패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA ^{2 + 영상}

본 실험 절차의 전반적인 목적은 시냅스 전 양극세포 신경 말단에 위치한 미세 회로를 연구하기 위해 한천(agar)에 매립된 망막 절편을 준비하는 것입니다. 이를 위해 우선 암적응된 금붕어의 눈에서 망막을 적출하여 작은 직사각형 모양으로 절단합니다. 이후 망막 조각을 투명하고 융점이 낮은 한천 용액에 침지시킨 다음, 적절히 냉각된 절편 용액 내에서 응고시킵니다.

다음 단계는 진동 절단기를 사용하여 망막의 직사각형 조각이 포함된 고체 아가 블록을 절편하는 것입니다. 마지막 단계는 시각화, 식별 및 패치하는 것입니다. 양극 세포 신경 말단을 클램프하십시오.

최종적으로, 분무된 양극 세포 말단과 온전한 양극 세포 말단의 막 커패시턴스 측정을 통해 시냅스 전 칼슘 전류와 시냅스 물리적 엑소사이토시스 결과를 보여줍니다. 안녕하세요, 제 이름은 Han Kim입니다. 저는 Burham Institute의 PCO 실험실 박사후 연구원입니다.

오늘은 금어의 냉각 안면 망막의 AGA 임베디드 슬라이스 제작법을 소개하고, 단일 파이프라인에서의 패치 클램프 커패시턴스 측정을 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 스프링 가위를 사용하여 눈 앞쪽을 고르게 절개함으로써 금어의 각 눈을 반구형으로 분리합니다. 그런 다음, 칼슘이 포함되지 않은 냉각 슬라이스 용액에 안구 컵을 넣습니다.

필요한 경우, 핀셋을 사용하여 수정체를 제거합니다. 다음으로, 45도 각도 팁 미세 핀셋으로 안구 컵에서 망막을 박리하여 망막에 부착된 색소 상피를 제거합니다. 그 후, 미세 핀셋 또는 스프링 가위로 시신경을 절단합니다.

그 다음, 변형된 파스퇴르 피펫(pasta pipette) 또는 대용량 팁 전송 피펫을 사용하여 흡입합니다. 망막을 분리하기 위해 망막에 붙어 있는 나머지 색소 상피를 조심스럽게 제거합니다. 세척된 건강한 망막의 표면은 매끄럽게 보여야 합니다.

그 다음, 분리된 망막을 상온에서 약 0.03%의 IDE로 15~30분 동안 처리합니다. 유리체를 제거할 때, 이 과정은 낮은 조도에서 수행해야 함에 유의하십시오. 다음 단계에서는 면도날을 사용하여 곡선형 가장자리를 제거함으로써, 망막의 전 층이 포함된 약 2x2 mm 크기의 직사각형 망막 조각을 절단합니다.

그 다음 망막 조각을 한천 용액이 채워진 작은 용기에 옮기고, 액체 한천에 망막을 넣을 때 망막 주변의 용액 양을 최소화하십시오. 이어서 한천이 굳을 수 있도록 한천이 포함된 망막을 얼음처럼 차가운 슬라이스 용액에 직접 담급니다. 다음으로 직사각형 망막 조각이 포함된 굳은 한천 블록을 1 by 1 by 1 cm 크기의 정육면체로 자릅니다.

블록을 preco 슬라이스 챔버 내 슬라이싱 플레이트 표면에 접착합니다. 그런 다음, 얼음처럼 차가운 슬라이스 용액 속에서 블록을 200 to 250 microns 두께의 슬라이스로 절단합니다. 바이브라톰(vibratome)을 사용하여 총 5 to 10개의 슬라이스를 얻을 수 있으며, 이는 약 5 to 6시간 동안 생존 가능합니다.

그 후, 절편 중 하나를 기록 챔버로 옮깁니다. 나일론 실 그리드가 부착된 U자형 백금 프레임을 절편 위에 배치합니다. 카보젠을 포화시킨 기록 용액을 분당 1~2 mL의 속도로 절편에 지속적으로 관류시킵니다.

이 단계에서는 0.2 micron 필터 팁이 장착된 시린지를 사용하여 유리 패치 피펫의 뒤쪽에서 1~2cm 높이까지 내부 용액을 채웁니다. 그런 다음 팁 부분의 공기 방울을 제거합니다. 피펫을 홀더에 고정합니다.

피펫에 양압을 가한 상태에서 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 타겟 터미널 방향으로 이동시키며, 팁을 슬라이스 아래쪽으로 통과시켜 움직입니다. 팁과 함께 슬라이스가 끌려오지 않도록 피펫을 측면으로 쓸어내듯 이동시킵니다. 그 다음, 피펫 팁을 터미널 주변으로 움직여 막 표면을 세척합니다.

팁을 터미널 가장자리에 대고 아래로 눌러 딤플(dimple)을 만든 후 양압을 해제합니다. 기가옴 씰(giga ohm seal)이 즉시 형성되지 않으면 피펫에 약간의 음압을 가합니다. 기가옴 씰이 형성되면 EPC-9 패치 클램프 증폭기를 온셀(onsell) 기록 모드로 전환하고 유지 전위를 -60 또는 -70 mV로 변경합니다.

빠른 커패시턴스 보정(fast capacitance correction)을 적용하고 씰(seal)이 5~10 GΩ 사이에서 안정될 때까지 기다립니다. 그런 다음, 빠르고 부드러운 흡입으로 막을 파열시켜 전세포 기록(whole cell recording) 구성을 설정합니다.

주사기 대신 입 흡입(mouth suction)을 사용할 수도 있습니다. 원자화된 MB 터미널에 전세포 구성(whole cell configuration)이 완료되면, -70 mV에서 0 mV까지 200 millisecond 동안 단계적 탈분극을 가합니다. 이 탈분극 전후로 전압 클램프 모드에서 2 kHz 사인파가 인가된다는 점에 유의하십시오. 막 커패시턴스를 측정하기 위해, 이 탈분극 단계에서는 세슘 기반의 내부 용액을 사용하여 전압 의존성 L형 칼슘 채널의 개방으로 활성화되는 내향 칼슘 전류를 직접 측정할 수 있습니다.

이와 동시에, 막 표면적을 증가시키는 시냅스 소포의 칼슘 의존적 엑소시토시스(exocytosis)로 인해 발생하는 커패시턴스 도약(capacitance jump)을 모니터링할 수 있습니다. 온전한 MB 양극세포의 시냅스 말단에 피펫으로 패치를 형성할 경우, MB 양극세포의 갭 결합(gap junction) 커플링으로 인한 큰 누설 전류 때문에 뚜렷한 칼슘 전류가 관찰되지 않습니다. 이때 관찰되는 것은 거대한 외부 누설 유사 전류입니다.

하지만, 제시된 탈분극 단계 전후로 활성화된 고주파 정현파 자극을 통해 정전 용량 도약을 여전히 모니터링할 수 있습니다. 다음은 I-R-D-I-C의 예시와 M 양극 세포 말단의 이미지입니다. A와 B에서 보는 바와 같이 온전한 말단은 타원형으로 나타날 가능성이 높은 반면, C는 원형 또는 구형으로 보이는 파괴된 말단을 보여줍니다.

염색 충전법은 세포 말단을 분류하는 데에도 사용될 수 있습니다. 여기 D에서는 온전한 축삭을 가진 MBI 양극 세포 말단, e에서는 부분적으로 절단된 축삭, F에서는 완전히 제거된 축삭의 형광 이미지 예시를 보여줍니다. 이들의 말단은 파란색 화살표로 표시되어 있습니다. 여기서는 칼슘 이미징 신호의 엑소사이토시스와 억제성 피드백의 직접 측정 결과가 제시됩니다.

MB 양극 세포 말단에서, 전압 클램프 단계 탈분극에 의해 MB 말단 텔레리아(teleria) 내의 일시적인 칼슘 농도 상승이 활성화되었으며, 이에 해당하는 MB 텔레리아의 형광 이미지는 B에서 확인할 수 있습니다. 신경전달물질 방출의 단기 시냅스 억제 예시는 C에 나타나 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 망막을 키트 한천(agar)에 배치할 때 망막 주변의 용액 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 이는 한천 블록으로부터의 고정을 개선해 줍니다.