Morris water maze Test: Ottimizzazione per ceppo di topi e Ambiente di prova

L'obiettivo di questa procedura è identificare deficit cognitivi in un modello murino della malattia di Alzheimer mediante l'utilizzo di un protocollo del labirinto acquatico di Morris, adattato per l'uso con il ceppo con background 1 2 9 6 FBB. Ciò viene ottenuto innanzitutto abituando i topi al compito, per ridurre deficit di prestazione indotti dallo stress. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare il compito della piattaforma visiva, in cui una piattaforma viene sollevata di un pollice sopra il livello dell'acqua per valutare le funzioni visive e motorie.

Successivamente, vengono effettuate le prove con la piattaforma nascosta, in cui la piattaforma è immersa di cinque millimetri sotto la superficie dell'acqua. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare prove di tipo probe, in cui la piattaforma viene rimossa per valutare la memoria spaziale di riferimento e determinare il tipo di strategia di ricerca impiegata. In definitiva, questa procedura personalizzata di MAs in acqua consente la valutazione dell'apprendimento spaziale e della memoria in un modello murino comunemente utilizzato per la malattia di Alzheimer.

Generalmente, i principianti con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della necessità di ottimizzare le procedure di prova, come il numero di prove di addestramento e di prove a sonda utilizzate, in base alla linea genetica del topo e all'ambiente in cui i topi vengono testati. Questa parte della procedura abitua i topi all'ingresso e alla rimozione dal contenitore. Innanzitutto, posizionare la scatola a un'altezza comoda, riempirla con due litri di acqua a una temperatura di 21 gradi Celsius e a un livello di circa un centimetro.

Dopo aver portato i topi nella stanza dei test, rimuovere un soggetto dalla gabbia, verificarne l'identificazione e quindi contrassegnare la coda con un pennarello permanente non tossico per distinguerlo dai topi che non hanno ancora subito la procedura. Posizionare un topo nel becher di trasferimento per circa cinque secondi. Successivamente, versare delicatamente il topo dal becher nella vasca, cronometrando il tempo trascorso nel bacino per 20 secondi.

Trascorso il tempo, posizionare delicatamente una paletta davanti al topo senza inclinarla. Consentire al topo di entrare ed esplorare la paletta. Se necessario, incoraggiare il topo a salire sulla paletta facendola scivolare delicatamente sotto di esso mentre si solleva lentamente. Prestare attenzione a non spaventare i topi con la paletta.

Ripetere queste procedure per ogni topo nella gabbia una volta al giorno per 10 giorni. Dopo ogni animale, raccogliere le feci e la lettiera dal contenitore, utilizzando una rete, essendo il becher di trasferimento tra le gabbie. Eseguire l'addestramento visivo nei giorni di prova uno, due e tre con sei prove ogni giorno e circa 10 minuti tra una prova e l'altra.

Per prima cosa, configurare il software di monitoraggio delle prestazioni del mouse e creare i fogli di esecuzione seguendo le istruzioni riportate nella parte testuale del protocollo. Una volta configurato il software, preparare la stanza appendendo innanzitutto delle tende in modo da oscurare tutti i riferimenti spaziali. Successivamente, preparare la vasca riempiendola con acqua di rubinetto a 21 gradi Celsius.

Utilizzare un termometro per assicurarsi che la temperatura dell'acqua rimanga entro un grado rispetto a questa temperatura durante tutti i test. Posizionare la piattaforma, che ha una bandierina montata alta 13 centimetri e di dimensioni 4,5 per 4,5 centimetri con un carattere in grassetto a forma di S in rilievo, nel primo punto predeterminato della vasca in modo che si innalzi di circa un pollice sopra la superficie dell'acqua.

Ora prelevare il primo topo dalla gabbia. Verificare l'identificazione dell'animale, segnare la coda utilizzando un pennarello indelebile del colore corretto e posizionarlo in un bicchiere di trasferimento. Posizionare delicatamente il topo nella vasca.

Avviare il cronometro e assicurarsi che il software di tracciamento stia seguendo l'animale. Consentire al topo fino a due minuti per individuare la piattaforma. Una volta che il topo ha individuato la piattaforma, lasciarlo sulla piattaforma per 20 secondi.

Se l'animale non riesce a trovare la piattaforma entro il periodo di due minuti, prelevarlo delicatamente e posizionarlo sulla piattaforma per 20 secondi. Trascorsi 20 secondi sulla piattaforma, rimuovere il topo dalla piattaforma come fatto durante l'addestramento di ambientamento e collocarlo in una gabbia riscaldata foderata con carta assorbente, mantenuta calda a circa 31 gradi Celsius mediante una piastra riscaldante e una lampada a infrarossi per 30 secondi. Successivamente, trasferire il topo nella gabbia di attesa dotata soltanto di una piastra riscaldante, ma senza lampada a infrarossi, affinché si riprenda tra un tentativo e l'altro.

Dopo aver pulito la vasca dai detriti con una rete, ripetere questi passaggi per ogni topo del gruppo. Una volta completato ogni topo, nella prima prova, spostare la piattaforma alla seconda posizione predeterminata. Eseguire l'addestramento con piattaforma nascosta dal quarto al decimo giorno dopo aver appeso le tende.

Come in precedenza, posizionare strategicamente i segnali sulle tende. Assicurarsi che i segnali siano di grandi dimensioni e contengano colori contrastanti per una migliore visibilità, e che siano posizionati a una distanza e altezza tali da essere visibili ai topi dall'interno della vasca. Configurare il software secondo le istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo.

Quindi preparare la vasca riempiendola prima d'acqua in modo che la piattaforma si trovi a circa cinque millimetri sotto la superficie dell'acqua. Posizionare la piattaforma nel punto predeterminato. La posizione della piattaforma rimarrà la stessa per quasi tutti i test effettuati nei diversi giorni e prove.

È essenziale variare la posizione di partenza in modo che gli animali non sviluppino una strategia motoria non spaziale e indipendente dall'ippocampo. Per risolvere il labirinto, utilizzare una tempera bianca non tossica per rendere l'acqua opaca. Questo accorgimento garantisce che la superficie della piattaforma non sia visibile dal livello visivo dell'animale durante il nuoto.

Dopo aver identificato e contrassegnato i topi in precedenza, versare delicatamente il topo nel labirinto, orientando l'ENT verso il muro. Ogni topo verrà posizionato nello stesso punto di partenza per una prova unica. Al momento del rilascio iniziale del topo, avviare il cronometro e posizionarsi in un'area in cui il sperimentatore non sia facilmente visibile ai topi.

Una volta che l'animale raggiunge la piattaforma, lasciarlo rimanere sulla piattaforma per 15 secondi per permettergli di orientare la propria posizione spaziale all'interno della stanza. Se il topo non individua la piattaforma entro 60 secondi, prelevarlo delicatamente e posizionarlo sulla piattaforma. Dopo 15 secondi sulla piattaforma, rimuovere il topo dal labirinto e riportarlo nella gabbia riscaldata.

Dopo aver pulito il labirinto dai detriti, ripetere queste procedure per i topi rimanenti del gruppo. Pertanto, nei giorni di prova dal quattro al nove, effettuare quattro sessioni di addestramento con piattaforma nascosta al giorno, con un intervallo di circa 20 minuti tra ogni sessione. Eseguire le prove di ricerca prima dell'addestramento alla piattaforma nei giorni sei, sette e otto, e l'ultima prova di ricerca.

Al giorno 10, eseguire le prove di sonda in modo analogo all'addestramento con piattaforma nascosta, con la differenza che nel labirinto non è presente alcuna piattaforma. Rilasciare un topo da un punto di rilascio predeterminato e permettere al topo di nuotare nel labirinto per 60 secondi. Dopo la prova di sonda del giorno 10, non vengono effettuate ulteriori prove durante le sessioni di sonda. Utilizzare un software di tracciamento animale per registrare la lunghezza del percorso effettuato dall'animale, la percentuale di tempo trascorsa dall'animale in ciascun quadrante del labirinto e il numero di volte in cui l'animale nuota sopra l'area in cui precedentemente era posizionata la piattaforma.

Aprire la scheda della lista sperimentale e ottenere le misurazioni dalla scheda di analisi dati e dalla scheda del labirinto acquatico. Esportare direttamente in un foglio di calcolo Excel. Successivamente analizzare i dati seguendo le istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo.

41 topi TP 3 0 1 L contenenti il gene umano P 3 0 1 LTL e 46 controlli sono stati sottoposti a questo protocollo all'età di circa 6,5 mesi. Ciò corrisponde a tre mesi di espressione della proteina Tau P 3 0 1 L nei soggetti transgenici. Ogni gruppo comprendeva un numero approssimativamente uguale di maschi e femmine in termini di lunghezza del percorso.

La formazione con piattaforma invisibile non ha mostrato differenze tra i controlli e i topi TP 3 0 1 L. L'assenza di differenze indica che i controlli e i topi tau P 3 0 1 LM non differiscono per capacità visive o locomotorie, e che quindi i deficit di prestazione nei test con piattaforma nascosta possono essere attribuiti a compromissioni della memoria. Tuttavia, durante la formazione con piattaforma nascosta, i topi TP 3 0 1 LM hanno mostrato lunghezze di percorso significativamente maggiori in tutti i blocchi di addestramento.

Infine, i controlli hanno mostrato un miglioramento durante le quattro prove di sonda. Mentre i topi Tau P 3 0 1 L non riuscivano a controllare, i topi di controllo erano in grado di utilizzare una strategia spaziale per risolvere il compito e avevano imparato meglio a localizzare la piattaforma nella zona bersaglio. Quando si adatta questo protocollo per l'uso con altre linee di topi, è importante valutare la velocità di apprendimento dei controlli, identificare il numero di prove di addestramento necessarie e determinare quando deve essere inserita la prima prova di sonda.