Da Voxels alla Conoscenza: Una guida pratica per la segmentazione del Complesso microscopia elettronica 3D-Data

L'obiettivo generale del seguente esperimento è segmentare le caratteristiche di interesse da complessi set di dati tridimensionali ottenuti mediante microscopia elettronica di cellule e tessuti, al fine di analizzarne l'organizzazione 3D. Ciò si ottiene raccogliendo un set di dati costituito da singole immagini di microscopia elettronica. I dati grezzi in 2D vengono quindi ricostruiti in un volume 3D e filtrati per ridurre il rumore e potenziare le caratteristiche di interesse; in un secondo passaggio, si valutano le caratteristiche oggettive e soggettive dei dati per determinare la scelta ottimale del metodo di segmentazione.

Successivamente, si procede con l'astrazione manuale, la generazione del modello o il tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse. Vengono eseguiti una segmentazione automatizzata basata sulla densità o una segmentazione automatizzata personalizzata al fine di estrarre le caratteristiche di interesse. I risultati mostrano i modelli segmentati tridimensionali finali delle caratteristiche di interesse, basati sulla valutazione preliminare delle caratteristiche dell'immagine e sugli obiettivi personali per scegliere l'approccio di segmentazione ottimale.

Un confronto tra i diversi approcci per i vari set di dati aiuterà a selezionare la strategia di segmentazione corretta. Illustriamo diversi metodi per l'estrazione delle caratteristiche di interesse. Data la complessità dei volumi di microscopia elettronica subcellulare, ciascun approccio presenta vantaggi e limiti specifici.

Generalmente, le persone nuove alla segmentazione potrebbero incontrare difficoltà poiché non è sempre chiaro come identificare l'approccio migliore per diversi insiemi di dati. Insieme allo sfogo degli studenti universitari. Tai, che mostrerà la procedura, sarà BU come ricercatore postdottorato.

Nel mio laboratorio, Amit Hassan, un ricercatore associato nel mio laboratorio, e Joaquin Korea, un ingegnere informatico nel mio laboratorio, il modello astratto manuale viene utilizzato quando l'unico obiettivo è creare un modello geometrico al fine di effettuare misurazioni geometriche. Per iniziare, importare il volume di dati in un programma adeguato. Per la generazione del modello astratto manuale, nel presente dimostrativo si utilizza il software Kymera.

Selezionare innanzitutto il file e aprirlo per visualizzare la finestra di dialogo di apertura file, quindi individuare la posizione del file della mappa desiderata. Successivamente, aprire il visualizzatore di volumi e selezionare lo stile di visualizzazione delle caratteristiche per mostrare i dati con diversi stili di rendering. Regolare la soglia di visualizzazione spostando la barra verticale nell'istogramma presente nella finestra del visualizzatore di volumi.

Esplorare il volume 3D per selezionare un'area di interesse per la segmentazione e ritagliare un sotto-volume più piccolo, se necessario. Nella finestra di dialogo del visualizzatore di volumi, selezionare le caratteristiche, la selezione della sottoregione, quindi fare clic e trascinare per creare un riquadro rettangolare attorno alla regione di interesse. Successivamente, posizionare dei marcatori lungo la caratteristica di interesse e collegarli con dei connettori dove appropriato, fino al completamento del modello.

Per ottenere questo dalla barra dei menu del visualizzatore di volumi, selezionare strumenti, finestra di dialogo tracciamento volume. Per aprire la finestra di dialogo tracciamento volume, selezionare file, nuovo set di marcatori. Nella finestra di dialogo tracciamento volume, selezionare mouse, posizionare marcatori su alta densità, posizionare marcatori sui dati, spostare i piani e ridimensionare i marcatori, collegare un nuovo marcatore al marcatore selezionato e collegare consecutivamente i marcatori selezionati.

Quindi nella finestra del tracciamento del volume, selezionare i marcatori utilizzando il tasto destro del mouse e inserire i raggi per i marcatori e i collegamenti. Successivamente, fare clic con il tasto destro sui dati volumetrici per iniziare a posizionare i marcatori. I marcatori verranno collegati automaticamente nella finestra di dialogo del tracciamento del volume.

Selezionare il file, salvare il marcatore corrente. Impostare quindi il marcatore di chiusura del file. Aprire un nuovo insieme di marcatori per iniziare a costruire un modello su una seconda caratteristica di interesse desiderata.

Utilizzare colori contrastanti tra i set di marcatori per evidenziare le differenze nelle caratteristiche. Il tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse è un approccio che richiede tempo, utilizzato quando la densità della popolazione è relativamente bassa e quando l'accuratezza nell'estrazione delle caratteristiche è fondamentale. Per iniziare, importare i dati volumetrici in un programma dotato di opzioni di tracciamento manuale. Software.

Questa funzionalità offre in genere uno strumento base per pennello. In questa dimostrazione, il software Amira viene utilizzato per tomogrammi di grandi dimensioni. Selezionare apri dati e fare clic con il tasto destro sul nome del file rec.

Quindi fare clic su formato, selezionare i dati grezzi come dati del disco grande. Okay, e carica. Selezionare i parametri dei dati grezzi appropriati dalle informazioni dell'intestazione e fare clic su okay.

Attivare e salvare con un nuovo nome file. file am. Per una sequenza di immagini 3D, selezionare apri dati e scegliere il nome file tiff o il nome file dot mrmc.

Quindi attivare, fare clic con il tasto destro e selezionare "Salva con nome" come file am. Nella finestra del visualizzatore 3D, selezionare "Ortho slice" per aprire il file immagine. Successivamente, utilizzare il cursore nella parte inferiore per scorrere tra le sezioni e ritagliare i dati più grandi aperti come dati su disco di grandi dimensioni.

Attiva il nome del file nella finestra del pool, clicca con il tasto destro e seleziona l'accesso al reticolo. Inserisci la dimensione desiderata della casella, sposta la casella nell'area desiderata e clicca su applica. Salva il nuovo file.

Successivamente, crea un file di segmentazione attivando il file nella finestra del pool. Quindi, fai clic con il tasto destro e seleziona il campo etichetta di annotazione. Un nuovo file verrà creato e caricato automaticamente nella scheda dell'editor di segmentazione e anche nel pool di oggetti.

Utilizzare lo strumento pennello per tracciare il bordo della prima caratteristica di interesse. Modificare la dimensione del pennello secondo necessità, quindi utilizzare il puntatore del mouse per delineare il bordo della caratteristica di interesse. Riempire l'area tracciata con la scorciatoia da tastiera F. Aggiungere la selezione cliccando sul pulsante con il simbolo più.

Seguire la caratteristica di interesse attraverso tutte le sezioni e ripetere il processo di segmentazione manuale per tracciamento. Generare una rappresentazione superficiale per la visualizzazione e per analisi qualitative o quantitative di base seguendo le istruzioni del manuale utente del software nella scheda del pool di oggetti; attivare le etichette dei nomi dei file am nella finestra del pool. Quindi fare clic con il tasto destro e selezionare la generazione della superficie.

Selezionare le proprietà superficiali desiderate e fare clic su applica. Un nuovo file denominato surf verrà creato nel pool. Per visualizzare il volume segmentato, attivare il file denominato surf nella finestra del pool.

Quindi fare clic con il tasto destro e selezionare la visualizzazione della superficie. Generare una superficie per la visualizzazione e l'analisi qualitativa come descritto nel protocollo testuale. La segmentazione automatica basata sulla densità viene utilizzata su set di dati con qualsiasi tipo di contrasto, nitidezza o affollamento, al fine di isolare le densità di interesse per iniziare l'importazione dei dati volumetrici in un programma dotato di strumento bacchetta magica con soglia o altri strumenti basati sulla densità per la segmentazione automatica.

Come fatto nella tecnica di tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse, nel presente dimostrativo si utilizza il software Amira per le caratteristiche prive di margini chiaramente distinguibili. Utilizzare lo strumento di soglia selezionando l'icona di soglia. Regolare un cursore per modificare la densità all'interno dell'intervallo desiderato, in modo che vengano mascherate soltanto le caratteristiche di interesse.

Fare clic sul pulsante di selezione, quindi aggiungere una selezione premendo il pulsante con il simbolo più o utilizzando la scorciatoia. Generare una superficie per la visualizzazione e l'analisi qualitativa come descritto nel protocollo del testo. Tutti un quarto approccio.

La segmentazione automatizzata su misura può essere utilizzata per segmentare in modo efficiente grandi set di dati, ma richiede conoscenze in programmi come matlab. Si rimanda al video supplementare sulla segmentazione su misura per istruzioni dettagliate su questo metodo. Sei set di dati di esempio sono stati segmentati mediante quattro approcci: generazione manuale del modello astratto, tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse, segmentazione automatizzata basata sulla densità e segmentazione automatizzata su misura. La generazione manuale del modello astratto si è rivelata efficace per la resina.

La tomografia inclusa colorata delle stereocilia aveva lo scopo di creare un modello per finalità quantitative piuttosto che estrarre densità esatte per la tomografia inclusa colorata della parete cellulare vegetale. La segmentazione automatizzata basata sulla densità si è rivelata la più efficace per estrarre rapidamente la cellulosa attraverso numerose sezioni. I metodi manuali hanno richiesto maggiore impegno, limitatamente a poche sezioni di dati.

La generazione manuale del modello astratto ha prodotto il tripletto di microtubuli nella tomografia allo stadio di cinocilio, mentre i due approcci automatizzati hanno estratto le densità più rapidamente ed erano quindi preferiti a causa della forma dei mitocondri ottenuta con fasci focalizzati di ioni, microscopia elettronica a scansione di cellule epiteliali del seno. Il tracciamento manuale ha fornito il risultato più pulito e la bassa densità di popolazione ha permesso una segmentazione rapida. Considerando il grande volume da segmentare, la segmentazione automatizzata personalizzata si è rivelata la più efficiente per segmentare i dati batterici di microscopia elettronica a scansione di sezioni seriali.

Sebbene richieda molto tempo, l'unico metodo per estrarre il fascio ionico focalizzato della microscopia elettronica a scansione della membrana della cellula epiteliale del seno era il tracciamento manuale. Lo sviluppo di approcci di segmentazione apre la strada ai ricercatori in questo campo emergente della biologia cellulare strutturale per esplorare e determinare l'architettura tridimensionale della cellula a livello di complessi macromolecolari, organelli e cellule in una vasta gamma di colture cellulari, colture di organoidi o organismi modello. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come scegliere e applicare l'approccio di segmentazione ottimale per il proprio set di dati.