Name: Un preclinici Modello murino di metastasi epatiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Scopri un modello murino preclinico di metastasi epatiche mediante iniezione emisplenica di cellule tumorali pancreatiche. Questa tecnica consente di studiare la progressione metastatica e testare nuove terapie.

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KF e KO sono co primi autori insieme a KS Questo lavoro è stato supportato in parte dal AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Clinical Scientist Award (LZ), Viragh Fondazione e l&#39;Skip Viragh pancreas Cancer Center della Johns Hopkins (EMJ e LZ), il Pancreas Fondazione Nazionale (LZ), il Lefkofsky Family Foundation (LZ), il SPORE NCI in tumori gastrointestinali P50 CA062924 (EMJ, LZ), la Fondazione Lustgarten (LZ), e le sovvenzioni Sol Goldman pancreas Cancer Center (KS , BHE, LZ).

Tutti gli esperimenti sugli animali conformi alle linee guida della Cura e uso Comitato Animale dell&#39;Università Johns Hopkins, e gli animali sono stati mantenuti in conformità con le linee guida dell&#39;Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento del Laboratorio Care (AAALAC). La procedura chirurgica viene effettuata in condizioni sterili in una sala operatoria che subisce un minimo di quindici ricambi d&#39;aria all&#39;ora. Tutti gli strumenti sono sterilizzati in autoclave prima della procedura e ancora con etanolo al 70% tra ogni mouse durante la procedura. Tutti i topi non si prevede di sopravvivere alla procedura chirurgica sono eutanasia in CO 2 per 3 min seguita da dislocazione cervicale mentre ancora sotto anestesia. 1 Cella Preparazione <ol><li> Risospendere le cellule in coltura Panc02 in tampone fosfato salino a 2 x 10 7 cellule / ml, e tenere su ghiaccio. </li></ol> 2 Preparazione del mouse <ol><li> Somministrare Ketamine (100 mg / kg) miscelato con xilazina (10 mg / kg) per via intraperitoneale a 8-12 settimane di età C57BL / 6 topi femmina in dosi frazionate. </li><li> Verificare che la punta ritiro pizzico riflesso è abolito per assicurare che il mouse è completamente anestetizzato. </li><li> Somministrare ulteriori dosi di ketamina (100 mg / kg) mescolato con xilazina (10 mg / kg) in quanto necessario per anestetizzare completamente i topi. </li><li> Applicare Puralube Vet unguento per gli occhi dei topi per evitare l&#39;essiccazione, mentre i topi sono sotto anestesia. </li><li> Radere l&#39;area chirurgica dei topi per evitare la contaminazione della ferita. </li><li> Prep zona sottocostale sinistra della incisione con il 70% di etanolo e poi iodio. </li><li> Posizionare un telo chirurgico intorno all&#39;addome per mantenere la sterilità. </li></ol> 3. laparotomia <ol><li> Fare una incisione sottocostale sinistra in linea con l&#39;orecchio sinistro attraverso la pelle e attraverso il peritoneo con un bisturi. </li><li> Esprimere la milza attraverso l&#39;incisione mediante l&#39;applicazione simultanea p digitaleressione lungo gli aspetti craniali e caudali dell&#39;incisione. </li><li> Individuare i vasi sanguigni splenici all&#39;estremità inferiore della milza. </li><li> Dividere la milza mettendo due Horizon medie dimensioni clip Ligating nel centro della milza facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni splenici ai poli splenici. </li><li> Inserire il polo superiore della milza indietro nel peritoneo per evitare la contaminazione. </li></ol> 4. Tumore iniezione <ol><li> Redigere 150 ml di tampone fosfato in un 26 G x 5/8 &quot;siringa. </li><li> Redigere 100 ml di Panc02 (2 x10 6 cellule) nella stessa siringa mantenendo la siringa in posizione verticale in qualsiasi momento durante l&#39;iniezione. </li><li> Immergere l&#39;ago in una soluzione di etanolo al 70%. L&#39;ago è immerso in etanolo al 70% per garantire la sterilità. </li><li> Iniettare le cellule lentamente nel hemispleen esposto essendo che la siringa sia mantenuta in posizione verticale in ogni momento. Lo smusso della Syringe occorre rilevare in ogni momento attraverso la capsula splenica evitare iniettando le cellule sotto la milza. Un sbiancamento dei vasi sanguigni e milza deve essere osservato dopo l&#39;iniezione. </li><li> Elevare la milza e applicare uno medio Horizon fermaglio sotto la milza per occludere i vasi sanguigni splenici. </li><li> Applicare una piccola clip Horizon per l&#39;aspetto più distale del pancreas e dei vasi splenici. </li><li> Legare il pancreas e vasi splenici dal hemispleen tagliando sopra le clip Horizon. </li><li> Posizionare il mouse sul &#39;lato, e irrigare l&#39;incisione con acqua distillata. </li></ol> 5. addominale Chiusura e recupero dall&#39;anestesia <ol><li> Chiudere il peritoneo con un punto 4-0 in esecuzione. </li><li> Applicare 2-3 clip della pelle per chiudere l&#39;incisione cutanea. </li><li> Somministrare 0,1 mg / kg di buprenorfina o di 5-10 mg / kg per via sottocutanea Carprofen per alleviare il dolore post chirurgico. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra elettrica per recOvery fino mobile e il mouse dimostra modelli di respirazione regolare. Gli animali vengono restituiti solo alla compagnia di altri animali dopo riprendersi completamente dalla procedura chirurgica. </li></ol> 6. Necropsy Esame e raccolta del Fegato <ol><li> Tra 30 e 60 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico, i topi cominciano a mostrare sintomi clinici di metastasi e richiederanno l&#39;eutanasia. Segni di malattia metastatica che richiedono l&#39;eutanasia umano includono addome allargata e lo sviluppo di ascite. Euthanize topi per inalazione di CO 2. </li><li> Dopo l&#39;inalazione, effettuare dislocazione cervicale. </li><li> Dopo che l&#39;animale è stato determinato per essere non reattivo, fare un&#39;incisione attraverso il peritoneo per esporre l&#39;addome con le forbici. </li><li> Utilizzo di pinze e forbici, tagliare delicatamente il fegato fuori dell&#39;addome. </li><li> Mettere il fegato in OCT, e flash congelare con azoto liquido. Conservare il fegato a -80 ° C. In alternativa, il vivor può essere fissato in 16% formalina tamponata neutra a temperatura ambiente per 24 ore e incluso in paraffina. </li></ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Facts+%26+Figures%22">Cancer Facts & Figures</a>. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).</li>
<li>Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+pancreatic+adenocarcinoma%3A+insights+from+genetically+engineered+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer.</a> Cancer letters. 279, 1-7 (2009).</li>
<li>Rhim, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+dissemination+precede+pancreatic+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation.</a> Cell. 148, 349-361 (2012).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Corbett, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+chemotherapeutic+response+of+two+transplantable+ductal+adenocarcinomas+of+the+pancreas+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice.</a> Cancer research. 44, 717-726 (1984).</li>
<li>Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+depletion+of+regulatory+T+cells+allows+the+recruitment+of+mesothelin-specific+CD8+T+cells+to+the+antitumor+immune+response+against+a+mesothelin-expressing+mouse+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma.</a> Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+a+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-transduced+tumor+vaccine+and+systemic+interleukin-2+in+the+treatment+of+murine+colorectal+cancer+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+surgical+oncology%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases.</a> Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+antitumor+immune+responses+with+engineered+live-attenuated+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes.</a> Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+Listeria+monocytogenes+effectively+treats+hepatic+colorectal+cancer+metastases+and+is+strongly+enhanced+by+depletion+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells.</a> Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).</li>
<li>Olino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+antigen+expressing+Listeria+monocytogenes+induces+effective+primary+and+memory+T-cell+responses+against+hepatic+colorectal+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+surgical+oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases.</a> Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).</li>
<li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp53R172H+and+KrasG12D+cooperate+to+promote+chromosomal+instability+and+widely+metastatic+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.</a> Cancer cell. 7, 469-483 (2005).</li>
<li>Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+evaluation+in+high-frequency%2C+40+MHz+imaging%3A+a+comparative+study+of+four+vector+velocity+estimation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonics%22%5BJournal%5D)">Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods.</a> Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+23+phosphorylation-dependent+cell-surface+localization+of+annexin+A2+is+required+for+invasion+and+metastases+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer.</a> PloS one. 6, e19390(2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti rilevanti di interesse da dichiarare.

Questo modello murino preclinico del pancreas metastasi del cancro al fegato tramite una tecnica di iniezione hemispleen è il primo modello descritto che rispecchia molte delle condizioni cliniche e immunologiche dei pazienti con malattia metastatica al fegato. Questo modello offre diversi vantaggi rispetto ad altri modelli murini. In primo luogo, a differenza dei modelli transgenici di cancro al pancreas in cui solo il 30% dei topi sviluppano metastasi al fegato e la tempistica della formazione di metastasi è abbastanz...

Duttale del pancreas adenocarcinoma (PDA) è la quarta principale causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti 1. La sopravvivenza a cinque anni per i pazienti con PDA metastatico è 2-12% 1. Anche se la chemioterapia adiuvante e neoadiuvante per il cancro del pancreas è oggi più efficace che mai, rimane ancora un disperato bisogno di nuove terapie. Lo sviluppo di nuove terapie richiede modelli affidabili animali preclinici. Sebbene i modelli tumorali sottocutanei sono semplici da usare, svantaggi includono l&#39;incapacità di questi tumori a metastatizzare e imitare la progressione del tumore e microambienti visto in tumori umani. Modelli geneticamente modificati, come il topo geneticamente modificato contenente Kras e p53 knock-in mutazioni oncogene (il modello KPC) 2 e il modello KPC con un lignaggio tracciante YFP (il modello PKCY) 3 consentono lo studio dei tumori presenti in natura in immunocompetetopi NT. Inoltre, il microambiente tumorale è inalterata e assomiglia più da vicino visto che nella progressione tumorale umano. Purtroppo, i tempi di sviluppo del tumore è variabile all&#39;interno di questi modelli, che lo rende difficile studiare terapie sperimentali. Inoltre, retroincroci di questi topi richiede una notevole quantità di tempo e di impegno finanziario, che non è sempre fattibile. Infine, modelli murini di xenotrapianto PDA impiantati, esigono topi, che hanno modificato o microambienti tumorali assenti immunocompromessi. Di conseguenza, l&#39;efficacia delle terapie sperimentali dimostrate in questi modelli preclinici spesso non sono riproducibili in studi clinici umani 4. Questo modello murino hemisplenectomy utilizza cellule tumorali Panc02, che sono una, metilcolantrene indotta pancreas linea di cellule tumorali altamente cancerogeno derivato da C57BL / 6 topi 5, 6. Inoltre, altre linee cellulari PDA murine derivate dal microfono KPCe può essere utilizzato in questo modello. Schulick et al. Hanno già sviluppato una tecnica hemisplenectomy e creato un modello singenico topo delle metastasi del cancro al colon 7. Questo modello hemisplenectomy (Figura 1) offre costante e pari inoculazione del tumore nei topi immunocompetenti si presta alla ricerca di nuovi agenti terapeutici 7-10.

<table><tbody><tr><td>I terreni e i componenti</td><td></td><td></td> per colture cellulari <td>variano a seconda della linea cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 ml</td><td>Forbice operativa curva Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6835</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per microdissezione</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>Porta ago (normale)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td></td><td></td> 3-0 o 4-0 <td>per gentile concessione del dipartimento di chirurgia, Johns Hopkins</td></tr><tr><td>Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, piccolo, angolato</td><td>Teleflex</td><td>137085</td><td></td></tr><tr><td>Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medio, angolato</td><td>Teleflex</td><td>237115</td><td></td></tr><tr><td>Clip per legatura medie Weck Horizon</td><td>Teleflex</td><td>002200</td><td></td></tr><tr><td>Clip per legatura piccole Weck Horizon</td><td>Teleflex</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>Siringa, 1 cc, siringa da tb, punta antiscivolo da 3/8"</td> Siringa da <td>309625</td><td></td><td>Becton Dickinson</td></tr><tr><td>, 1 cc, siringa da tb, punta scorrevole da 5/8"</td><td>Becton Dickinson</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Autoclip Applier</td><td>Mikron</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>9 millimetri Autoclip</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Sunbeam</td><td>CAT93</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td>venduto da numerosi fornitori</td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>Hospira</td><td>22395DD</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr></tbody></table>

un preclinici modello murino di metastasi epatiche

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerosi modelli murini sono stati sviluppati per studiare tumori umani e far progredire la comprensione del trattamento del cancro e di sviluppo. Qui, un preclinico, modello murino di tumore pancreatico di metastasi epatiche tramite un&#39;iniezione hemispleen delle cellule tumorali pancreatiche murine singeniche è descritto. Questo modello riproduce molte delle condizioni cliniche in pazienti con malattia metastatica al fegato. Mice costantemente sviluppano metastasi nel fegato permettendo indagine del processo metastatico, testing terapia sperimentale, e la ricerca del tumore immunologia.

Cellule tumorali Panc02 iniettate nel hemispleen (Figura 1) metastasi epatiche in forma al 100% dei topi, mentre il polmone e metastasi peritoneali non vengono rispettate se la tecnica è eseguita correttamente. Questa tecnica è stata effettuata su oltre un centinaio di topi utilizzando cellule Panc02 in più, esperimenti indipendenti, e riproducibile, tutti i topi non trattati morire con metastasi epatiche tra i 30 e 60 giorni dopo la procedura hemisplenectomy (Figura 2). Per ottenere la...

Un preclinico, modello murino di metastasi epatiche effettuato tramite una tecnica di iniezione hemispleen.

Un preclinici Modello murino di metastasi epatiche

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un modello preclinico di metastasi epatiche che rispecchi il cancro del pancreas mediante la tecnica della semimilza. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando una sospensione monocellulare di cellule tumorali pan O2 coltivate. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'esporre e dividere la milza di un topo completamente anestetizzato.I passaggi successivi consistono nell'iniettare cellule tumorali in una singola emisplene e rimuovere l'emisplene iniettato. L'ultimo passaggio prevede la chiusura dell'addome e il recupero del topo dall'anestesia. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano differenze nel decorso della malattia metastatica monitorando la sopravvivenza, seguito da necroscopia epatica e ulteriori esami di imaging non invasivi.Queste tecniche possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro, come identificare i fattori chiave nel processo metastatico, testare nuovi agenti terapeutici e condurre ricerche di immunologia tumorale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro del pancreas poiché topi immunocompetenti subiscono un'

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