Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale
27 ottobre 2011
Qui si descrive un metodo per la preparazione di entrambi i singoli letti e associato fine Illumina mRNA-Seq librerie sequenziamento per l'analisi di espressione genica basata su amplificazione lineare dell'RNA T7. Questo protocollo richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale di partenza e genera librerie altamente coerente rappresentanza trascrizioni intero.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare librerie di sequenze mRNA Illumina a partire da piccole quantità di materiale iniziale. Il primo passaggio della procedura consiste nella trascrizione inversa dell'RNA totale con primer DTT sette per produrre CD NA. Il CD NA viene utilizzato per l'amplificazione dell'RNA mediante trascrizione in vitro. Successivamente, l'RNA amplificato viene sottoposto a frammentazione casuale.
La trascrizione inversa dell'RNA frammentato produce DNAc, che subisce la ligazione degli adattatori, la selezione per dimensione e l'amplificazione mediante PCR. In definitiva, questo protocollo mostra il profilo di espressione genica del campione attraverso la misurazione del numero di copie dei geni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che richiede soltanto 10 nanogrammi di RNA totale iniziale.
Questo valore è di diversi ordini di grandezza inferiore rispetto a quanto richiesto da altri protocolli esistenti. Inoltre, può generare librerie accoppiate a partire da quantità così ridotte di RNA iniziale. Questo metodo permetterà agli scienziati di esplorare nuove domande in biologia, consentendo la determinazione di profili di espressione genica da popolazioni cellulari difficili da ottenere, come quelle derivate da microdissezione laser, da diss ezione microscopica o da citometria a flusso.
L'idea di sviluppare questo metodo è nata quando abbiamo avuto la necessità di analizzare l'espressione genica a partire da un numero molto limitato di cellule differenziate da cellule staminali amniotiche umane. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le operazioni di manipolazione dell'RNA sono difficili da apprendere a causa della quantità estremamente ridotta di RNA, facilmente degradabile. La procedura sarà illustrata da Angela Elwell, Jennifer Bolen e Baal Kimm Wynn del mio laboratorio.
Il metodo per la preparazione parallela di librerie per sequenziamento single read e paired end è un procedimento articolato in più fasi, come illustrato in questo diagramma di flusso. In primo luogo, l'RNA totale viene isolato dalle cellule o dai tessuti di interesse e utilizzato per preparare il CD NA a doppio filamento. Gli RNA messaggeri poliadenilati vengono quindi amplificati selettivamente a partire dal CD NA mediante il metodo di amplificazione lineare ewin basato su T sette. Successivamente, il poli A A amplificato viene frammentato in modo casuale.
Dopo che l'RNA frammentato è stato purificato, viene trascritto a ritroso in CD NA. Il CD NA viene riparato alle estremità e vengono aggiunte basi A all'estremità tre prime dei frammenti di DNA. Successivamente, al DNA viene effettuata la ligazione degli adattatori e non viene eseguita alcuna digestione. Nel caso della libreria a singolo Reed, la libreria di DNA viene quindi isolata mediante purificazione su gel e amplificata tramite PCR per ligare gli adattatori Illumina.
Infine, dopo la quantificazione della libreria di DNA, questa è pronta per il sequenziamento. Ai fini di questo video, verranno dimostrate solo alcune procedure selezionate all'interno di questo protocollo. La trascrizione inversa degli mRNA poliA frammentati in cDNA comprende la sintesi del primo e del secondo filamento.
Per la sintesi del primo filamento della libreria a lettura singola, aggiungere i seguenti reagenti in un tubo PCR: 10 microlitri di poli-mRNA frammentato e un microlitro di primer nonamer non casuale. La sequenza del primer nonamer non casuale è mostrata qui. La sequenza prossimale al cinque prime indicata in verde è il sito di restrizione not one.
Mentre la sequenza mostrata in blu è il complemento inverso della sequenza dell'adattatore B di Illumina del kit di sequenze del chip, incubare la miscela a 70 gradi Celsius per cinque minuti nel termociclatore e quindi raffreddare rapidamente in ghiaccio. Mantenendo la miscela in ghiaccio, aggiungere i seguenti reagenti dal kit SuperScript III: quattro microlitri di buffer 5x per il primo filamento, due microlitri di DTT e 1,5 microlitri di miscela dNTP. Nella miscela dNTP, utilizzare 5-metil-dCTP invece di dCTP. Posizionare il tubo nel termociclatore a 42 gradi Celsius per due minuti, quindi aggiungere un microlitro di SuperScript III, reverse trascrittasi, e incubare a 42 gradi Celsius per un'ora.
Successivamente, preparare la reazione per la sintesi del primo filamento per la libreria para end. Aggiungere in una provetta PCR i seguenti reagenti: 10 microlitri di poli NNA frammentato e un microlitro di primer esamerico casuale. Incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti nel termociclatore, quindi raffreddare rapidamente in ghiaccio.
Mantenendo il tubo sul ghiaccio, aggiungere i seguenti reagenti dal kit Superscript III: quattro microlitri di buffer per primo filamento 5x, due microlitri di DTT e 1,5 microlitri di dNTP. Incubare nel termociclatore a 45 gradi Celsius per un minuto. Successivamente, aggiungere un microlitro di Superscript III, trascrittasi inversa, e incubare a 45 gradi Celsius per un'ora dopo un'ora.
Entrambe le reazioni sono pronte per la sintesi del secondo filamento. Aggiungere a ciascuna delle miscele su ghiaccio i seguenti reagenti dal kit superscript due: 91 microlitri di acqua libera, 30 microlitri di buffer per il secondo filamento 5x, tre microlitri di DNTP, un microlitro di DNA ligasi da e coli, quattro microlitri di DNA polimerasi da e coli e un microlitro di RNasi H da E coli. Mescolare ogni provetta per inversione, quindi centrifugare brevemente e incubare a 16 gradi Celsius per due ore.
Per la riparazione dei capi del cDNA per la libreria a singola lettura, aggiungere a 40 microlitri di cDNA purificato i seguenti reagenti: cinque microlitri di buffer per la T4 DNA ligasi contenente 10 millimolare di ATP, due microlitri di mix di dNTP, un microlitro di T4 DNA polimerasi, un microlitro di enzima klino e un microlitro di T4 PNK per la riparazione dei capi del cDNA. Per la libreria a lettura accoppiata, aggiungere a 30 microlitri di cDNA purificato questi reagenti: 45 microlitri di RNasi, acqua priva di DNasi.
10 microlitri di tampone T4 DNA ligasi con 10 millimolare. A TP quattro microlitri di miscela 10 millimolare DNTP, cinque microlitri di T4 DNA polimerasi, un microlitro di enzima klino e cinque microlitri di T4 PNK; incubare entrambi i tubi nel termociclatore a 20 gradi Celsius per 30 minuti dopo la riparazione dei capi.
Il passo successivo di questo protocollo consiste nell'aggiungere basi adeniniche all'estremità tre primi dei frammenti di DNA per la libreria a lettura singola. Preparare la seguente miscela di reazione: 34 microlitri di campione di DNA, cinque microlitri di buffer klino, 10 microlitri di DATP e un microlitro di klino exo. Per la libreria a lettura accoppiata, preparare la seguente miscela di reazione: 32 microlitri di campione di DNA, cinque microlitri di buffer clin out.
10 microlitri di DATP e tre microlitri di clin out exo, incubare entrambe le miscele di reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima di allestire le reazioni per la ligazione degli adattatori. Scongelare gli adattatori sul ghiaccio e diluirli uno a 20 per la libreria a lettura singola. Utilizzare il kit di preparazione campioni per sequenza del chip Illumina per preparare la seguente miscela di reazione: 10 microlitri di campione di DNA, un microlitro di mix di oligo adattatore, 15 microlitri di tampone DNA Ligasi 2X e quattro microlitri di DNA Ligasi; incubare per 15 minuti.
A temperatura ambiente per la libreria in lettura doppia, utilizzare il kit Illumina per la preparazione di campioni in lettura doppia per preparare la seguente reazione. Mescolare 10 microlitri di campione di DNA, 10 microlitri di miscela di oligo adattatori PE, 25 microlitri di buffer per DNA ligasi 2X e 5 microlitri di DNA ligasi; incubare per 15 minuti a 20 gradi Celsius al termine delle rispettive incubazioni. Purificare entrambe le reazioni di ligazione utilizzando colonne XMO.
Eluire, la libreria a lettura singola e 44 microlitri di acqua per eluire la libreria a estremità accoppiate con sei microlitri di buffer di eluizione, seguiti da un’ulteriore eluizione in cinque microlitri di eb. Eseguire una digestione non one esclusivamente per la libreria a lettura singola. Incubare da due ore a tutta la notte a 37 gradi Celsius dopo aver purificato la reazione utilizzando una colonna ZY IMO.
Eluire la libreria a singola lettura con sei microlitri di tampone EB, seguiti da una seconda diluizione con cinque microlitri di EB. Il DNA con adattatori ligati, per entrambe le librerie, è ora pronto per la selezione dimensionale. La procedura di selezione dimensionale del DNA con adattatori ligati viene eseguita utilizzando un 2% Cyber Safe EE di In Vitrogen; per iniziare questa procedura, eseguire il programma zero in pre-corso per due minuti.
Dopo la pre-correazione, caricare 10 microlitri del campione uno KB plus ladder e dei campioni 2D NA. Riempire le corsie vuote con 10 microlitri di acqua ed eseguire il programma. Un egel 2% per 28 minuti.
Al termine della corsa, selezionare le bande di gel corrispondenti a 200-300 paia di basi utilizzando una lama fresca. È stato valutato il numero di geni identificati dalle diverse librerie, e questa tabella mostra informazioni sui numeri dei cluster. Geni identificati, tasso di errore e percentuale di allineamento delle librerie a lettura singola e a estremità accoppiate, sia per le librerie a lettura singola che a estremità accoppiate.
Le librerie T seven LA da 10 nanogrammi hanno identificato quasi lo stesso numero di geni delle librerie UN amplificate da 10 microgrammi con un valore di TPM pari o superiore a 10. Nel caso delle librerie a lettura singola, la libreria T seven LA da 10 nanogrammi ha identificato il 100% degli 8.500 geni rilevati dalla libreria amplificata UN da 10 microgrammi per le librerie paradigmatiche. La libreria T seven LA da 10 nanogrammi ha identificato l'86% dei geni individuati dalla libreria UN da 10 microgrammi.
Le librerie preparate con meno di 10 nanogrammi non sono state in grado di identificare un numero altrettanto elevato di geni. Ad esempio, nel protocollo con lettura singola, la libreria T seven LA di un nanogrammo ha identificato solo circa il 50% dei geni rilevati dalla libreria min amp di 10 microgrammi. Pertanto, la quantità minima di RNA totale da utilizzare con il protocollo T seven LA dovrebbe essere limitata a 10 nanogrammi, in relazione al mapping di un gene housekeeping.
GA DH mostra che tutte le librerie T seven LA realizzate con almeno 10 nanogrammi di RNA iniziale hanno identificato tutti gli esoni, inclusi gli esoni estremi al capo cinque prime. La barra della scala a sinistra per le librerie a singola lettura indica un totale di 350 letture. La barra della scala al centro per le librerie DEN indica un totale di 5.000 letture.
Un confronto tra le librerie a lettura singola e a estremità accoppiate di 10 nanogrammi di T seven LA e le librerie min amp mostra un elevato grado di similarità. È stato ottenuto un coefficiente di correlazione di Spearman pari a 0,90 tra la libreria a lettura singola di 10 nanogrammi di T seven LA e la libreria min amp di 10 microgrammi, e una correlazione di 0,95 tra la libreria PEREN di 10 nanogrammi di T seven LA e la libreria min amp di 10 microgrammi. Inoltre, è stato effettuato un confronto tra le due librerie a lettura singola e PEREN realizzate a partire da 10 nanogrammi di RNA totale, e l'elevatissimo coefficiente di correlazione dimostra che entrambi i tipi di librerie ottenuti mediante il protocollo T seven LA producono una firma di espressione genica molto simile.
Infine, poiché queste librerie sono state preparate a partire da RNA di cellule staminali embrionali umane, sono stati ricercati specifici geni all'interno delle librerie. Quasi tutti questi geni sono stati identificati mediante le librerie ottenute da almeno 10 nanogrammi di RNA totale iniziale, confermando così il protocollo. Durante l'esecuzione di questo protocollo, è fondamentale maneggiare i campioni di RNA a basso peso molecolare con la massima cautela per prevenire il degrado.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare librerie Illumina, Mr.Aeq a lettura singola e Paradigm a partire da quantità molto ridotte di materiale iniziale.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per la preparazione di librerie di sequenziamento mRNA-Seq Illumina per l'analisi dell'espressione genica mediante amplificazione lineare di RNA T7. Il protocollo richiede soltanto 10 nanogrammi di RNA totale iniziale, consentendo la generazione di librerie altamente coerenti che rappresentano trascritti completi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Analisi dell'espressione genica
Sfondo
- I metodi tradizionali richiedono spesso quantità maggiori di RNA.
- Questo metodo consente l'analisi a partire da popolazioni cellulari limitate.
- È particolarmente utile per campioni ottenuti mediante tecniche come la microdissezione con laser.
- Le dimostrazioni visive sono fondamentali a causa della delicatezza delle operazioni di manipolazione dell'RNA.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la generazione di librerie di sequenziamento dell'mRNA a partire da piccole quantità di RNA.
- Facilitare il profilo dell'espressione genica da popolazioni cellulari difficili da ottenere.
- Fornire un metodo affidabile per i ricercatori che lavorano con campioni limitati.
Metodi Utilizzati
- Trascrizione inversa dell'RNA totale per produrre cDNA.
- Trascrizione in vitro per l'amplificazione dell'RNA.
- Fragmentazione casuale dell'RNA amplificato seguita dalla ligazione degli adattatori.
- Amplificazione mediante PCR per preparare le librerie al sequenziamento.
Risultati principali
- Il protocollo genera con successo librerie a partire da soli 10 nanogrammi di RNA.
- Consente la preparazione di librerie per sequenziamento a lettura singola e a estremità accoppiate (paired end).
- Efficacia dimostrata nel profilo dell'espressione genica a partire da popolazioni cellulari limitate.
- Le illustrazioni facilitano la comprensione delle fasi di manipolazione dell'RNA.
Conclusioni
- Questo metodo riduce in modo significativo la quantità di RNA necessaria per il sequenziamento.
- Apre nuove strade alla ricerca nell'analisi dell'espressione genica.
- I ricercatori possono ora esplorare nuove domande biologiche con campioni limitati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La preparazione di librerie mRNA-Seq con input ultra-basso permette il profilo del trascrittoma a partire da popolazioni cellulari rare o limitate, affrontando direttamente un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca precoce e traslazionale. La possibilità di generare librerie di alta qualità ad unica lettura e a lettura accoppiata a partire soltanto da 10 nanogrammi di RNA totale amplia l'accesso all'analisi dell'espressione genica per campioni precedentemente considerati inaffrontabili. Questa capacità migliora la fiducia predittiva e supporta decisioni di portafoglio basate sulla valutazione del rischio in punti critici di svolta della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente il profilo trascrittomico da popolazioni cellulari scarse o microdissezionate per la validazione funzionale di bersagli.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica catturando firme complete di espressione genica da materiali limitati.
- Facilita l'analisi dei percorsi molecolari e la verifica di ipotesi in sistemi rilevanti per la malattia con input minimo di campione.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce una preparazione standardizzata e riproducibile delle librerie per flussi di lavoro di sequenziamento a lettura singola e a estremità accoppiate.
- Fornisce misurazioni quantitative dell'abbondanza trascrizionale (TPM) adatte per analisi comparative tra diversi run.
- Consente lo sviluppo di saggi per tipi cellulari rari o campioni clinici limitati, riducendo al minimo i requisiti di input.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il profilo dell'espressione genica alla scoperta di biomarcatori traduzionali da fonti di campioni difficili.
- Mantiene la continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica, supportando trascrittomica a basso input.
- Riduce il rischio biologico nel progresso di candidati derivati da tessuti rari o eterogenei.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo l'analisi del trascrittoma da campioni in stadio precoce e limitati fino alla preparazione scalabile di librerie per il sequenziamento e l'analisi successivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione di ipotesi su target e il mappaggio di percorsi a partire da un input minimo.
- Screening: Fornisce librerie quantitative e riproducibili per saggi robusti di espressione genica.
- Analisi: Fornisce output normalizzati in TPM per il confronto tra campioni e tra diverse esecuzioni.
- Ricerca traslazionale: Estende il profilo trascrittomico a campioni clinici rari o microdissecati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro scalabile e a basso input, adattabile a diversi programmi di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella selezione delle target.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione delle librerie a partire da input ultra-bassi, migliorando la riproducibilità e la scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di proseguimento/cessazione espandendo l'accesso trascrittomico a campioni rari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento dei candidati in base a un adeguato bilanciamento del rischio, partendo da materiale limitato.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA e nella preparazione di librerie con quantità ridotte per prevenire il degrado del campione.
- Richiede l'accesso a piattaforme di sequenziamento Illumina e a infrastrutture analitiche compatibili.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per ottenere risultati riproducibili tra progetti.
- Adattabile a diverse fonti cellulari e tissutali, ma un input inferiore a 10 nanogrammi può ridurre la sensibilità nella rilevazione dei geni.
- Una normalizzazione accurata e un controllo di qualità rigoroso sono essenziali per confronti affidabili tra diversi run.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
2:02
Procedural Flow Chart
3:19
cDNA Synthesis
6:31
End Repair, Paired End Library
7:37
Adding 'A' Bases to the 3' End of the DNA Fragments
8:31
Adapter Ligation
10:32
Size Selection/Gel Purification
11:20
Evaluation of Single-Read and Paired-End Sequencing Libraries
14:18
Conclusion
