Personalizzazione di Aspergillus niger Morfologia attraverso l'aggiunta di talco micro particelle

Questo metodo genera e caratterizza le strutture morfologiche dipendenti dalle microparticelle di funghi filamentosi, aspergillus, Niger, per correlare la morfologia fungina con la produttività. Coltivare otto Niger con o senza microparticelle in un bioreattore da tre litri per 72 ore per calcolare la produttività specifica. Prelevare campioni in punti temporali definiti e determinare la biomassa, il peso secco e l'attività del veto alla fruttosasi.

Dopo 72 ore, esaminare la morfologia fungina mediante microscopia e caratterizzare mediante analisi di immagini digitali. Quindi combina i parametri rilevanti dell'analisi delle immagini con un numero di morfologia che è matematicamente correlato con la produttività specifica. In definitiva, questo metodo può generare con precisione e caratterizzare in modo completo la morfologia dell'aspergillus Niger per una migliore comprensione della morfogenesi dei microrganismi filamentosi.

L'Aspergillus Nigel è un importante cavallo da lavoro industriale nel campo delle biotecnologie da molti decenni. Una delle caratteristiche più intriganti e spesso incontrollabili di Aspers, Nigel e specie correlate è la complessa morfologia che va da densi pellet sferici a miceli viscosi a seconda delle condizioni di coltura. Il vantaggio principale della nostra procedura è che, attraverso l'aggiunta di microparticelle, siamo ora in grado di personalizzare la morfologia fungina in modo specifico per le esigenze del processo.

Finora, nessun altro metodo è stato descritto per una tale personalizzazione della morfologia fungina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla coltivazione di microrganismi filamentosi. Perché per l'applicazione industriale, è fondamentale controllare la morfologia fungina e anche distinguere tra una morfologia fungina ben produttiva e una scarsa produzione.

Il nostro protocollo fornisce i mezzi per la personalizzazione e la caratterizzazione desiderabile della morfologia fungina. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla morfologia dell'aspergillus Nigel, può essere applicato anche ad altri microrganismi filamentosi come i ceppi di penicillium o strepto. Impostare quattro bioreattori per colture sterili come descritto nel protocollo allegato.

Testo basato sull'aggiunta di microparticelle, coltivare aspergillus Niger con diversa morfologia. Dopo 72 ore trasferire 50 millilitri. Campioni di brodo di coltura in un tubo Falcon.

I campioni di biomassa devono essere prelevati almeno in duplice copia dopo l'essiccazione nell'essiccato, pesare un filtro di cellulosa con le microbilance. Posizionare il filtro in un imbuto buchner con filtro a pompa per vuoto a getto d'acqua collegato, 10 millilitri di campione seguiti da 10 millilitri. L'acqua deionizzata per rimuovere i composti medi dalla biomassa raggrinzisce il filtro una volta nel mezzo.

Metterlo in una capsula di Petri di vetro e in un essiccatore a scomparti fino a quando il peso non sarà costanza. Trasferire il filtro in un essiccante e lasciarlo raffreddare. Quindi misura il peso.

Calcolare il peso secco della biomassa per litro calcolando il peso, la differenza dei filtri e la successiva divisione in base al volume del campione per i saggi enzimatici di glucosio ossidasi e perossidasi. Conservare i campioni su ghiaccio utilizzando un passaggio per siringa, 1,5 millilitri. Sospensione di coltura attraverso un filtro in acetato di cellulosa in una provetta di reazione Esegue il saggio SASE del beta frutto.

Garantiamo meticolosamente il successo con due campioni triplicati per la robustezza statistica. Per iniziare il test, aggiungere 20 microlitri di campione alla provetta per controllare la scissione del saccarosio in glucosio dipendente dal pH e dalla temperatura, utilizzare 20 microlitri di acqua deionizzata invece di 20 microlitri di campione. Inoltre, per ogni campione, preparare un controllo negativo per il glucosio residuo nel brodo di coltura mediante saggio.

20 microlitri di campione inattivato a caldo Per avviare la reazione dal saccarosio al glucosio, aggiungere 200 microlitri di soluzione di saccarosio molare da 1,65 molari. A pH compreso tra 5,4 e 20 microlitri, incubare tutte le provette di reazione in un blocco riscaldante a 40 gradi Celsius per 20 minuti. Interrompere la reazione riscaldando a 95 gradi Celsius per 10 minuti dopo aver raffreddato i tubi sul ghiaccio.

Centrifugare i campioni quando necessario, diluire i campioni per il test in modo che l'assorbimento misurato rientri nell'intervallo di valori calibrato. Ora, per ogni reazione, aggiungere due microlitri di campione in una piastra per microtitolazione. Eseguire bene le misurazioni del campione in triplicato.

Preparare anche una curva standard per 10 soluzioni di glucosio che vanno da un millimolare a 15 millimolari. Per la calibrazione del punto zero, utilizzare due microlitri di acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 200 microlitri della soluzione reagente a ciascuno.

Incubare bene per 10 minuti a temperatura ambiente. Misurare l'assorbimento a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre sunrise a 96 pozzetti e il software di recupero dati Magellan. Apri il grafico dei risultati con un foglio di calcolo e costruisci una linea di calibrazione della curva standard.

Calcola l'attività per ogni campione. Quindi calcolare l'attività della beta fruttotasi sottraendo i valori del controllo negativo appropriato dall'attività del campione. Infine, calcolare la produttività specifica fattorizzando il peso secco della biomassa e l'attività della beta fruttosasi.

Porre tre millilitri di sospensione di coltura in una capsula di Petri di plastica e diluire con una soluzione fisiologica di cloruro di sodio per separare le strutture morfologiche. La qualità delle immagini al microscopio è di eccezionale importanza. Per la successiva analisi dell'immagine, è necessario prestare attenzione durante la fase di diluizione.

Posiziona la capsula di Petri sotto un microscopio, dotato di una fotocamera integrata. Acquisisci e salva circa 100 immagini di strutture morfologiche per campione, assicurandoti che almeno un oggetto sia completamente raffigurato su ogni immagine. Continuare allo stesso modo con le piastre contenenti campioni di reattori diversi, acquisendo ogni volta nuove immagini.

Si noti la diversa forma morfologica di crescita dei campioni provenienti da diversi reattori coltivati con diverse quantità di polvere di talco aggiunta. Quindi aprire tutte le immagini dello stesso campione nel programma di elaborazione delle immagini. Immagine J.Utilizzando lo strumento di processo, crea binario.

Converti le immagini in bianco e nero per applicare il comando a un'intera serie di immagini. Usa un codice macro quindi, apri una delle immagini contenenti una barra di scala. Costruisci una linea retta attraverso la barra della scala per determinare il numero di pixel correlati a 2000 micron.

Seleziona lo strumento di analisi, imposta la misurazione e scegli i fattori di forma, i furetti, l'area del diametro e il perimetro. Utilizzare un codice macro per elaborare una serie di immagini. Ora apri il foglio di calcolo che rappresenta graficamente i risultati dei valori del fattore di forma.

Per ogni immagine, calcolare un numero di morfologia per ogni immagine con tutte le immagini di un campione. Calcola il valore medio per il numero di morfologia. Utilizza un programma di grafici e analisi dei dati per tracciare il numero di morfologia con la produttività specifica.

Determinare la relazione matematica mediante regressione matematica attraverso l'aggiunta di concentrazioni crescenti di microparticelle di talco. Otto Niger SKAN 10 15. La morfologia viene modificata da una vera morfologia a pellet a una morfologia dispersa o addirittura mia, poiché la morfologia del pellet prevista viene mostrata in condizioni standard.

È interessante notare che la morfologia miceliale è creata dall'integrazione di terreno con 10 grammi per litro di microparticelle di talco. Contemporaneamente, l'attività del Beto Fructo tase aumenta di circa tre volte: l'integrazione di uno o tre grammi per litro di polvere di talco porta a una morfologia dispersa con un'attività del fruttosio raddoppiata utilizzando parametri determinati dall'analisi automatica delle immagini. La morfologia dipendente dalle microparticelle può essere descritta in modo completo dalla morfologia.

Nota numerica, perfettamente rotondo in pellet lisci apparirà nelle immagini microscopiche come cerchi perfetti per tali particelle. Il numero di morfologia ha un valore che si avvicina a uno alle condizioni standard. La morfologia del reattore uno mostra un numero di morfologia intorno a 0,8.

La morfologia nel reattore quattro con 10 grammi per litro. La polvere di talco presenta un numero di morfologia intorno a 0,1. Il numero di morfologia per i reattori due e tre con concentrazioni di polvere di talco di uno e tre grammi per litro si trova tra questi estremi, dimostrando una morfologia dispersa.

Poiché la morfologia dipendente dalle microparticelle è strettamente correlata alla produttività dei citi del beta fruttosio, esiste una buona correlazione matematica tra morfologia, numero e produttività dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biotecnologia per esplorare ulteriormente la morfologia fungina e in particolare la sua relazione con la produttività. Seguendo questa procedura di creazione dettagliata di specifici tipi di incroci morfologici e fungini, è possibile esplorare altri aspetti importanti delle coltivazioni di microrganismi filamentosi.

La morfologia miceliale, ad esempio, è nota per essere molto più viscosa della morfologia del palato. Pertanto, la produttività complessiva del processo è compromessa da problemi e dalla purificazione del prodotto desiderato. Il nostro numero di morfologia aiuterà a stabilire modelli riguardanti la cultura, la prototeologia e ad approfondire la nostra comprensione della morfologia fungina in generale.