Doppia Emulsione Generazione Utilizzando un Polidimetilsilossano (PDMS) coassiale flusso fuoco Dispositivo

L'obiettivo generale di questa procedura è costruire e testare un dispositivo microfluidico interamente in poli dimetil silossano che utilizza il focalizzamento del flusso coassiale per generare emulsioni doppie. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in chimica e biologia che richiedono schermature ad altissima produttività, come l'evoluzione diretta di enzimi e l'identificazione di fenotipi rari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la produzione rapida di generatori di emulsioni doppie mediante fabbricazione mediante litografia morbida, senza trattamenti superficiali specializzati.

Per iniziare, progettare le strutture microfluidiche per la fabbricazione a due strati. Utilizzando il software AutoCAD, far stampare i disegni su pellicola per circuiti stampati con una risoluzione di 10 micron, come descritto nella bibliografia indicata qui. Applicare da uno a due millilitri di SU 8 30 35 al centro di una piastrina di silicio pre-pulita con diametro di tre pollici, posizionarla su un spin coater e fissarla sul mandrino.

Centrifugare per 20 secondi a 500 giri/min, seguiti da 30 secondi a 2000 giri/min. Rimuovere il wafer e cuocerlo su una piastra a 135 gradi Celsius per 30 minuti. Lasciare raffreddare il wafer a temperatura ambiente prima di passare al passaggio successivo.

Ora esporre la wafer rivestita alla maschera del primo strato sotto una luce LED collimata per 90 secondi. Dopo l'esposizione, riposizionare la wafer sulla piastra riscaldata a 135 gradi Celsius per un minuto. Una volta raffreddata, applicare da uno a due millilitri di SUH 2050 al centro della wafer.

Rimettere la wafer sullo spin coater e centrifugare per 20 secondi a 500 giri al minuto. Successivamente, centrifugare per 30 secondi a 1.375 giri al minuto. Quando lo spin coater smette di ruotare, rimuovere la wafer e riposizionarla sulla piastra riscaldata a 135 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi riportare la wafer alla temperatura ambiente prima di passare al passaggio successivo. Allineare la maschera per il secondo strato sulla geometria definita nei passaggi precedenti ed esporre nuovamente la wafer rivestita alla luce UV per tre minuti; dopo l'esposizione, posizionare la wafer su una piastra riscaldata a 135 gradi Celsius per un minuto. Una volta raffreddata, sviluppare le maschere immergendo la wafer in un bagno agitato di propilene glicole monometil etere acetato.

Dopo 30 minuti nel bagno, rimuovere la wafer e lavarla in isopropanolo. Successivamente, cuocere la wafer sulla piastra a 135 gradi Celsius per un minuto. Raffreddare la wafer e quindi posizionare il master sviluppato in una capsula di Petri da 100 millimetri.

Preparare un lotto di PDMS combinando 50 grammi di base siliconica con cinque grammi di agente indurente in un bicchiere di plastica. Utilizzare uno strumento rotante dotato di bacchetta mescolatrice per mescolare i componenti, quindi sottoporre la miscela a degasaggio all'interno di un essiccatore per circa 30 minuti o fino a quando tutte le bolle d'aria sono state rimosse. Successivamente, versare il PDMS sul master fino a uno spessore di tre millimetri.

Quindi posizionare la piastra di Petri nel desiccante per un'ulteriore degasificazione. Una volta eliminate tutte le bolle, cuocere il dispositivo a 60 gradi Celsius per due ore. Tagliare il dispositivo in PDMS dallo stampo utilizzando un bisturi e posizionarlo su una superficie pulita con il lato del motivo rivolto verso l'alto.

Quindi tagliare il PDMS a metà con una lametta per separare i due lati del dispositivo sulla porzione contenente la geometria di gestione del fluido di 50 micrometri impressa dal master uno. Praticare gli ingressi e le uscite fluidiche con un punch per biopsie di 0,75 millimetri. Successivamente, posizionare i pezzi di PDMS con i lati strutturati rivolti verso l'alto all'interno di una camera al plasma.

Trattare il dispositivo con plasma di ossigeno a un millibar per 60 secondi in un pulitore a plasma da 300 watt. Successivamente, rimuovere i campioni e bagnare la superficie del pezzo di PDMS non indurito con una goccia di acqua deionizzata, da utilizzare come lubrificante temporaneo durante l’osservazione del dispositivo al microscopio stereoscopico. Unire le superfici trattate al plasma e far scivolare le stesse fino al raggiungimento di un bloccaggio meccanico.

Quando i telai recessi e i telai sporgenti si accoppiano, dopo l'assemblaggio posizionare il dispositivo in un forno a 60 gradi Celsius e cuocerlo per due giorni per evaporare l'acqua e completare l'adesione. Successivamente fissare il dispositivo assemblato su un vetrino utilizzando alcune gocce di PDMS non polimerizzato e cuocere il costrutto in un forno a 60 gradi Celsius per un'ora. Per polimerizzare il PDMS, posizionare il chip microfluidico sul piatto di un microscopio invertito abbinato a una fotocamera digitale in grado di raggiungere tempi di posa di almeno 100 microsecondi.

Successivamente, montare tre siringhe da 10 millilitri su pompe per siringhe e applicare un ago da 27 gauge a ciascuna di esse. Collegare circa 30 centimetri di tubo PE 2 a ciascun ago e inserire le estremità libere dei tubi nei fori appositamente praticati sul dispositivo. Inserire quindi un tratto di tubo PE 2 lungo 10 centimetri nel porto di uscita del dispositivo e posizionare l'altra estremità in un contenitore per la raccolta dei rifiuti.

Dopo averlo configurato, preparare il dispositivo azionando le pompe a siringa a velocità elevate. Arrestare le pompe. Una volta che il fluido nei tratti dei tubi ha raggiunto i porti di ingresso del dispositivo, focalizzare il microscopio sulla regione del chip che contiene un orifizio di 50 per 50 micrometri e regolare l'immagine in modo da includere il canale di uscita a valle.

Impostare le pompe per siringhe in modo da erogare il fluido al generatore di doppia emulsione a una velocità di flusso di 250 microlitri all'ora per la fase interna, 100 microlitri all'ora per la fase intermedia e 700 microlitri all'ora per la fase continua. Attendere 10 minuti affinché il sistema raggiunga l'equilibrio.

Successivamente, aumentare la portata della fase esterna a 1050 microlitri all'ora. Attendere altri tre-cinque minuti affinché la generazione delle emulsioni doppie si stabilizzi in queste condizioni di flusso. Una volta raggiunta la stabilizzazione, acquisire cinque secondi di immagini video a 30 hertz.

Salvare i video per l'elaborazione offline tramite analisi manuale delle immagini. Ripetere questo processo variando la portata della fase esterna utilizzando i valori riportati nella tabella uno del protocollo testuale allegato. Mantenere costanti le portate della fase interna e di quella intermedia.

Durante questo processo, il dispositivo per emulsione doppia è stato testato in diverse condizioni di flusso. Per dimostrare la formazione di emulsioni doppie monodisperse di dimensioni variabili, il rapporto tra la fase continua e la somma delle fasi interna e intermedia è indicato sopra ciascuna immagine. Gli istogrammi dei diametri delle goccioline per alcuni rapporti di flusso mostrano l'uniformità relativa nelle dimensioni delle goccioline generate.

Le emulsioni doppie risultanti producono una variazione media del coefficiente di diametro del 5,2%. Il dispositivo dimostra la capacità di formare emulsioni doppie significativamente più piccole della larghezza dell'orifizio, mostrando una chiara tendenza decrescente all'aumentare dei rapporti di flusso. Al flusso massimo della fase portatrice testato, sono state formate emulsioni doppie di 14 micrometri utilizzando un orifizio di 50 per 50 micrometri dopo il suo sviluppo. Questa tecnica apre la strada a ricercatori chimici e biologici per eseguire esperimenti di microfluidica a gocce compatibili con piattaforme standard di rilevamento mediante citometria a flusso.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare e testare generatori microfluidici di emulsioni doppie che utilizzano semplici tecniche di costruzione interamente in PDMS.