Correlativo confocale e 3D microscopia elettronica di una cellula sensoriale specifico

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di documentare l'ultrastruttura completa di una specifica cellula sensoriale intestinale sparsa tra altre cellule epiteliali nel tessuto intestinale nativo. Ciò si ottiene ottenendo prima un segmento di tessuto di 300 x 50 micron dall'intestino. Successivamente si ottengono stack ottici Z del segmento Utilizzando la microscopia confocale.

Quindi i dati confocali fungono da guida per elaborare e visualizzare il tessuto utilizzando la microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali o SBEM. Infine, i dati SBEM vengono segmentati per rendere in 3D l'ultra struttura di una specifica cellula del sensore intestinale. In definitiva, microscopia confocale correlativa e scansione facciale a blocchi seriali.

La microscopia elettronica viene utilizzata per mostrare una cellula specifica nel suo tessuto nativo e rivelare la sua ultra struttura in 3D. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, come le specifiche interazioni cellula-cellula che non potrebbero essere visualizzate altrimenti a livello di microscopia ottica. Utilizzando questo metodo, abbiamo precedentemente riportato una relazione fisico-chimica nascosta tra le cellule endocraniche sensoriali e le ggl.

Dopo aver isolato il colon del topo, secondo il protocollo testuale, metterlo in un bel PBS freddo e mentre è immerso tagliare il tessuto aperto lungo il mesenario, trasferire il tessuto in alcune gocce di PBS su un foglio di cera dentale e utilizzando un bisturi imprecare circa sei piccoli segmenti di tessuto dal colon distale. Dopo aver preparato il 5% di aros a basso punto di fusione in PBS, utilizzarlo per incorporare i segmenti di tessuto in un piccolo contenitore di plastica come lo stampo criogenico Tissue Tech di dimensioni standard, montare le sezioni incorporate su un microtomo a lama vibrante e utilizzare PBS ghiacciato per riempire il vassoio tampone. Quindi tagliare strisce di tessuto da 300 micron a 0,8 di ampiezza e 0,04 millimetri al secondo.

Inserire le strisce di tessuto da 300 micron in aros e montarle su un microtono perpendicolarmente alla lama. Quindi tagliare le strisce di tessuto a uno spessore di 50 micron facendo riferimento al protocollo di testo per i dettagli prima di conservare i blocchi in PBS a quattro gradi Celsius. Dopo l'imaging dei blocchi di tessuto utilizzando la microscopia confocale secondo il protocollo di testo per infiltrare e incorporare sezioni di tessuto nella resina.

Rimuovere il fazzoletto dal PBS e utilizzare un tampone di copote molare 0,1 per risciacquarlo tre volte per cinque minuti ciascuna. Una volta che la resina è stata preparata e i tessuti sono stati colorati per la microscopia elettronica, secondo il protocollo di testo, utilizzarla per inserire blocchi di tessuto tra vetrini polimerizzati con un agente distaccante liquido dopo che i blocchi di tessuto sono stati incorporati, polimerizzare in piano i blocchi per altre 48 ore a 60 gradi Celsius. Quindi separare i vetrini per rilasciare i blocchi sotto un cannocchiale da dissezione, far corrispondere l'orientamento dei blocchi di tessuto incorporati nella resina con quello delle micrografie confocali.

Per facilitare l'identificazione delle regioni contenenti le celle di interesse, montare il blocco in piano su un perno contenente una resina epossidica conduttiva e asciugare per 30 minuti. Quindi stendere il blocco su una superficie e asciugare per una notte a 60 gradi Celsius il giorno successivo. Rivestire il blocco con un liquido all'argento colloidale.

Mantenere le sezioni di tessuto piatte per garantire l'affettatura del blocco ad angolo retto per facilitare la correlazione della faccia del blocco seriale e le micrografie confocali. Dopo aver eseguito la microscopia elettronica a scansione secondo il protocollo di testo, convertire le immagini SPEM da immagini grezze DM a tre formati a immagini TIFF a otto bit utilizzando un filtro di sfocatura gaussiana 0,8 nelle Fiji. Filtra le immagini TIFF.

Riduci il set di dati al 25% delle dimensioni originali e salvalo come stack TIFF per ridurre al minimo la quantità di memoria RAM necessaria per gestire il set di dati con l'allineamento dello stack lineare del plug-in Fiji con setaccio in modalità di traduzione. Allinea la pila di immagini SPEM e usa il plug-in di ritaglio 3D per ritagliarle. Per eseguire il rendering dei dati, utilizzare lo strumento superfici in modalità di disegno e l'opzione contorno in modalità di disegno di 50 millisecondi per segmentare e volumizzare manualmente la cella di interesse.

Traccia i contorni su ogni sezione della cella per un rendering più uniforme o ogni cinque sezioni per un rendering più veloce. Utilizzare lo strumento istantanea per esportare le immagini finali con una risoluzione di 300 DPI o superiore utilizzando il mouse P-Y-Y-G-F-P. Tutte le cellule enteroendocrine della parte distale dell'intestino tenue vengono identificate e processate per SBEM come mostrato qui.

Un segmento di tessuto selezionato è stato analizzato mediante microscopia confocale per ottenere immagini di Zack, che sono otticamente distanziate di un micron l'una dall'altra. L'ottimizzazione delle dimensioni dei blocchi di tessuto è fondamentale per la correlazione topografica tra i dati confocali e SBEM. Questa vista resa in volume di una cellula enteroendocrina nell'ileo del topo mostra un pod neuronale prominente esteso sotto le cellule epiteliali di circa 60 micron.

Correlando le pile Z confocali con un'immagine SBEM dell'intera faccia del blocco, la cellula di interesse viene identificata qui in un blocco dal colon distale del topo A-P-Y-Y-G-F-P. È importante mantenere l'orientamento del blocco il più piatto possibile per corrispondere alle sezioni ottiche nelle immagini SBEM. Una volta che la cellula è stata identificata, l'imaging SBEM viene eseguito con una risoluzione sufficientemente alta da identificare le cellule secretorie e altri organelli cellulari.

Questo video contiene un rendering in 3D della cellula enteroendocrina. Il set di dati contiene 643 immagini che coprono 45 micron della profondità del tessuto. La cellula contiene un neuro pod ricco di les secretori e microvilli.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come documentare l'intera ultra struttura di uno specifico intestino La cellula sensoriale è sparsa tra le altre cellule epiteliali nel tessuto intestinale nativo utilizzando la fluorescenza come guida per identificare la cellula o le cellule di interesse ed elaborare il tessuto per la microscopia elettronica a scansione di fase a blocchi seriali.