Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Il protocollo illustra come generare in modo efficiente cellule staminali pluripotenti indotte umane a partire da quattro millilitri di sangue periferico. Al giorno zero, isolare ed espandere le cellule mononucleate dal campione di sangue periferico. Trasdurre le cellule primarie con il vettore di co-riprogrammazione staminale.

Al nono giorno, procedere a piastrare le cellule transdotte su fibroblasti embrionali murini inattivati e coltivare per circa tre settimane. Selezionare le colonie simili a HESC per l'espansione e la caratterizzazione. Risultati della colorazione mediante immunofluorescenza per l'espressione di marcatori di pluripotenza come SS EEA four, trial one 60 e trial 180 1.

Dimostrare la generazione efficiente di cellule staminali pluripotenti indotte umane. L'uso del vettore antivirale a cellule staminali per generare cellule staminali pluripotenti indotte umane offre diversi vantaggi rispetto ad altri metodi esistenti. Forse il più interessante è la semplicità complessiva dell'approccio, che richiede un facile accesso al tessuto donatore, e con questo intendo campioni facilmente ottenibili di sangue periferico.

Gli attributi più importanti di questo metodo sono l'efficienza della riprogrammazione e la qualità delle linee cellulari IPS ottenute. A dimostrare la procedura saranno Andrea January Summer, ricercatrice postdottorato nel mio laboratorio, e Sarah Rozelle, studentessa laureanda nel laboratorio di George Murphy. Tutto al giorno zero.

Prelevare quattro millilitri di sangue periferico in un tubo vacutainer per la preparazione cellulare contenente citrato di sodio. Invertire il tubo da otto a dieci volte entro due ore dal prelievo. Centrifugare il campione a 1.800 ×g per 30 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le cellule mononucleate.

Aspirare il plasma e pipettare il buffy coat, lo strato cellulare compreso tra la barriera gelatinosa e il plasma. Trasferire il buffy coat in un tubo conico sterile da 15 millilitri e portare il volume totale a 10 millilitri con PBS sterile. Capovolgere i tubi diverse volte e centrifugare a 300 ×g per 15 minuti.

Risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di PBS sterile, eseguire un conteggio cellulare, quindi trasferire da uno a due volte 10 alla sesta cellule in un tubo da centrifuga sterile da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in due millilitri di mezzo di espansione. Successivamente, seminare le cellule mononucleate isolate in una pozzetta di una piastra a 12 pozzetti e coltivare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Raccogliere le cellule rimanenti mediante centrifugazione e congelare aliquote di circa due volte 10 alla sesta cellule per provetta in FBS contenente 10% DMSO nei giorni tre e sei. Trasferire le cellule in un tubo conico sterile da 15 millilitri e lavare la pozzetta una volta con un millilitro di mezzo per cellule staminali QBSF 60. Per raccogliere le cellule aderenti.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in due millilitri di em. Quindi trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e reinserire la coltura nell'incubatore al giorno nove. Trasferire le cellule in un tubo conico sterile da 15 millilitri e lavare il pozzetto una volta con un millilitro di mezzo per cellule staminali QB SF 60 per raccogliere le cellule aderenti; centrifugare la coltura a 300 ×g per 10 minuti.

Successivamente, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di EM fresco contenente cinque microgrammi per millilitro di polibrene e lentivirus STEM per un MOI compreso tra 1 e 10. Trasferire quindi la sospensione in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e centrifugare a 2.250 giri al minuto per 90 minuti a 25 gradi Celsius. Aggiungere un ulteriore millilitro di EM fresco contenente cinque microgrammi per millilitro di polibrene per un volume totale di due millilitri di EM e posizionare la piastra nell'incubatrice per colture cellulari al giorno 10.

Dopo aver raccolto le cellule come mostrato in precedenza, sospendere il pellet cellulare in due millilitri di mezzo di coltura EM. Le cellule transdotte in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti al giorno 11 rivestono i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con gelatina 0,1%, quindi piastrare fibroblasti embrionali di topo inattivati a due volte 10 alla quinta cellule per pozzetto in mezzo meth. Preparare tre pozzetti per ogni infezione.

Il giorno successivo, raccogliere le cellule mononucleate transdotte come mostrato in precedenza. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di mezzo meth contenente BFGF. Acido ascorbico e fattori di crescita.

Ora aspirare il mezzo dalla piastra MES, un millilitro di MC per pozzetto di OFM. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo metilcellulosa completo e centrifugare la piastra a 500 giri al minuto a 25 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente coltivare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due giorni a partire dal giorno 14 in poi.

Ricambiare il mezzo ogni due giorni con 2,5 millilitri di mezzo meth contenente 10 nanogrammi per millilitro di BFGF e 50 microgrammi per millilitro di acido ascorbico, ma senza fattori di crescita. Intorno al giorno 20, una volta comparse piccole colonie, nutrire le cellule quotidianamente con due millilitri di mezzo per cellule staminali embrionali umane tra i giorni 30 e 40. Selezionare ogni colonia e trasferirla in pozzetti singoli di una piastra a 12 pozzetti precedentemente rivestita con maths inattivati, contenente un millilitro di mezzo HESC più inibitore di ROCK; nutrire le cellule ogni giorno.

In seguito, con un millilitro di mezzo HESC senza l'inibitore della chinasi ROCK, le cellule staminali pluripotenti derivate dai monociti umani sono ora pronte per la colorazione immunofluorescente dei marcatori di pluripotenza e anche per l'escissione della cassetta di riprogrammazione integrata. Durante questo protocollo, le cellule subiscono diverse modificazioni morfologiche, dai P BMCs alla generazione di iPSC umane. Al giorno zero, le cellule mononucleate isolate dal sangue periferico vengono coltivate in mezzo di espansione dopo nove giorni.

Si osservano grappoli d’uva simili ad ammassi di cellule, suggerendo che le cellule siano sane e in proliferazione prima della trasduzione. Intorno al giorno 21, una settimana dopo che le cellule sono state seminate su MAs, si formano colonie. Al giorno 30, le colonie di IPSC mostrano una tipica morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali umane.

Questa analisi di immunofluorescenza di IPC generati da PBMC mostra l'espressione dei marcatori di pluripotenza SSEA quattro, TRA-1-60 e TRA-1-81. Le iPSC risultano inoltre positive alla colorazione per la fosfatasi alcalina. Queste immagini illustrano i passaggi per generare iPSC privi di transgeni mediante trasfezione con un plasmide che esprime contemporaneamente la ricombinasi CRE e un gene di resistenza alla puromicina, come descritto da Summers et al. 2010; rispetto agli iPSC prima della trasfezione, si osserva la morte cellulare.

Dopo due giorni di selezione con puromicina, nuove colonie emergono dalle cellule resistenti intorno a 10 giorni dal transfezione. Analisi di Southern su sangue su colonie selezionate confermano l'escissione del transgene. Le corsie 1, 3, 5 e 7 mostrano la presenza del transgene in cloni di iPSC prima dell'escissione. Queste bande sono assenti nelle corsie 2, 4, 6 e 8 dopo l'escissione del transgene. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di generare in modo costante e robusto cellule iPSC umane di alta qualità, normali o specifiche per una malattia, a partire da piccole quantità di sangue periferico di qualsiasi individuo.

Questo approccio semplifica il processo di riprogrammazione delle cellule somatiche per renderlo ampiamente accessibile alla comunità delle cellule staminali. Allo stesso tempo, fornisce una base per la generazione di popolazioni più omogenee di linee cellulari staminali.