Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

In questo video vengono illustrate metodiche per quantificare e sequenziare singoli genomi di HIV da individui con cariche virali inferiori a 50 copie per millilitro di plasma. Innanzitutto, un tubo contenente sette millilitri di plasma viene centrifugato per ottenere il pellet. L'RNA virale viene quindi estratto per quantificare il livello di HIV-1.

Viene eseguito un saggio di copia singola in cui l'RNA viene retrotrascritto, caricato su una piastra a 96 pozzetti con standard e controlli e sottoposto a PCR quantitativa in tempo reale. Il livello di viremia viene quindi calcolato in base al volume di plasma in ingresso. È possibile rilevare anche sole 0,3 copie per millilitro per caratterizzare la popolazione virale.

Viene eseguito un singolo saggio di sequenziamento del genoma in cui il DNAc trascritto dall'RNA virale viene distribuito in una piastra a 96 pozzetti per raggiungere una diluizione al punto terminale. Successivamente, viene effettuata una PCR annidata per amplificare i genomi virali. Se il 30% o meno delle reazioni di PCR risulta positivo per un determinato campione, ciò indica l'amplificazione di una singola copia di DNAc.

Questi campioni vengono quindi sottoposti a sequenziamento per rivelare la sequenza nucleotidica dei singoli genomi virali. L'elevata sensibilità di queste tecniche ci consente di monitorare il livello di Ian in pazienti con HIV-1 RNA non rilevabile mediante saggi standard e di comprendere i meccanismi di controllo naturale. Sebbene utilizziamo questi metodi per studiare l'HIV con diversi primer e uno standard interno di ioni, lo stesso approccio può essere impiegato per studiare anche altri virus.

Generalmente, questo metodo è difficoltoso perché è difficile isolare il virus da grandi volumi di plasma, ed è necessario un ambiente privo di DNA per evitare risultati falsi positivi. Iniziare questa procedura estraendo l'RNA da campioni di plasma di pazienti. Trasferire sette millilitri di plasma in un tubo pulito da 15 millilitri.

Se l'RNA deve essere estratto per il saggio della copia singola, in questo punto vanno aggiunti 200 microlitri del controllo interno dei virioni contenenti 30.000 copie digeribili del virus RCAs. Successivamente, per evitare lipidi e detriti cellulari che potrebbero interferire con la quantificazione dell'RNA, centrifugare liberamente il plasma a 2.600 ×g per 15 minuti. Dopo la centrifugazione libera, contrassegnare con un pennarello resistente all'acqua un lato di una provetta per centrifuga easy seal, evitando qualsiasi detrito cellulare e/o lipidi. Utilizzare una pipetta per trasferire il plasma nella provetta easy seal precedentemente contrassegnata.

Quindi registrare il volume iniziale del plasma. Riempire i tubi con soluzione salina tamponata al tris fino al bordo inferiore del collo filettato. Assicurarsi che non siano presenti bolle.

Chiudere i tubi. Posizionare i campioni con la marcatura rivolta verso l'esterno in un rotore di ultracentrifuga preraffreddato. Centrifugare a 170.000 ×g a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo la centrifugazione, il pellet non sarà visibile. Rimuovere il surnatante, quindi aggiungere 90 microlitri di acqua di grado molecolare e 10 microlitri di proteina ACE K al pellet virale. Successivamente, assicurarsi che il tubo sia inclinato in modo che il pellet sia immerso nella miscela di acqua e proteina ACE K.

Posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius e incubare per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare brevemente il tubo per far scendere il campione sul fondo. Successivamente, dopo l'aggiunta di 10 microlitri di glicogeno al 20 milligrammi per millilitro e di 315 microlitri di soluzione di tiocianato di guanidina 6 molar, vortexare.

Trasferire delicatamente il contenuto del tubo in un nuovo tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 495 microlitri di isopropanolo di grado molecolare e vorticare per 10 secondi. Quindi centrifugare a 21.000 × g per 30 minuti a temperatura ambiente, eliminare il soprannatante e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% al tubo, vorticare per 10 secondi e centrifugare a 21.000 × g per 15 minuti. A temperatura ambiente, utilizzando una pipetta di trasferimento grande, rimuovere l'etanolo, centrifugare nuovamente ed eliminare ogni traccia residua di etanolo, quindi lasciare asciugare il pellet all'aria per 10 minuti.

Se verrà eseguito un saggio di copia singola, sciogliere il pellet in 55 microlitri di tampone per RNA e mettere il tubo sul ghiaccio. Se verrà eseguito un sequenziamento del genoma singolo, sciogliere l'RNA in 40 microlitri di tris cloridrato a pH 8,0 e lasciare i tubi a temperatura ambiente per eseguire un saggio di copia singola.

Le curve standard di HIV-1 e RCAs vengono preparate eseguendo una diluizione seriale semilogaritmica dei trascritti di RNA di HIV-1 e RCAs in tampone RNA. Dopo aver etichettato le provette da 1,5 millilitri, aggiungere 54 microlitri di tampone RNA in ciascuna provetta. Successivamente, effettuare la diluizione fino a 0,3 copie di RNA ogni 10 microlitri per HIV-1 e 100 copie di RNA ogni 10 microlitri per RCAs.

Mescolare mediante vortex dopo ogni diluizione. Dopo aver aggiunto 54 microlitri di tampone per RNA in ogni provetta, iniziare aggiungendo 25 microlitri del trascritto alla prima provetta, eseguire un impulso di vortex, centrifugare e trasferire consecutivamente alla provetta successiva, procedendo fino all'ultima provetta etichettata.

Una volta preparate le diluizioni, combinare il cocktail di trascrittasi inversa o RT per la sintesi del cDNA. Prepararne una quantità sufficiente per 96 reazioni di RT-PCR, inclusi otto controlli senza trascrittasi inversa o NRT, per verificare l'amplificazione proveniente da DNA. Successivamente, allestire una piastra ottica a 96 pozzetti, che conterrà otto campioni di pazienti, inclusi standard e controlli.

Aggiungere 20 microlitri della miscela di reazione NRT nelle otto pozzette designate per NRT e 20 microlitri della miscela di reazione RT nelle rimanenti 88 pozzette. Dopo aver aggiunto le miscele RT e NRT nella piastra, aggiungere 10 microlitri di acqua nelle pozzette etichettate come controlli negativi. Quindi aggiungere 10 microlitri di trascritti di HIV nelle pozzette etichettate HIV alle concentrazioni indicate nel protocollo scritto allegato, in due pozzette etichettate RCAs.

Aggiungere 10 microlitri di trascritti di RCAs nelle concentrazioni desiderate nei otto gruppi di tre pozzetti adiacenti etichettati come campione sulla piastra; aggiungere 10 microlitri del campione indicato. Aggiungere inoltre 10 microlitri di questo campione negli otto pozzetti etichettati NRT, quindi nei pozzetti etichettati come controllo interno. Alla fine, aggiungere cinque microlitri di campione e cinque microlitri di acqua.

La piastra a 96 pozzetti è preparata come mostrato in questa figura. Sigillare la piastra ed eseguire in un termociclatore secondo il seguente programma: 25 gradi Celsius per 15 minuti, 42 gradi Celsius per 40 minuti, 85 gradi Celsius per 10 minuti, 25 gradi Celsius per 30 minuti e mantenere a 5 gradi Celsius.

Preparare le miscele master per PCR per HIV e RCAs mentre vengono sintetizzati i cDNA. Al termine della sintesi del cDNA, portare la piastra in un'area esterna alla stanza pulita, designata per la manipolazione del cDNA.

Aggiungere 20 microlitri di mix master H-I-V-P-C-R per QPCR in ciascuna delle pozzette mostrate in verde in questa figura. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di mix master RCAs PCR nella pozzetta mostrata in grigio in questa figura. Centrifugare la piastra a 2.600 ×g dopo la centrifugazione.

Posizionare la piastra in un termociclatore per PCR in tempo reale ed eseguire la PCR quantitativa con le seguenti condizioni: 95 gradi Celsius per 10 minuti, seguiti da 45 cicli di 95 gradi Celsius per 15 secondi e 60 gradi Celsius per un minuto. Una volta ottenuti i risultati, è necessaria un'analisi separata per RCAs e HIV al fine di eseguire il sequenziamento del genoma singolo.

Iniziare sintetizzando il CD NA utilizzando RNA sospeso in cloridrato di tris a pH 8,0 come stampo. Prima, in una piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere cinque microlitri di DN NTP 10 millimolari, cinque microlitri del primer specifico per il gene 2 millimolari, sia pole che en, e 40 microlitri di RNA estratto. Sigillare la piastra con un film micros eal di BioRad.

Quindi incubare la reazione per 10 minuti a 65 gradi Celsius per la denaturazione. La miscela di RNA. Preparare la miscela per la reazione di trascrizione inversa mentre l'RNA si sta denaturando.

Si noti che questa è una miscela di reazione di RT diversa da quella utilizzata per il saggio di copia singola. Dopo il passaggio di denaturazione, posizionare la piastra PCR sul ghiaccio per mantenere l'RNA in forma denaturata. Quindi aggiungere 50 microlitri della miscela di reazione di RT appena preparata a ciascun campione ed eseguire la piastra PCR sul termociclatore con le seguenti impostazioni: 45 gradi Celsius per 50 minuti, 85 gradi Celsius per 10 minuti e 4 gradi Celsius per il mantenimento.

In questa fase, l'RNA viene trascritto in modo inverso in DNAc mentre il DNAc viene sintetizzato. Preparare la miscela di reazione PCR utilizzando primer P sei attraverso RT o primer per l'ambiente PCR. Si noti che questa è una miscela di reazione PCR diversa da quella utilizzata per il saggio di singola copia: 8,0 microlitri della miscela di reazione PCR, appena preparata, vengono aggiunti in ciascuna delle 73 pozzette di una nuova piastra PCR da 96 pozzette, comprese 70 campioni e tre controlli negativi.

Al termine della sintesi del CD NA, portare la piastra in un'area esterna alla stanza pulita designata per la manipolazione del CD NA. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di tris cloridrato a pH 8,0 al campione di CD NA per portare il volume finale a 140 microlitri. Quindi aggiungere 2,0 microlitri di campione in ciascuna delle 70 pozzette e 2,0 microlitri di acqua in ciascuno dei controlli negativi. Sigillare una piastra PCR ed eseguire la PCR utilizzando il programma mostrato qui.

Successivamente, eseguire la PCR annidata seguendo le istruzioni riportate nel testo scritto allegato. Eseguire i campioni ottenuti mediante PCR su un gel di agarosio all'1%. Esaminare i risultati.

Se non più del 30% delle pozzette risulta positivo, la maggior parte dei prodotti di PCR deriva da una singola molecola di cDNA. È stato eseguito un saggio a copia singola come descritto in questo video. Questa figura mostra i risultati di QPCR provenienti da alcuni dei controller elite.

Come si può vedere qui, le curve di amplificazione per i campioni e lo standard di HIV diluito appaiono corrette. Il recupero dello standard virionico interno è stato superiore a 1500 copie per la maggior parte dei campioni, ad eccezione del campione sette, cerchiato. I risultati del campione tre, evidenziati in rosso, indicano un'estrazione dell'RNA efficiente.

Il numero di copie nelle tre pozzette era rispettivamente zero, una e zero copie. Il controllo NRT evidenziato in arancione e il controllo negativo evidenziato in giallo erano entrambi negativi, confermando che l'amplificazione non era influenzata da contaminazioni provenienti da altri campioni o dal DNA. Poiché i controlli positivo e negativo hanno superato i test, il numero di copie può ora essere calcolato. Il numero medio di copie di 0,3 deve essere moltiplicato per un fattore di 5,5 per ottenere il numero totale di copie nell'eluito di RNA: 0,3 per 5,5 equivale a 1,65, quindi diviso per il volume totale di plasma analizzato, pari a 7,3 millilitri, ottenendo un valore di RNA di HIV-1 di 0,2 copie per ml.

L'analisi del sequenziamento del singolo genoma è stata eseguita come descritto nel video. Questa figura mostra un gel AROS proveniente da uno dei soggetti non controllori dell'HIV nello studio. I controlli negativi, nei pozzetti H1 e H2, sono entrambi negativi.

Meno di un terzo delle pozzette ha mostrato amplificazione, assicurando che si tratti di una diluizione endpoint, e la maggior parte di queste amplificazioni proviene da una singola copia di cDNA. Un allineamento delle sequenze ottenute tramite SGS è mostrato qui. Non sono presenti siti ambigui, il che conferma che l'amplificazione è avvenuta a partire da una singola copia di cDNA durante il tentativo di estrazione dell'RNA da grandi volumi di plasma.

È importante ricordare di eseguire la pre-centrifugazione per rimuovere le cellule e i lipidi che potrebbero interferire con l'efficienza del saggio dopo il suo sviluppo. Questa tecnica è stata utilizzata per studiare la dinamica virale in una vasta gamma di gruppi di pazienti con cariche virali al di sotto del limite di rilevabilità dei saggi standard.