Name: Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Impara a preparare fette retiniche in agar per registrare patch-clamp da terminali nervosi bipolari presinaptici. Questo metodo consente di studiare le sinapsi a nastro e la dinamica del calcio nella retina di pesce rosso.

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Ringraziamo il Dr. Fred Rieke per la sua spiegazione del tipo di agar-embedded preparazione fetta della retina quando abbiamo iniziato con il protocollo nel nostro laboratorio. Ringraziamo anche Lori Vaskalis per l&#39;illustrazione del schematica panoramica e Drs. Veeramuthu Balakrishnan e Soyoun Cho per gli utili commenti sul testo e video. Questo lavoro è stato supportato da una NEI-NIH RO1 concessione, ed è stato anche parzialmente sostenuto da una ricerca Korea Foundation Grant finanziato dal governo coreano [KRF-2008-357-E00032].

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</ol>

Noi non abbiamo concorrenti interessi di rivelare.

Un passo importante e difficile nel nostro protocollo è il trasferimento del pezzo di retina nella soluzione di agar (protocollo 3.4). E &#39;necessario rimuovere con attenzione il vitreo e la soluzione fetta residua dal pezzo della retina e trasferirlo senza distorsioni o piegature. Per fare questo, usiamo una piccola spatola (21-401-25B, Fisherbrand) con una punta piegata a formare un angolo di 90 °, insieme con una pinza punta angolata (11251-35, Strumenti Scienza Fine), di posizionare la retina pezz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Bassa temperatura gelificante agar </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agarosio tipo VII-A </td></tr><tr><td> Patch pipetta </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B150F-4 </td><td> Pareti spesse (1,5 mm di diametro esterno) in vetro borosilicato </td></tr><tr><td> Estrattore verticale </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Impronte dentarie </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Primavera forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 ° angolato pinze punta fine </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> Lametta </td><td> Personna </td><td></td><td> Doppio taglio, puliti con etanolo al 70% e H 2 O </td></tr><tr><td> Tubo cilindrico </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338-1B </td><td> Polietilene fiale campione 2,5 ml </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome affettatrice </td><td> Leica </td><td> VT1000S o VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio verticale </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x acqua-immersion obiettivo </td><td> Olimpo </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0,90 </td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Telecamera di controllo </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;Monitor in bianco e nero </td></tr><tr><td> Siringa filtro </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0,2 micron </td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Sutter Instrument </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificatore lock-in </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 amplificatori hanno software di emulazione </td></tr><tr><td> Spinning microscopio laser confocale disco </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Imaging cellulare vivere dopo di patch clamp registrazione a cellula intera </td></tr><tr><td> Slidebook software </td><td> Intelligent Imaging Instruments (3i) </td><td></td><td> Imaging di acquisizione dati e analisi </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost scivolo </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Vetrino </td></tr><tr><td> Agenti anti-sbiadimento </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocale a scansione laser microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> Imaging del tessuto fisso </td></tr><tr><td> Spatola </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401-25B </td><td></td></tr><tr><td> Manuel verticale Affettatrice </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon verde 488 Bapta-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + colorante fluorescente sensibile </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 IDRAZIDE </td><td> Invitrogen </td><td> A-20501MP </td><td> Colorante fluorescente </td></tr></tbody></table>

patch-clamp misure di capacità e ca 2 + imaging terminazioni nervose della retina singola in fette

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Stimoli visivi vengono rilevati e inoltrato su una ampia gamma dinamica di intensità di luce e variazioni di frequenza dai neuroni specializzati nella retina dei vertebrati. Due classi di neuroni della retina, fotorecettori e cellule bipolari, ottenere questo risultato utilizzando zone attive nastro tipo, che consentono il rilascio dei neurotrasmettitori sostenuta e high-throughput per periodi di tempo lunghi. ON-cellula bipolare di tipo misto (Mb) terminali nella retina pesci rossi, che depolarizzare agli stimoli luminosi e ricevere asta mista e di ingresso dei fotorecettori cono, sono adatti per lo studio delle sinapsi, sia a causa delle loro grandi dimensioni nastro di tipo (~ 10-12 micron di diametro) e per le loro numerose connessioni laterali e reciproca sinaptica con dendriti delle cellule amacrine. Accesso diretto ai terminali Mb cellule bipolari a fette pesci rossi della retina con la patch-clamp consente la misurazione di Ca 2 + presinaptico correnti, variazioni di capacità della membrana, e reciproca inibizione di feedback sinaptica mediata dal GABA &lt;sub&gt; recettori GABA A e C espresso sui terminali. Presinaptico misure membrana capacità di esocitosi permettono di studiare a breve termine plasticità del rilascio di neurotrasmettitore eccitatorio 14,15. Inoltre, la plasticità a breve termine ea lungo termine del rilascio di neurotrasmettitore inibitorio da parte delle cellule amacrine possono anche essere indagato da registrazioni di inibizione reciproca di feedback che arrivano al terminal Mb 21. In brevi periodi di tempo (ad esempio ~ 10 s), GABAergici inibizione di feedback reciproco a partire da cellule amacrine subisce accoppiato impulsi depressione attraverso l&#39;esaurimento GABA piscina vescicola 11. La dinamica sinaptica di microcircuiti retina nello strato plessiforme interno della retina può quindi essere direttamente studiato. Il cervello-fetta tecnica è stata introdotta più di 40 anni fa ma è ancora molto utile per lo studio delle proprietà elettriche dei neuroni, sia a singola cellula soma, dendriti singolo o assone, e microcircuit livello sinaptico 19. Tessuti che sono troppo piccole per essere incollato direttamente sulla camera di taglio sono spesso incorporati in prima agar (o la collocazione in una carta da filtro) e poi a fette 20, 23, 18, ​​9. In questo video, ci avvaliamo di pre-embedding tecnica di agar con retina pesci rossi. Alcuni dei giganti terminali delle cellule bipolari nelle nostre fette di retina pesci rossi sono axotomized (assone-cut) durante la procedura di taglio. Questo ci permette di isolare singoli ingressi terminale nervoso presinaptico, perché la registrazione da terminali axotomized esclude i segnali dal soma-dendritiche vano. In alternativa, si può anche registrare da intatto Mb cellule bipolari, registrando dai terminali collegati a assoni che non sono stati tagliati durante la procedura di taglio. Nel complesso, l&#39;uso di questo protocollo sperimentale sarà di aiuto negli studi di fisiologia sinaptica della retina, l&#39;analisi funzionale microcircuito, e la trasmissione sinaptica di sinapsi nastro.

Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di agar-embedded fette della retina che sono adatti per elettrofisiologia e Ca2 + imaging. Questo metodo permette di studiare nastro di tipo sinapsi in microcircuiti della retina mediante diretta patch-clamp registrazioni dei singoli terminali nervosi presinaptici.

Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Gli stimoli visivi vengono rilevati e trasmessi attraverso un ampio intervallo dinamico di intensità luminose e variazioni di frequenza da parte di neuroni specializzati nei vertebrati...

Lo scopo generale di questa procedura è preparare sezioni retiniche incluse in agar per lo studio dei microcircuiti localizzati nei terminali nervosi presinaptici delle cellule bipolari. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando la retina da un occhio di pesce rosso adattato al buio e tagliando un piccolo pezzo rettangolare di questa retina. Il frammento retinico viene quindi immerso in una soluzione trasparente di agar a basso punto di fusione, che successivamente viene solidificata in una fresca soluzione per sezioni.Il passo successivo consiste nel tagliare il blocco solido di agar che contiene il pezzo rettangolare di retina utilizzando un vibratomo. L'ultimo passo è visualizzare, identificare e fare la registrazione. Clampare il terminale nervoso di una cellula bipolare.In definitiva, i risultati mostrano la corrente calcica pre-sinaptica e l'esocitosi fisica sinaptica con misurazioni della capacità della membrana da terminali di cellule bipolari atomizzati e integri. Ciao, mi chiamo Han Kim. Sono un ricercatore postdottorato nel PCO del laboratorio presso il Burham Institute.Oggi illustrerò la preparazione di sezioni incluse in AGA della retina fredda del viso e dimostrer

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Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

Qui si descrive una procedura per la generazione di dark-adattato fette della retina del mouse per le registrazioni elettrofisiologiche.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Questo video mostra una tecnica di patch-clamp su cellule intere per la registrazione elettrofisiologica da una retina di topo a montaggio piatto. Una sottile pipetta di vetro con un elettrodo viene utilizzata per avvicinare le cellule amacrine starburst (SAC) all'interno della retina. Dopo aver formato una guarnizione, viene applicata l'aspirazione per rompere la membrana e formare la configurazione patch-clamp a cella intera. Infine, il flusso di ioni attraverso i recettori sinaptici SAC...

Definizione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica da una retina di topo a montaggio piatto

Questo video mostra la procedura per mappare le connessioni sinaptiche fissando una fetta di cervello, posizionando pipette per ottenere configurazioni di cellule intere e stimolando i neuroni presinaptici a registrare le risposte postsinaptiche, chiarendo così la connettività neuronale.

Registrazione accoppiata con patch clamp delle connessioni neuronali in fette cerebrali acute

In questo articolo il video illustra il set-up, le procedure per applicare le patch corpi cellulari e come implementare le registrazioni dinamiche clamp da cellule gangliari in tutto il montaggio del mouse retine. Questa tecnica permette l'indagine del contributo preciso di input sinaptici eccitatori e inibitori, e la loro portata, il tempo di spiking neuronale.

Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

Questo protocollo dimostra come eseguire cellula intera registrazione patch clamp su neuroni della retina da una preparazione TV a montare.

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

Una volta rimosso dal corpo, tessuto neuronale è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, con conseguente eventuale degradazione del tessuto dopo 6 - 8 h. Utilizzando un metodo incubazione unica, che monitora e regola l'ambiente extracellulare del tessuto, vitalità del tessuto può essere significativamente prolungata per&gt; 24 h.

L&#39;incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l'indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.

Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate

Le protesi retiniche hanno la capacità di generare percezioni visive. Per far progredire lo sviluppo di nuove protesi, sono necessari metodi ex vivo per testare i dispositivi prima dell'impianto. Questo articolo fornisce un protocollo completo per studiare l'attività del calcio nello strato di cellule gangliari retiniche quando sottoposto a stimolazione elettrica.

Imaging del calcio nelle retine piatte stimolate elettricamente

L'elettrofisiologia dinamica del clamp può stabilire collegamenti causali tra i deficit di attivazione neuronale e la disfunzione dei canali ionici. Descriviamo i metodi e i protocolli di clamp dinamico nei neuroni cerebellari di Purkinje di topo, rilevando risorse utili e considerazioni tecniche. In uno studio rappresentativo, abbiamo aggiunto la conduttanza del sodio modellata ai neuroni Tsc1-/- di Purkinje per evitare l'attivazione ripetitiva.

Metodi di clamp dinamico per studiare l'eccitabilità neuronale compromessa associata all'autismo

Impara a preparare fette retiniche in agar per registrare patch-clamp da terminali nervosi bipolari presinaptici. Questo metodo consente di studiare le sinapsi a nastro e la dinamica del calcio nella retina di pesce rosso.

Patch-clamp Misure di capacità e Ca^{2 +} Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

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