Name: Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Impara a preparare librerie mRNA-Seq Illumina da soli 10 nanogrammi di RNA totale usando l'amplificazione lineare T7. Questo metodo consente l'analisi dell'espressione genica da campioni limitati.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Morgridge Istituto per la Ricerca e l&#39;Università del Wisconsin Fondazione. Ringraziamo Krista Eastman per l&#39;assistenza editoriale.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Gli autori rivelare che JAT è uno dei fondatori, stockowner, consulente e membro del consiglio di Cellular Dynamics International (CDI). Si serve anche come consulente scientifico e ha interessi finanziari in joint sulle cellule staminali Tactics II.

Attuali protocolli per rendere le biblioteche fine abbinato richiedono tra 1 mg 9-2,5 mcg 10 importo iniziale di RNA totale. Qui vi presentiamo il nostro lineare di amplificazione basato T7 (T7LA) per preparare sia letto singolo e associato biblioteche Illumina fine di sequenziamento e dimostrare che questo metodo permette la generazione di librerie da un minimo di 10 ng di RNA totale, producendo dati paragonabile a quella di minimamente amplificato (MinAmp) librerie fatte da 1000 volte più materiale di partenza (10 mcg totale RNA). Le 10 librerie ng non solo di identificare simili numero totale di geni, ma anche produrre firme di espressione genica che sono simili (Figure 3a e b). Inoltre, sia le singole biblioteche fine leggere e associato ottenuti con il metodo T7LA sono molto simili tra loro (Figura 3c), che permette ai ricercatori di confrontare i dati generati dalle biblioteche fatto da uno dei due protocolli. Dal momento che queste librerie sono state preparate da RNA di cellule staminali embrionali, abbiamo cercatoper i geni specifici delle cellule staminali 30 tra le librerie e scoprire che quasi tutti questi geni (93-100%) sono identificati con le librerie base di almeno 10 ng di RNA totale di partenza (Figura 4), convalidando così il nostro protocollo. Crediamo che il nostro protocollo sarebbe molto utile per i ricercatori, soprattutto in circostanze come celle di flusso ordinato o laser-micro-tessuto sezionato in cui il materiale di partenza è limitante. In tali circostanze, il nostro protocollo permetterebbe la generazione di dati di espressione genica simile a biblioteche fatto da molto più grande quantità a partire dal nostro protocollo produce profili di espressione comparabili tra almeno 3 ordini di grandezza di RNA di partenza.

<table border="1"><tbody><tr><td> Azienda </td><td> Kit / reagente </td><td> Catalogo </td><td> Commenti speciale </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> La frammentazione del reagente </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Acrilamide </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC non trattato nucleasi acqua libera </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP set </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP metilato </td><td> R0431 </td><td> Per singola preparazione del campione di sola lettura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Per singola preparazione del campione di sola lettura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 cicli </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Per singola preparazione del campione di sola lettura. Può essere sostituito con il campione di DNA ONA Mix di preparazione Master Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Per la preparazione del campione solo fine accoppiato </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Accoppiati End Kit campione Prep </td><td> PE-102-1001 </td><td> Per la preparazione del campione solo fine accoppiato </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb scala più </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Secondo filone di buffer 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polimerasi </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR sicuro il 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Apice III (con 5X FS tampone e 0,1 M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit test kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit test kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA ligasi </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> DNA polimerasi T4 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure DNasi RNase acqua </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Apice II a doppio filamento kit di sintesi del DNA </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Primer random (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Per la preparazione del campione solo fine accoppiato </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B Primer </td><td> N / A </td><td> Per le singole Leggi samPLE di preparazione solo </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 digestione kit </td><td> R0189S </td><td> Per singola preparazione del campione di sola lettura </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Minelute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel kit di purificazione </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNasi set </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo ricerca </td><td> DNA pulito e concentratore (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

leggi singolo e accoppiamento finale mrna-seq biblioteche illumina da 10 nanogrammi di rna totale

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Sequenziamento del trascrittoma intero mRNA-Seq è ormai ampiamente utilizzata per eseguire l&#39;espressione genica globale, la mutazione, allele-specifica espressione e di altri genoma analisi. mRNA-Seq apre anche la porta per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica di non genomi sequenziati. mRNA-Seq offre alta sensibilità, un&#39;ampia gamma dinamica e consente di misurare numero di copie di trascrizione in un campione. Analizzatore del genoma Illumina effettua il sequenziamento di un numero elevato (&gt; 10 7) della sequenza relativamente breve, si legge (&lt;150 bp). Il &quot;abbinato fine&quot; approccio, in cui un letto singolo lungo è sequenziato ad entrambe le sue estremità, consente di seguire giunzioni di splicing alternativo , inserimenti ed eliminazioni, ed è utile per il montaggio de novo trascrittoma. Una delle sfide principali affrontate dai ricercatori è una quantità limitata di materiale di partenza. Per esempio, in esperimenti in cui vengono raccolte le cellule con il laser micro-dissezione, disponibile a partire da RNA totale may misura in nanogrammi. Preparazione di mRNA-Seq librerie da tali campioni sono stati descritti 1, 2 ma prevede un uso intensivo di amplificazione che possono introdurre distorsioni. Altri RNA-Seq procedure di costruzione della libreria con il minimo di amplificazione sono stati pubblicati 3, 4 ma richiedono quantità microgrammo di RNA totale di partenza. Qui descriviamo un protocollo per la piattaforma Illumina Genome Analyzer II per mRNA-Seq sequenziamento per la preparazione della libreria che evita significativi di amplificazione e richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale. Anche se questo protocollo è stato descritto in precedenza e validato per single-end sequenziamento 5, dove è stato dimostrato che per produrre librerie direzionali, senza introdurre distorsioni significative amplificazione, qui lo abbiamo validare ulteriormente per essere utilizzato come protocollo di fine appaiati. Noi amplificare selettivamente RNA messaggeri polyadenylated l&#39;avvio RNA totale utilizzando il metodo basato T7 amplificazione lineare Eberwine, coniato &quot;T7LA &quot;(T7 amplificazione lineare). Amplificato La poly-A mRNA sono frammentati, trascrizione inversa e l&#39;adattatore legatura per produrre la sequenza finale biblioteca. Per entrambe le corse singole in lettura e associato, le sequenze vengono mappati al trascrittoma umano 6 e normalizzata in modo che dati provenienti da più esecuzioni può essere paragonato. Riportiamo la misura dell&#39;espressione genica in unità di trascrizioni per milione (TPM), che è una misura superiore a RPKM quando si confrontano i campioni 7.

Qui si descrive un metodo per la preparazione di entrambi i singoli letti e associato fine Illumina mRNA-Seq librerie sequenziamento per l&#39;analisi di espressione genica basata su amplificazione lineare dell&#39;RNA T7. Questo protocollo richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale di partenza e genera librerie altamente coerente rappresentanza trascrizioni intero.

Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale

Il sequenziamento dell'intero trascritto tramite mRNA-Seq è oggi ampiamente utilizzato per eseguire l'analisi globale dell'espressione genica, delle mutazioni, dell'espressione allele-specifica e di altri...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare librerie di sequenze mRNA Illumina a partire da piccole quantità di materiale iniziale. Il primo passaggio della procedura consiste nella trascrizione inversa dell'RNA totale con primer DTT sette per produrre CD NA. Il CD NA viene utilizzato per l'amplificazione dell'RNA mediante trascrizione in vitro. Successivamente, l'RNA amplificato viene sottoposto a frammentazione casuale.La trascrizione inversa dell'RNA frammentato produce DNAc, che subisce la ligazione degli adattatori, la selezione per dimensione e l'amplificazione mediante PCR. In definitiva, questo protocollo mostra il profilo di espressione genica del campione attraverso la misurazione del numero di copie dei geni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che richiede soltanto 10 nanogrammi di RNA totale iniziale.Questo valore è di diversi ordini di grandezza inferiore rispetto a quanto richiesto da altri protocolli esistenti. Inoltre, può generare librerie accoppiate a partire da quantità così ridotte di RNA iniziale. Questo metodo permetterà agli scienziati di esplorare nuove domande in biologia, consentendo la determinazione di profili di espressione genica da popolazioni cellulari difficili da ottenere, come quelle derivate da microdissezione laser, da diss
ezione microscopica o da citometria a flusso.L'idea di sviluppare questo metodo è nata quando abbiamo avuto la necessità di analizzare l'espressione genica a partire da un numero molto limitato di cellule differenziate da cellule staminali amniotiche umane. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le operazioni di manipolazione dell'RNA sono difficili da apprendere a causa della quantità estremamente ridotta di RNA, facilmente degradabile. La procedura sarà illustrata da Angela Elwell, Jennifer Bolen e Baal Kimm Wynn del mio laboratorio.Il metodo per la preparazione parallela di librerie per sequenziamento single read e paired end è un procedimento articolato in più fasi, come illustrato in questo diagramma di flusso. In primo luogo, l'RNA totale viene isolato dalle cellule o dai tessuti di interesse e utilizzato per preparare il CD NA a doppio filamento. Gli RNA messaggeri poliadenilati vengono quindi amplificati selettivamente a partire dal CD NA mediante il metodo di amplificazione lineare ewin basato su T sette. Successivamente, il poli A A amplificato viene frammentato in modo casuale.Dopo che l'RNA frammentato è stato purificato, viene trascritto a ritroso in CD NA. Il CD NA viene riparato alle estremità e vengono aggiunte basi A all'estremità tre prime dei frammenti di DNA. Successivamente, al DNA viene effettuata la ligazione degli adattatori e non viene eseguita alcuna digestione. Nel caso della libreria a singolo Reed, la libreria di DNA viene quindi isolata mediante purificazione su gel e amplificata tramite PCR per ligare gli adattatori Illumina.Infine, dopo la quantificazione della libreria di DNA, questa è pronta per il sequenziamento. Ai fini di questo video, verranno dimostrate solo alcune procedure selezionate all'interno di questo protocollo. La trascrizione inversa degli mRNA poliA frammentati in cDNA comprende la sintesi del primo e del secondo filamento.Per la sintesi del primo filamento della libreria a lettura singola, aggiungere i seguenti reagenti in un tubo PCR: 10 microlitri di poli-mRNA frammentato e un microlitro di primer nonamer non casuale. La sequenza del primer nonamer non casuale è mostrata qui. La sequenza prossimale al cinque prime indicata in verde è il sito di restrizione not one.Mentre la sequenza mostrata in blu è il complemento inverso della sequenza dell'adattatore B di Illumina del kit di sequenze del chip, incubare la miscela a 70 gradi Celsius per cinque minuti nel termociclatore e quindi raffreddare rapidamente in ghiaccio. Mantenendo la miscela in ghiaccio, aggiungere i seguenti reagenti dal kit SuperScript III: quattro microlitri di buffer 5x per il primo filamento, due microlitri di DTT e 1,5 microlitri di miscela dNTP. Nella miscela dNTP, utilizzare 5-metil-dCTP invece di dCTP. Posizionare il tubo nel termociclatore a 42 gradi Celsius per due minuti, quindi aggiungere un microlitro di SuperScript III, reverse trascrittasi, e incubare a 42 gradi Celsius per un'ora.Successivamente, preparare la reazione per la sintesi del primo filamento per la libreria para end. Aggiungere in una provetta PCR i seguenti reagenti: 10 microlitri di poli NNA frammentato e un microlitro di primer esamerico casuale. Incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti nel termociclatore, quindi raffreddare rapidamente in ghiaccio.Mantenendo il tubo sul ghiaccio, aggiungere i seguenti reagenti dal kit Superscript III: quattro microlitri di buffer per primo filamento 5x, due microlitri di DTT e 1,5 microlitri di dNTP. Incubare nel termociclatore a 45 gradi Celsius per un minuto. Successivamente, aggiungere un microlitro di Superscript III, trascrittasi inversa, e incubare a 45 gradi Celsius per un'ora dopo un'ora.Entrambe le reazioni sono pronte per la sintesi del secondo filamento. Aggiungere a ciascuna delle miscele su ghiaccio i seguenti reagenti dal kit superscript due: 91 microlitri di acqua libera, 30 microlitri di buffer per il secondo filamento 5x, tre microlitri di DNTP, un microlitro di DNA ligasi da e coli, quattro microlitri di DNA polimerasi da e coli e un microlitro di RNasi H da E coli. Mescolare ogni provetta per inversione, quindi centrifugare brevemente e incubare a 16 gradi Celsius per due ore.Per la riparazione dei capi del cDNA per la libreria a singola lettura, aggiungere a 40 microlitri di cDNA purificato i seguenti reagenti: cinque microlitri di buffer per la T4 DNA ligasi contenente 10 millimolare di ATP, due microlitri di mix di dNTP, un microlitro di T4 DNA polimerasi, un microlitro di enzima klino e un microlitro di T4 PNK per la riparazione dei capi del cDNA. Per la libreria a lettura accoppiata, aggiungere a 30 microlitri di cDNA purificato questi reagenti: 45 microlitri di RNasi, acqua priva di DNasi.10 microlitri di tampone T4 DNA ligasi con 10 millimolare. A TP quattro microlitri di miscela 10 millimolare DNTP, cinque microlitri di T4 DNA polimerasi, un microlitro di enzima klino e cinque microlitri di T4 PNK; incubare entrambi i tubi nel termociclatore a 20 gradi Celsius per 30 minuti dopo la riparazione dei capi.Il passo successivo di questo protocollo consiste nell'aggiungere basi adeniniche all'estremità tre primi dei frammenti di DNA per la libreria a lettura singola. Preparare la seguente miscela di reazione: 34 microlitri di campione di DNA, cinque microlitri di buffer klino, 10 microlitri di DATP e un microlitro di klino exo. Per la libreria a lettura accoppiata, preparare la seguente miscela di reazione: 32 microlitri di campione di DNA, cinque microlitri di buffer clin out. 10 microlitri di DATP e tre microlitri di clin out exo, incubare entrambe le miscele di reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima di allestire le reazioni per la ligazione degli adattatori. Scongelare gli adattatori sul ghiaccio e diluirli uno a 20 per la libreria a lettura singola. Utilizzare il kit di preparazione campioni per sequenza del chip Illumina per preparare la seguente miscela di reazione: 10 microlitri di campione di DNA, un microlitro di mix di oligo adattatore, 15 microlitri di tampone DNA Ligasi 2X e quattro microlitri di DNA Ligasi; incubare per 15 minuti.A temperatura ambiente per la libreria in lettura doppia, utilizzare il kit Illumina per la preparazione di campioni in lettura doppia per preparare la seguente reazione. Mescolare 10 microlitri di campione di DNA, 10 microlitri di miscela di oligo adattatori PE, 25 microlitri di buffer per DNA ligasi 2X e 5 microlitri di DNA ligasi; incubare per 15 minuti a 20 gradi Celsius al termine delle rispettive incubazioni. Purificare entrambe le reazioni di ligazione utilizzando colonne XMO.Eluire, la libreria a lettura singola e 44 microlitri di acqua per eluire la libreria a estremità accoppiate con sei microlitri di buffer di eluizione, seguiti da un’ulteriore eluizione in cinque microlitri di eb. Eseguire una digestione non one esclusivamente per la libreria a lettura singola. Incubare da due ore a tutta la notte a 37 gradi Celsius dopo aver purificato la reazione utilizzando una colonna ZY IMO.Eluire la libreria a singola lettura con sei microlitri di tampone EB, seguiti da una seconda diluizione con cinque microlitri di EB. Il DNA con adattatori ligati, per entrambe le librerie, è ora pronto per la selezione dimensionale. La procedura di selezione dimensionale del DNA con adattatori ligati viene eseguita utilizzando un 2% Cyber Safe EE di In Vitrogen; per iniziare questa procedura, eseguire il programma zero in pre-corso per due minuti.Dopo la pre-correazione, caricare 10 microlitri del campione uno KB plus ladder e dei campioni 2D NA. Riempire le corsie vuote con 10 microlitri di acqua ed eseguire il programma. Un egel 2% per 28 minuti.Al termine della corsa, selezionare le bande di gel corrispondenti a 200-300 paia di basi utilizzando una lama fresca. È stato valutato il numero di geni identificati dalle diverse librerie, e questa tabella mostra informazioni sui numeri dei cluster. Geni identificati, tasso di errore e percentuale di allineamento delle librerie a lettura singola e a estremità accoppiate, sia per le librerie a lettura singola che a estremità accoppiate.Le librerie T seven LA da 10 nanogrammi hanno identificato quasi lo stesso numero di geni delle librerie UN amplificate da 10 microgrammi con un valore di TPM pari o superiore a 10. Nel caso delle librerie a lettura singola, la libreria T seven LA da 10 nanogrammi ha identificato il 100% degli 8.500 geni rilevati dalla libreria amplificata UN da 10 microgrammi per le librerie paradigmatiche. La libreria T seven LA da 10 nanogrammi ha identificato l'86% dei geni individuati dalla libreria UN da 10 microgrammi.Le librerie preparate con meno di 10 nanogrammi non sono state in grado di identificare un numero altrettanto elevato di geni. Ad esempio, nel protocollo con lettura singola, la libreria T seven LA di un nanogrammo ha identificato solo circa il 50% dei geni rilevati dalla libreria min amp di 10 microgrammi. Pertanto, la quantità minima di RNA totale da utilizzare con il protocollo T seven LA dovrebbe essere limitata a 10 nanogrammi, in relazione al mapping di un gene housekeeping.GA DH mostra che tutte le librerie T seven LA realizzate con almeno 10 nanogrammi di RNA iniziale hanno identificato tutti gli esoni, inclusi gli esoni estremi al capo cinque prime. La barra della scala a sinistra per le librerie a singola lettura indica un totale di 350 letture. La barra della scala al centro per le librerie DEN indica un totale di 5.000 letture.Un confronto tra le librerie a lettura singola e a estremità accoppiate di 10 nanogrammi di T seven LA e le librerie min amp mostra un elevato grado di similarità. È stato ottenuto un coefficiente di correlazione di Spearman pari a 0,90 tra la libreria a lettura singola di 10 nanogrammi di T seven LA e la libreria min amp di 10 microgrammi, e una correlazione di 0,95 tra la libreria PEREN di 10 nanogrammi di T seven LA e la libreria min amp di 10 microgrammi. Inoltre, è stato effettuato un confronto tra le due librerie a lettura singola e PEREN realizzate a partire da 10 nanogrammi di RNA totale, e l'elevatissimo coefficiente di correlazione dimostra che entrambi i tipi di librerie ottenuti mediante il protocollo T seven LA producono una firma di espressione genica molto simile.Infine, poiché queste librerie sono state preparate a partire da RNA di cellule staminali embrionali umane, sono stati ricercati specifici geni all'interno delle librerie. Quasi tutti questi geni sono stati identificati mediante le librerie ottenute da almeno 10 nanogrammi di RNA totale iniziale, confermando così il protocollo. Durante l'esecuzione di questo protocollo, è fondamentale maneggiare i campioni di RNA a basso peso molecolare con la massima cautela per prevenire il degrado.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare librerie Illumina, Mr.Aeq a lettura singola e Paradigm a partire da quantità molto ridotte di materiale iniziale.

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Qui descriviamo le fasi di raccolta e preparazione dei campioni per RIBO-seq nei batteri. Il sequenziamento delle biblioteche elaborate secondo queste linee guida si traduce in dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è semplice, utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede sette giorni dalla lisi all'ottenimento delle biblioteche.

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

Il sequenziamento dell'RNA a quantificazione assoluta (AQRNA-seq) è una tecnologia sviluppata per quantificare il panorama di tutti i piccoli RNA nelle miscele biologiche. Qui, vengono dimostrate sia le fasi di preparazione della libreria che quelle di elaborazione dei dati di AQRNA-seq, quantificando i cambiamenti nel pool di RNA di trasferimento (tRNA) in Mycobacterium bovis BCG durante la dormienza indotta dalla fame.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Estrazione RNA da cellule Neuroprecursor Utilizzando il Bio-Rad RNA totale Kit

Impara a preparare librerie mRNA-Seq Illumina da soli 10 nanogrammi di RNA totale usando l'amplificazione lineare T7. Questo metodo consente l'analisi dell'espressione genica da campioni limitati.

Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale

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