Patch-clamp Misure di capacità e Ca ^{2 +} Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Lo scopo generale di questa procedura è quello di preparare fette di retina incluse in agar per lo studio dei microcircuiti situati nei terminali nervosi delle cellule bipolari presinaptiche. Ciò si ottiene prelevando prima la retina da un occhio di pesce rosso scuro adattato e tagliando un piccolo pezzo rettangolare di questa retina. Il pezzo di retina viene quindi immerso in una soluzione di agar trasparente e a basso punto di fusione, che viene poi solidificata in una bella soluzione a fette fredde.

Il passo successivo consiste nel tagliare il blocco di agar solido contenente il pezzo rettangolare di retina utilizzando un vibratore. Il passaggio finale consiste nel visualizzare, identificare e applicare patch. Bloccare un terminale nervoso di una cellula bipolare.

In definitiva, i risultati mostrano la corrente di calcio pre-sinaptica e l'esocitosi fisica sinaptica con misurazioni della capacità di membrana da terminali cellulari bipolari atomizzati e intatti. Ciao, mi chiamo Han Kim. Sono postdoc in PCO di laboratorio presso il Burham Institute.

Oggi presenterò la preparazione della fetta incorporata AGA della retina facciale fredda e dimostrerò la misurazione della capacità del patch clamp in una singola tubazione di. Per iniziare questa procedura, emetti ogni occhio di un pesce rosso tagliando uniformemente intorno alla parte anteriore dell'occhio con un paio di forbici a molla. Quindi mettere le conchiglie oculari in una soluzione di fette fredde senza calcio.

Se necessario, rimuovere la lente con una pinzetta. Quindi, rimuovere l'epitelio pigmentato attaccato alla retina staccando la retina dalla conchiglia oculare con un paio di pinze sottili con punta angolata di 45 gradi. Successivamente, taglia il nervo ottico con un paio di pinze sottili o forbici a molla.

Quindi applicare l'aspirazione con una pipetta per pasta modificata o una pipetta per il trasferimento di puntali grandi. Per rimuovere la retina, rimuovere delicatamente il resto dell'epitelio pigmentato attaccato alla retina. La superficie della retina pulita e sana dovrebbe apparire liscia.

Quindi trattare la retina isolata con circa lo 0,03% di IDE superiore per 15-30 minuti a temperatura ambiente. Per rimuovere l'umor vitreo, si noti che la procedura deve essere eseguita in condizioni di scarsa illuminazione. Nel passaggio successivo, taglia un pezzo rettangolare di retina di circa due per due millimetri, che contiene l'intero spessore della retina rimuovendo i bordi curvi con una lama di rasoio.

Quindi trasferisci il pezzo di retina in un piccolo contenitore riempito con soluzione di agar e cerca di ridurre al minimo la quantità di soluzione intorno alla retina mentre viene inserita nell'agar liquido. Successivamente immergere la retina con l'agar direttamente nella soluzione di fetta ghiacciata in modo da solidificare l'agar. Quindi, taglia il blocco di agar solido contenente il pezzo rettangolare di retina in un cubo di un centimetro uno per uno.

Incollare il blocco sulla superficie della piastra di affettatura nella camera di preco slice. Quindi affettare il blocco a fette con uno spessore compreso tra 200 e 250 micron nella soluzione di fette ghiacciate. Utilizzando un vibrato, si possono ottenere da cinque a 10 fette, che sono vitali per circa cinque o sei ore.

Successivamente, trasferire una delle fette nella camera di registrazione. Posiziona una cornice di platino a forma di U con una griglia di fili di nylon sopra la fetta. Perfondere la fetta continuamente alla velocità di uno o due millilitri al minuto con la soluzione di registrazione bollita con carbogeno.

In questa fase, utilizzare una siringa con un puntale filtrante da 0,2 micron per riempire la pipetta patch in vetro con soluzione interna a un livello di uno o due centimetri dal retro della pipetta. Quindi rimuovere le bolle d'aria dalla punta in seguito. Fissare la pipetta nel supporto.

Applicare una pressione positiva sulla pipetta e spostarla verso il terminale di destinazione utilizzando un micromanipolatore mentre si sposta il puntale verso il basso attraverso la fetta. Spostare la pipetta in una direzione di spazzamento laterale per assicurarsi che la fetta non venga tirata insieme al puntale. Quindi spostare la punta della pipetta attorno al terminale per pulire la superficie della membrana.

Spingere la punta verso il basso contro il bordo del terminale per creare una fossetta e rilasciare la pressione positiva. Se non si forma una guarnizione giga ohm, applicare immediatamente una leggera pressione negativa sulla pipetta. Una volta formato un sigillo di giga ohm, commutare l'amplificatore E PC nine patch clamp sulla modalità di registrazione onsell e modificare il potenziale di mantenimento a meno 60 o meno 70 millivolt.

Applicare la correzione rapida della capacità e attendere che la guarnizione si stabilizzi tra cinque e 10 giga ohm. Quindi rompere la membrana con un'aspirazione decisa e delicata. Per stabilire la configurazione di registrazione dell'intera cella.

Puoi anche usare l'aspirazione a bocca invece di una siringa. Dopo che l'intera configurazione della cella è stata stabilita su un terminale MB atomizzato, applicare una depolarizzazione a passi di 200 millisecondi da meno 70 a zero millivolt. Ricordare che un'onda sinusoidale di due kilohertz in modalità voltage clamp viene applicata prima e dopo questa depolarizzazione Per misurare la capacità della membrana, la depolarizzazione consente la misurazione diretta delle correnti di calcio verso l'interno attivate dall'apertura di canali del calcio di tipo L voltaggio-dipendenti con una soluzione interna a base di cesio.

Parallelamente, si è in grado di monitorare il salto di capacità causato dall'esocitosi calcio-dipendente delle vescicole sinaptiche, che aumenta la superficie della membrana. Se una cellula bipolare MB intatta viene patchata con la pipetta sul terminale sinaptico, non si osserveranno correnti di calcio distinguibili a causa delle grandi correnti di perdita dovute all'accoppiamento della giunzione gap nei diritti di do delle cellule bipolari MB. Ciò che si osserva è una grande perdita verso l'esterno simile alla corrente.

Tuttavia, si è ancora in grado di monitorare il salto di capacità con uno stimolo sinusoidale ad alta frequenza attivato prima e dopo il passo di depolarizzazione mostrato. Ecco gli esempi di I-R-D-I-C, immagini dei terminali delle celle bipolari M. È più probabile che i terminali intatti appaiano ellittici, come mostrato in A e B, mentre C mostra il terminale mizzato, che appare rotondo e circolare.

Il metodo di riempimento del colorante può essere utilizzato anche per classificare i terminali cellulari. Ecco gli esempi delle immagini a fluorescenza dei terminali cellulari bipolari MBI con un assone intatto in D, un assone parzialmente tagliato in e e un assone completamente rimosso in F. I loro teri sono indicati dalle frecce blu. Qui mostra le misurazioni dirette dei segnali di imaging del calcio, dell'esocitosi e del feedback inibitorio.

In un terminale cellulare bipolare MB, una concentrazione transitoria di calcio in aumento nella teleria di un terminale MB è stata attivata da una depolarizzazione del passo del morsetto di tensione in a la corrispondente immagine a fluorescenza della teleria MB può essere vista in B.Esempi di depressione sinaptica a breve termine del rilascio di neurotrasmettitore sono mostrati in C.Durante il tentativo di questa procedura, È importante ricordare di ridurre al minimo la quantità di soluzione intorno alla retina poiché viene inserita nel kit agar. Ciò migliorerà l'attaccamento del latinizzato dal blocco agar.