Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

L'obiettivo di questa metodologia è quello di gestire tessuti delicati di piante, oomiceti e funghi, per la loro osservazione ottimale al microscopio elettronico a scansione, o SEM. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande riguardanti praticamente qualsiasi fungo, microbo, mor-for-ità e come infettano, colonizzano e si attaccano al loro ospite. La tecnica della nostra metodologia migliorata è quella di fissare i campioni, per dove i mi-toh-min negli ecosistemi acquatici.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di visualizzare gli aspetti chiave dell'infezione utilizzando risorse costose e facilmente disponibili. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché i passaggi sono stati notevolmente modificati rispetto ai protocolli tradizionali. E i metodi pubblicati descrivono procedure generali senza dettagli.

Per iniziare, preparare il formolo e l'alcol acetico, o fissativo FAA, in una cappa attrezzata con un filtro aldeidico. A 85 parti di etanolo denaturato al 70%, 10 parti di soluzione di formaldeide al 60% e cinque parti di acido acetico glaciale. Sotto la cappa aspirante, versare il brodo di FAA in contenitori individuali.

Seleziona i meristemi floreali o vegetativi da fissare, assicurandoti che non vengano danneggiati da insetti, funghi o condizioni meteorologiche estreme. Tagliare i rami, rimuovendo il materiale indesiderato, e depositare immediatamente il campione nella soluzione FAA. Dopo 72-96 ore, versare il FAA in un contenitore di plastica per lo smaltimento chimico.

Lavare immediatamente i campioni tre volte con etanolo fresco al 70% per rimuovere eventuali residui di FAA. Il materiale fisso può essere immagazzinato a tempo indeterminato in etanolo al 70%. Sezionare i campioni in una capsula di Petri ricoperta di etanolo per evitare che i tessuti si secchino.

Usa una capsula di Petri con la base ricoperta da un silicone nero asciutto per vedere meglio il tessuto bianco a contrasto. Trasferire il fazzoletto in contenitori separati e poi immergerli in una capsula di Petri con etanolo al 70%. Mettete i coperchi sui contenitori e depositateli in una provetta da centrifuga di plastica con abbondante etanolo al 70%.

Trasferire il materiale sezionato attraverso una serie di etanolo in barattoli ermetici o provette da centrifuga. Lasciare i campioni in ciascuna soluzione per almeno un'ora. Quindi conservare i campioni per una notte in una soluzione di etanolo al 100%.

Dopo la serie di etanolo, trasferire i contenitori con il materiale al CPD. Annotare il numero di identificazione del campione sotto i supporti del campione SEM. Quindi coprire la parte superiore dei mozziconi con del nastro biadesivo.

Posizionare i tronchetti in un portacampioni. Sotto uno stereomicroscopio, aprire con cautela i contenitori che contengono i campioni giovani e delicati già essiccati nella CPD. Tenere presente che dopo il trattamento CPD, i campioni diventano più leggeri e sensibili all'elettrostatica.

Una volta estratti i campioni, chiudere i contenitori per evitare polvere o impurità. Metti i campioni sulla superficie adesiva degli stub pianificando in anticipo la posizione desiderata. Una volta che i campioni toccano la superficie, è molto difficile rimuoverli.

Non tentare di eseguire una dissezione importante a questo punto. Basta rimuovere il tessuto indesiderato che è facile da raccogliere. Per gli studi palinologici, sezionare le antere e aprirle per esporre il polline sui mozziconi.

Conservare i campioni protetti per una notte in un contenitore ermetico con gel di silice per evitare la reidratazione. Rivestire i campioni utilizzando lo spotter-coater e trasferirli al SEM come descritto nel protocollo di testo. Per testare la crescita differenziale delle spine delle cisti su piastre di Petri separate, mettere 0,5 millilitri della sospensione di cisti secondaria su superfici diverse.

Le superfici possono includere griglie di microscopia elettronica a trasmissione di carbonio, oro e rame. In precedenza, le squame di salmone e nasello sbiancate e i vetrini coprivetro. Incubare le cisti a 20 gradi Celsius per 70 minuti, il che favorisce l'attaccamento delle cisti alla superficie.

Rimuovere il liquido e aggiungere 0,5 millilitri di glutaraldeide al 2% su ciascuna superficie per la fissazione delle cisti. Conservare i campioni a temperatura ambiente sotto una cappa chimica per un'ora. Rimuovere la glutaraldeide e disidratare i campioni attraverso una serie di etanolo, aggiungendo cinque millilitri di ciascuna delle soluzioni di etanolo per 15 minuti.

Una volta nell'ultima soluzione di etanolo al 100%, il campione può essere conservato per un massimo di un mese in una capsula di Petri sigillata. Trasferire con cura le griglie e le scale dalla piastra di Petri a un supporto adatto per la CPD che mantenga i campioni separati l'uno dall'altro, come un supporto per griglia CPD o un supporto per campioni impilabili. Prendi la griglia e le squame con una pinzetta, tenendo presente che le cisti dovrebbero essere sempre rivolte verso l'alto sulle griglie.

Procedere all'essiccazione del materiale utilizzando il CPD prima di eseguire la preparazione del campione SEM degli ovociti per osservare il loro comportamento su diverse superfici, come descritto nel protocollo di testo. Avvolgere accuratamente ogni campione con carta da filtro formando buste etichettate a matita da 0,5 a un centimetro quadrato circa. Fare attenzione a non schiacciare i campioni.

Sigillare la carta da filtro con graffette. Quindi trasferire i campioni confezionati in una capsula di Petri e immergerli in 10 millilitri di acqua per reidratare il tessuto attorno alle spore. Mettere immediatamente i campioni in un forno a microonde.

Rimuovere il materiale una volta che l'acqua inizia a evaporare e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Quindi far passare il campione attraverso una serie di etanolo. A seconda della quantità di campione, utilizzare un becher o una provetta da centrifuga per questa fase.

Lasciare i campioni per 15 minuti in ogni soluzione. Quindi, inserire i campioni nel CPD come descritto nel protocollo di testo. Per montare le spore per l'osservazione SEM, aprire le buste.

Raccogli quindi le spore con la superficie appiccicosa dei mozziconi, facendo attenzione a non schiacciarle. Infine, eseguire il rivestimento in oro dei campioni e l'osservazione SEM come descritto nel protocollo di testo. Qui sono mostrati boccioli floreali di anacyclus clavatus trattati con tetrossido di osmio e preparati utilizzando il protocollo FAA CPD dimostrato in questo video.

Vengono mostrati anche campioni essiccati di phellorinia herculanea senza alcun trattamento, così come spore fungine trattate come dimostrato in questo video. Questa figura illustra lo sviluppo floreale precoce, medio e tardivo catturato sotto il SEM. Questa immagine è della vista dall'alto di un giovane reh-cim.

Qui è mostrato un bocciolo floreale durante la differenziazione del ginesio e un fiore all'antesi. Alcune strutture possono essere difficili da fissare e preservare per l'imaging sotto il SEM. Gli esempi includono quelli provenienti da ambienti umidi, così come quelli con ornamenti e quelli con indumenta.

Qui sono mostrati i modelli di crescita differenziali delle spine di Saprolegnia parasitica su scaglie di vetro, carbonio, rame, oro, nasello e salmone. Questo è un video che mostra il ciclo di vita asessuato di saprolegnia parasitica. Il ciclo di vita asessuato è importante per la dispersione di questi organismi nei loro ambienti acquatici o umidi.

Inoltre, gli zoo prodotti in questa fase rappresentano l'unità primaria di infezione nelle specie parassite dell'ordine saprolegnials. Sebbene la padronanza di questa tecnica possa essere eseguita in tre o cinque giorni, viene eseguita correttamente. Abbiamo utilizzato i soldi per completare le terapie SEM fornite per uso esterno in questo periodo presso il Giardino Botanico Reale di Madrid.

Dopo aver visto questo video, i ricercatori sapranno come raccogliere e fissare efficacemente materiale biologico delicato per l'osservazione SEM. La distruzione delle cellule, la distorsione degli organi o la cattiva conservazione dei campioni provenienti da ambienti umidi possono essere facilmente superate con questa procedura. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'osservazione attraverso il SEM è limitata allo studio ad alto ingrandimento delle superfici.

Anche prima del trattamento CPD, le guarnizioni devono essere mantenute al sicuro da cambiamenti bruschi e dal contatto diretto con l'aria. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fitologia per esplorare la struttura delle spore durante il processo infettivo, in particolare nelle specie di interesse per la pesca. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia a trasmissione o la MT per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio la struttura interna della composizione cellulare in un organo o cellule specifici o il polline.

Non dimenticare che la manipolazione della formalina e della glutaraldeide può essere estremamente pericolosa e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare sotto una cappa chimica e utilizzare maschere, camici da laboratorio e guanti.