Microscopia statica a forza atomica per visualizzare e caratterizzare nucleosomi assemblati

I nucleosomi, l'unità ripetitiva di base della cromatina eucariotica, comprendono le rotazioni di DNA avvolte attorno a un nucleo di proteine istoniche.

Per visualizzare i nucleosomi assemblati mediante microscopia statica a forza atomica, AFM, iniziare con una sottile striscia di mica, funzionalizzata per rendere la superficie carica positivamente. Tagliate la striscia a quadratini. Pipettare una sospensione nucleosomica assemblata.

Il DNA caricato negativamente nel nucleosoma si lega al gruppo caricato positivamente della striscia di mica funzionalizzata attraverso interazioni elettrostatiche. Lavare con tampone per evitare il sovraffollamento dei nucleosomi.

Fissare la striscia di mica su un disco di supporto del campione. Montarlo sullo stadio dello strumento AFM.

Fissare il supporto della sonda alla testa ottica dello strumento. Il supporto contiene un cantilever AFM premontato con una punta all'apice.

Allineare il raggio laser sul retro a sbalzo per una misurazione accurata della deflessione. Posizionare la punta a contatto diretto con la superficie contenente il nucleosoma.

Durante l'imaging in modalità di contatto, quando la punta a sbalzo esegue la scansione attraverso la superficie del nucleosoma, si verificano forze repulsive in seguito alle interazioni tra gli atomi della punta e del campione. Questo provoca la flessione del cantilever. Il raggio laser viene riflesso in modo diverso e diretto verso il fotorilevatore sensibile alla posizione.

Il circuito di feedback mantiene costante la deflessione a sbalzo grazie al movimento verticale dello scanner durante la scansione. Questo segnale di feedback viene ulteriormente utilizzato per generare immagini topografiche dei nucleosomi. Il nucleo del nucleosoma appare come macchie luminose, con bracci sottili che rappresentano il DNA fiancheggiante.

Preparare la superficie di mica per l'imaging AFM statico. Per fare ciò, preparare prima una soluzione madre APS da 50 millimolari in acqua deionizzata. Conservare 1 millilitro di aliquote della soluzione a 4 gradi Celsius, fino a quando non è necessario.

Dalla soluzione madre, preparare una soluzione APS funzionante per la modifica della mica sciogliendo 50 microlitri del brodo APS da 50 millimolari in 15 millilitri di acqua distillata deionizzata. Mescolare la soluzione e poi riempire una cuvetta con la soluzione.

Quindi, taglia strisce di mica da 1 per 3 centimetri da fogli di mica di alta qualità. Verificare che il pezzo si adatti quando viene posizionato in diagonale in una cuvetta. Quindi, tagliare gli strati di mica fino a quando entrambi i lati sono appena tagliati e il pezzo è sottile fino a 0,1 millimetri.

Posizionare immediatamente il pezzo di mica nella cuvetta riempita di APS e incubare la mica per 30 minuti. Trasferire il pezzo di mica in una cuvetta riempita con acqua distillata deionizzata e immergerla per 30 secondi. Quindi, utilizzare l'argon per asciugare completamente entrambi i lati della striscia di mica APS.

Applicare del nastro biadesivo su diversi dischi magnetici e posizionarli lateralmente. Quindi, taglia il substrato di mica APS a quadrati di 1 centimetro per 1 centimetro e coprili in una capsula di Petri pulita. Successivamente, preparare tre diluizioni dei nucleosomi assemblati utilizzando un tampone filtrato da 0,22 micron contenente HEPES da 10 millimolari e cloruro di magnesio da 4 millimolari a un pH di 7,5.

Per limitare la perdita di nucleosomi alla bassa concentrazione finale, la diluizione deve essere effettuata uno alla volta, immediatamente prima della deposizione sulla APS-mica.

Depositare da 5 a 10 microlitri di ciascun campione di nucleosoma al centro di un pezzo di mica APS e lasciarli incubare per 2 minuti. Quindi, sciacquare delicatamente il campione con 2 o 3 millilitri di acqua distillata deionizzata per rimuovere i componenti tampone e asciugare il campione depositato sotto un leggero flusso di argon.

Per iniziare, montare una punta sul supporto della punta della configurazione AFM. Quindi, montare il primo campione sullo stadio AFM, facendo attenzione a non toccare la superficie del campione. Posizionare il laser sul cantilever fino a quando la sua somma non raggiunge il massimo e regolare i valori di deflessione verticale e laterale vicino a 0. Quindi, sintonizzare la sonda AFM per trovare la sua frequenza di risonanza. Regolare l'ampiezza dell'unità e impostare la dimensione dell'immagine su 100 per 100 nanometri. Una volta configurato, fai clic sul pulsante Attiva per iniziare l'approccio.

Al termine dell'avvicinamento, ottimizzare gradualmente il set point di ampiezza fino a quando la superficie del campione non è chiaramente visibile. Quindi, aumentare le dimensioni di scansione a 1 micron per 1 micron e la risoluzione a 512 per 512 pixel. Infine, fai clic sul pulsante Cattura per iniziare l'acquisizione dell'immagine.