motivazionale. Avviare il tapis roulant con una velocità iniziale di circa cinque metri al minuto. Con velocità che aumentano di uno o due metri al minuto ogni minuto, consentire all'animale un periodo di riscaldamento di cinque minuti.

Ripetere questo periodo di riscaldamento ogni giorno per tre-10 giorni per aumentare la conformità durante i test. Per eseguire un esercizio di esaurimento acuto. Aumentare la velocità del tapis roulant nel tempo fino a raggiungere la velocità massima e monitorare i segni di esaurimento.

Un animale è considerato esausto quando trascorre più della metà del tempo fuori dal tapis roulant o cinque secondi consecutivi sulla griglia. Rimuovere il mouse esausto e registrare il tempo di esecuzione totale. Allenamento di resistenza.

I protocolli in esecuzione iniziano con la stessa procedura di riscaldamento. Tuttavia, la velocità massima è generalmente inferiore e i tempi di percorrenza possono essere piuttosto lunghi. Riporta i topi nella loro gabbia di casa dopo il test e pulisci il tapis roulant con etanolo al 70%.

Isolare lo strato superficiale del muscolo flessore breve delle dita dal piede per ulteriori analisi. Per prima cosa, taglia la pelle della suola in corrispondenza della linea mediana, facendo attenzione a non danneggiare il muscolo sottostante. Quindi, fai dei tagli orizzontali e rimuovi la pelle.

Identificare il tendine bianco piatto del muscolo FDB attaccato all'osso calcagno. Usa una pinza per separare e poi recidere il tendine vicino al sito di attacco. Tirare delicatamente il tendine verso l'alto tagliando via il tessuto connettivo.

Individua il punto in cui i tendini distali si diramano nelle singole dita. Taglia i tendini nel punto in cui si collegano allo strato più profondo del muscolo e rimuovi l'FDB. Mettere il fascio muscolare FDB in un millilitro di soluzione di collagenasi Preriscaldare a 37 gradi Celsius.

Fissare il tubo orizzontalmente su un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius e agitare a 200 giri/min per 65 minuti. Una digestione sufficiente è caratterizzata da un aspetto impaurito e da un colore pallido. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta da un millilitro per consentire il passaggio del fascio digerito.

Trasferisci facilmente il fascio in una provetta da centrifuga contenente circa 600 microlitri da 2,5. Calcio tiro. Capovolgi delicatamente il tubo per scuotere le fibre sciolte dal fascio.

Quindi, tagliare l'estremità di un puntale per pipetta da 30 microlitri in modo che il diametro sia solo leggermente più piccolo del fascio muscolare. Utilizzare questa punta per aspirare il fascio nella pipetta e quindi reinserirlo nella soluzione. Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte delle fibre non viene dissociata dal fascio.

Mescolare le fibre dissociate ruotando delicatamente il tubo. Togliere la quantità desiderata e versare su una pirofila delta T con fondo di vetro. Conservare le fibre rimanenti a quattro gradi Celsius per circa sei ore per l'uso e ulteriori studi.

Lasciare riposare il piatto indisturbato per cinque minuti. Ciò consente alle fibre di aderire al fondo di vetro del piatto. Posizionare il piatto inferiore in vetro su un microscopio confocale dotato di un laser UV.

Osservare le fibre al microscopio di fase con un ingrandimento superiore a 100x per verificare la presenza di un normale schema di striatura e di una forma a bastoncino dritto. Aggiungere le matrici di poliroperineo FM 1 43 o FM 4 64 alla soluzione fino a una concentrazione finale di 2,5 micromolari. Orientare la fibra con un angolo di 45 gradi dall'alto a sinistra del campo visivo verso il basso a destra per indurre danni.

Irradiare un'area di cinque pixel per cinque della membrana plasmatica. Utilizzando un laser UV impostato alla massima potenza per cinque secondi, la regione irradiata dovrebbe dividere la membrana plasmatica che è metà della scatola cinque per cinque dovrebbe essere all'interno della fibra, mentre il resto dovrebbe essere all'esterno della fibra, catturare le immagini dell'ingresso del colorante nella fibra a intervalli di cinque secondi ciascuno per un massimo di cinque minuti. È possibile irradiare solo tre fibre per piatto, poiché il colorante fluorescente alla fine verrà endocitoso nella fibra e complicherà l'analisi dei dati.

Dopo aver utilizzato tre fibre, è necessario preparare un nuovo piatto. Utilizzando un software di analisi, è possibile calcolare la variazione dell'intensità della fluorescenza in un'area di circa 200 micron quadrati per il confronto tra le fibre. Il seguente calcolo deve essere effettuato per ogni fotogramma delta F diviso F zero, dove F zero è la fluorescenza media della regione di interesse nel primo fotogramma catturato e delta F è la variazione di fluorescenza in ogni fotogramma successivo.

Utilizzare metodi standard per trasfettare le cellule con DNA plasmidico che esprime GFP MG 53. Quindi preparare le micro pipette. Posizionare un capillare in Pyrex su una micropipetta.

Tirare e tirare con il programma preimpostato. Collegare la micropipetta a una coltura di micromanipolatore a tre assi. Il terreno viene rimosso dal piatto delta T e sostituito con un tampone tirometrico di calcio da 2,5 millimolari.

Posizionare la capsula contenente le cellule trasfettate su un microscopio confocale a scansione laser con obiettivo a immersione in olio 40 x 1,3 NA. Indurre un danno acuto alle cellule vive inserendo la micropipetta nella membrana cellulare e quindi ritraendo rapidamente la micropipetta dalla cellula. Raccogli immagini consecutive di cellule vive a un intervallo di 1,54 secondi per fotogramma per la rottura della membrana indotta dalla troponina.

PERFU 0,005% di troponina a una velocità di circa un millilitro al minuto direttamente sopra la cellula oggetto di ripresa. Il tapis roulant può essere utilizzato per misurare una riduzione della capacità di corsa. I topi knockout MG 53 visti qui hanno una capacità di corsa ridotta a causa del danno del muscolo scheletrico.

L'entità del danno causato dal laser UV dipende dalla capacità di riparazione della membrana della fibra vista. Ecco una fibra prima dell'infortunio in un topo normale. Questa immagine è stata catturata 200 secondi dopo e mostra una leggera ferita.

Una fibra muscolare derivata dai topi knockout MG 53 con capacità di riparazione della membrana compromessa mostrerà un ingresso di colorante più significativo dopo l'infortunio osservato. Ecco un esempio di un tubo micrometrico GFP MG 53 trasfettato C due C 12 integro. La freccia in questa immagine punta verso GFP MG 53 contenente vescicole che si muovono verso i siti del danno.

In questo esempio, la saponina è stata utilizzata per danneggiare la membrana plasmatica. Si noti la traslocazione della GFP MG 53 dal citosol alla membrana cellulare dopo una lesione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di isolare le fibre muscolari buone con membrane sarali lisce e schemi di striatura chiari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la capacità di riparazione della membrana del muscolo e della coltura, le cellule.