Da Voxels alla Conoscenza: Una guida pratica per la segmentazione del Complesso microscopia elettronica 3D-Data

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di segmentare le caratteristiche di interesse da complessi set di dati di microscopia elettronica 3D di cellule e tessuti per l'analisi della loro organizzazione 3D nazionale. Ciò si ottiene raccogliendo un set di dati costituito da singole immagini di microscopia elettronica. I dati 2D grezzi vengono quindi ricostruiti in un volume 3D e filtrati per ridurre il rumore e migliorare le caratteristiche di interesse Come secondo passo, le caratteristiche oggettive e soggettive dei dati vengono valutate per informare la migliore scelta del metodo per la segmentazione.

Successivamente, o astratto manuale, generazione di modelli, tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse. Per estrarre le caratteristiche di interesse viene eseguita la segmentazione automatizzata basata sulla densità o la segmentazione automatizzata su misura. I risultati mostrano modelli segmentati 3D finali di caratteristiche di interesse basati sul triage, sulle caratteristiche dell'immagine e sugli obiettivi personali per scegliere l'approccio di segmentazione ottimale.

Un confronto tra i diversi approcci per i diversi set di dati aiuterà a selezionare la corretta strategia di segmentazione. Dimostriamo diversi metodi per l'estrazione di caratteristiche di interesse. Data la complessità dei volumi di elettromicroscopia subcellulare, ogni approccio ha i suoi vantaggi e limiti.

In generale, le persone che non conoscono la segmentazione possono avere difficoltà perché identificare l'approccio migliore per diversi set di dati non è sempre chiaro. Insieme allo sfogo degli studenti laureati. Tai a dimostrare la procedura sarà BU come postdoc in auto.

Nel mio laboratorio, Amit Hassan, un ricercatore associato nel mio laboratorio e Joaquin Korea, un ingegnere di sistemi informatici nel mio laboratorio, la generazione manuale di modelli astratti viene utilizzata quando l'unico obiettivo è creare un modello geometrico per effettuare misurazioni geometriche. Per iniziare, importa il volume di dati in un programma adatto. Per la generazione manuale di modelli astratti, in questa dimostrazione viene utilizzato il software kymera.

Per prima cosa seleziona il file e apri per visualizzare la finestra di dialogo Apri file, vai alla posizione del file della mappa desiderata. Quindi, apri il visualizzatore del volume e seleziona lo stile di visualizzazione delle funzioni per visualizzare i dati con diversi stili di rendering. Regolare la soglia per la visualizzazione trascinando la barra verticale sull'istogramma nella finestra del visualizzatore del volume.

Naviga nel volume 3D per selezionare un'area di interesse per la segmentazione e ritaglia un sottovolume più piccolo, se necessario. Nella finestra di dialogo del visualizzatore di volumi, selezionare le caratteristiche, la selezione della sottoregione, fare clic e trascinare per creare una casella rettangolare attorno alla regione di interesse. Quindi, posiziona i marcatori lungo la funzione di interesse e collegali con i linker, se necessario, fino al completamento del modello.

Per ottenere ciò dalla barra dei menu del visualizzatore del volume, selezionare strumenti, finestra di dialogo del tracciatore del volume. Per aprire la finestra di dialogo del tracciatore del volume, selezionare file, nuovo marcatore. Mettere. Nella finestra di dialogo del tracciatore del volume, controllare il mouse, posizionare i marcatori sull'alta densità, posizionare i marcatori sui dati, i piani si spostano e i marcatori ize collegano il nuovo marcatore al marcatore selezionato e collegano i marcatori selezionati consecutivamente.

Quindi, nella finestra del tracciatore del volume, selezionare i marcatori di posizione utilizzando il pulsante destro del mouse e inserire i raggi per i marcatori e i collegamenti. Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse sui dati del volume per iniziare a posare i marcatori. I marcatori verranno collegati automaticamente nella finestra di dialogo del tracciatore del volume.

Seleziona il file, salva il marcatore corrente. Impostare quindi il marcatore di chiusura del file. Mettere. Aprire un nuovo set di marcatori per iniziare a creare un modello in una seconda funzione desiderata di interesse.

Utilizza colori contrastanti tra i set di pennarelli per enfatizzare le differenze nelle caratteristiche. Il tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse è un approccio che richiede molto tempo quando la densità di popolazione è relativamente piccola e quando l'accuratezza dell'estrazione delle caratteristiche è fondamentale. Per iniziare, importare i dati del volume in un programma con opzioni di tracciamento manuale. Software.

Con questa capacità generalmente offrire uno strumento di pennello di base. In questa dimostrazione, il software Amira viene utilizzato per tomo di grandi dimensioni. Seleziona i dati aperti e fai clic con il pulsante destro del mouse sul nome del file rec.

Quindi fare clic su formato, selezionare raw come dati su disco di grandi dimensioni. Va bene, e carica. Selezionare i parametri di dati grezzi appropriati dalle informazioni dell'intestazione e fare clic su OK.

Attiva/disattiva e salva con un nuovo nome di file. am file. Per la sequenza di immagini 3D, selezionare i dati aperti e selezionare il nome file tiff o il nome file dot mrmc.

Quindi attivare, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Salva come nome file am. Nella finestra del visualizzatore 3D, selezionare la sezione ortogonale per aprire il file immagine. Quindi utilizzare un cursore nella parte inferiore per navigare tra le sezioni per ritagliare i dati più grandi aperti come dati su disco di grandi dimensioni.

Alterna il nome del file nella finestra della piscina, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona l'accesso al reticolo. Immettere la dimensione della casella desiderata, spostare la casella nell'area desiderata e fare clic su Applica. Salvare il nuovo file.

Quindi, crea un file di segmentazione attivando o disattivando il file nella finestra del pool. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il campo dell'etichetta di etichettatura. Un nuovo file verrà creato e caricato automaticamente nella scheda dell'editor di segmentazione e nel pool di oggetti.

Utilizzare lo strumento pennello per tracciare il bordo della prima caratteristica di interesse. Modificare le dimensioni del pennello in base alle esigenze, quindi utilizzare il puntatore del mouse per tracciare il bordo della funzionalità di interesse. Riempi l'area tracciata con la scorciatoia F.Aggiungi la selezione facendo clic sul pulsante con il simbolo più.

Seguire la funzione di interesse attraverso tutte le sezioni e ripetere la segmentazione manuale del tracciato. Genera un rendering della superficie per la visualizzazione e l'analisi qualitativa o quantitativa di base secondo le istruzioni della guida utente del software nella scheda del pool di oggetti, attiva o disattiva le etichette del nome del file nella finestra del pool. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare surface gen.

Selezionare le proprietà della superficie desiderate e fare clic su Applica. Nel pool verrà creato un nuovo file name surf. Per visualizzare il volume segmentato, attivare o disattivare la navigazione del nome del file nella finestra del pool.

Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare la vista della superficie. Generare una superficie per la visualizzazione e l'analisi qualitativa come descritto nel protocollo di testo. La segmentazione automatizzata basata sulla densità viene utilizzata su set di dati con qualsiasi varietà di contrasto, nitidezza o affollamento per estrarre le densità di interesse per iniziare a importare i dati del volume in un programma dotato di bacchetta magica di soglia o altri strumenti basati sulla densità per la segmentazione automatica.

Come fatto nella tecnica di tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse, il software Amira viene utilizzato in questa dimostrazione per le caratteristiche senza margini chiaramente distinguibili. Utilizzare lo strumento soglia selezionando l'icona della soglia. Regolare un dispositivo di scorrimento per regolare la densità all'interno dell'intervallo desiderato, in modo che vengano mascherate solo le caratteristiche di interesse.

Fai clic sul pulsante di selezione, quindi aggiungi una selezione facendo clic sul pulsante con il simbolo più o con la scorciatoia. A generare una superficie per la visualizzazione e l'analisi qualitativa come descritto nel protocollo di testo. Tutto un quarto approccio.

La segmentazione automatizzata personalizzata può essere utilizzata per segmentare in modo efficiente set di dati di grandi dimensioni, ma richiede la conoscenza di programmi come Matlab. Si prega di fare riferimento al video supplementare sulla segmentazione personalizzata su misura per istruzioni dettagliate su questo metodo Sei set di dati di esempio sono stati segmentati in base a quattro approcci. La generazione manuale di modelli astratti, il tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse, la segmentazione automatizzata basata sulla densità e la segmentazione automatizzata personalizzata su misura La generazione manuale di modelli astratti è stata efficace per la resina.

La tomografia colorata incorporata delle stereociglia con lo scopo era quello di creare un modello per scopi quantitativi piuttosto che estrarre densità esatte per la tomografia colorata incorporata in resina di una parete cellulare vegetale. La segmentazione automatizzata basata sulla densità è stata più efficace per estrarre rapidamente la cellulosa attraverso molte fette. I metodi manuali richiedevano un maggiore sforzo solo su poche sezioni di dati.

La generazione manuale di modelli astratti ha prodotto la tripletta di microtubuli nella tomografia a stadi di kinocilium, mentre i due approcci automatizzati hanno estratto le densità più rapidamente e sono stati quindi preferiti a causa della forma dei mitocondri da fasci ionici focalizzati, microscopia elettronica a scansione di cellule epiteliali mammarie. Il tracciamento manuale ha fornito il risultato più pulito e la bassa densità di popolazione ha consentito una rapida segmentazione. Dato il grande volume che doveva essere segmentato, la segmentazione automatizzata su misura si è rivelata la più efficiente per segmentare i dati dei batteri al microscopio elettronico a scansione frontale a blocchi seriali.

Sebbene richieda molto tempo, l'unico metodo per estrarre la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato della membrana delle cellule epiteliali mammarie era il tracciato manuale. Lo sviluppo degli approcci di segmentazione apre la strada ai ricercatori in questo campo emergente della biologia cellulare strutturale per esplorare e determinare l'architettura cellulare 3D a livello di complessi macromolecolari, organelli e cellule in una grande varietà di colture cellulari, colture di organoidi o organismi modello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come scegliere e applicare l'approccio di segmentazione ottimale per il tuo set di dati.