Ricostituzione di base Mitotic mandrini sferici Emulsione goccioline

L'obiettivo generale di questo procedimento è ricostituire strutture simili al fuso mitotico all'interno del confinamento geometrico di gocce di emulsione acqua in olio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'assemblaggio del fuso mitotico, come ad esempio come vengono posizionati e assemblati i fusi, e qual è il contributo specifico dei singoli componenti a questi processi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizziamo un approccio bottom-up per ricostituire strutture simili al fuso all'interno di un confinamento geometrico che imita la forma di una cellula mitotica.

Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare altri processi che dipendono dal confinamento cellulare. Mescolare 10 parti di prepolimero di PDMS con una parte di agente indurente per una massa totale di circa 40 grammi. Successivamente, collocare il composto in una camera a vuoto per circa 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria.

Nel frattempo, avvolgere della carta d'alluminio attorno allo stampo per creare una coppetta profonda un centimetro e con un diametro di quattro pollici. Quando pronto, versare circa i 3/4 della miscela di PDMS nello stampo. Successivamente, riposizionare il PDMS in una camera a vuoto per altri 30 minuti.

Dopo la degasificazione, polimerizzare il PDMS per un'ora a 100 gradi Celsius. Nel frattempo, preparare alcuni vetrini per la deposizione mediante centrifugazione rimuovendo la polvere con aria compressa. Successivamente, depositare la miscela rimanente di PDMS sui vetrini mediante centrifugazione.

Incubare queste vetrine per un'ora a 100 gradi Celsius per indurire il PDMS. Successivamente, rimuovere delicatamente il PDMS utilizzando una lametta e perforare i fori necessari nelle strisce di PDMS per creare chip microfluidici. Ora, sottoporre il chip microfluidico e una vetrina di vetro rivestita con PDMS a un trattamento al plasma corona per alcuni secondi.

Infine, posizionare un chip microfluidico su ogni vetrino con i canali rivolti verso il basso e cuocere i chip tutta la notte a 100 gradi Celsius. Per prima cosa, utilizzando vetreria lavata con cloroformio, preparare circa 250 microgrammi di lipidi disciolti nel cloroformio. Asciugare con attenzione la miscela lipidica utilizzando un gas inerte.

E quindi posizionarlo in una camera a vuoto per un'ora. Successivamente, sciogliere i lipidi in olio minerale e surfattante al 2,5% fino a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro, pari a circa 500 microlitri. Per sciogliere completamente i lipidi, sottoporre la miscela a sonificazione per 30 minuti a 40 kilohertz.

Successivamente, applicare il PDMS per spin-coating su coprioggetti con uno spessore adatto all'obiettivo del microscopio. Quindi, applicare il PDMS per spin-coating su lamelle di vetro. A questo punto, polimerizzare i coprioggetti e le lamelle di vetro rivestiti con PDMS per un'ora a 100 gradi Celsius.

Successivamente, preparare le celle di flusso posizionando a distanza ravvicinata sottili strisce di pellicola sigillante da laboratorio sui vetrini rivestiti con PDMS. Disporre delle strisce da tre millimetri a circa due millimetri di distanza l'una dall'altra. Quindi, coprire le celle di flusso con un'ulteriore lamellina rivestita in PDMS e sigillare l'assemblaggio sciogliendo la pellicola a 100 gradi Celsius per circa un minuto.

Dopo averlo riscaldato, premere delicatamente il vetrino coprioggetto e sigillarlo con Valap. Successivamente, preparare una coppa in PDMS per l'acquisizione di immagini a lungo termine. Praticare un foro di diametro quattro millimetri in una fetta di PDMS spessa tre millimetri.

Quindi, sottoporre a trattamento al plasma corona la fetta di PDMS e un'ampolla di vetro coperta con PDMS. Dopo il trattamento, posizionarle una sull'altra e cuocere l'insieme tutta la notte a 100 gradi Celsius. Monitorare la formazione delle goccioline mediante un microscopio a campo chiaro invertito.

Collegare la fase oleosa dei lipidi al controllore di pressione e aumentare la pressione fino a quando una goccia di olio fuoriesce dal tubo di punta. Collegare il tubo di punta all'ingresso due del chip microfluidico. Successivamente, riempire completamente i chip microfluidici con la fase oleosa dei lipidi dall'ingresso due.

Successivamente, introdurre la fase acquosa a base di MRB-80 dall'ingresso uno. Controllare la dimensione delle goccioline modificando le pressioni della fase oleosa lipidica e della fase acquosa, in modo da generare goccioline con un diametro di circa 15 micron. Un valore di circa 800 millibar per la fase oleosa lipidica e di 200 millibar per la fase acquosa rappresenta un buon punto di partenza.

Dopo aver ottenuto la dimensione desiderata delle goccioline, riempire completamente la cella di flusso con le goccioline. Queste goccioline vengono formate utilizzando piccoli volumi della fase acquosa. Ciò significa che l'allestimento microfluidico deve funzionare rapidamente per evitare di perdere l'intera fase acquosa prima che si formino goccioline della dimensione corretta.

Dopo aver riempito, chiudere con attenzione le estremità della cella di flusso utilizzando Valap. Se le goccioline non smettono di muoversi, significa che la sigillatura non è completa o potrebbero essersi introdotte bolle d'aria. Per l'immagine a lungo termine, trasferire le goccioline in una coppetta in PDMS e coprire con uno strato di miscela oleosa di lipidi.

Scongelare i centrosomi a temperatura ambiente e incubarli a 37 gradi Celsius per 20 minuti per garantire una corretta nucleazione dei microtubuli. Nel frattempo, preparare la miscela per il saggio sul ghiaccio. Questa deve contenere tubulina, GTP, un sistema scavenger di ossigeno, generatori di forza molecolare come cross-linker dei microtubuli, ATP e un sistema rigenerante dell'ATP.

Dopo aver miscelato, centrifugare il campione nel rotore Airfuge refrigerato a 30 psi per tre minuti. Successivamente, aggiungere i centrosomi pre-riscaldati alla miscela. Ottimizzare la quantità di centrosomi aggiunta per ottenere uno o due centrosomi per goccia.

Quindi, utilizzare questa miscela per produrre goccioline emulsionate come descritto in precedenza. Per reclutare la dineina sui lipidi biotinilati alla cortice delle goccioline, aggiungere alla fase acquosa GFP-dineina TMR e streptavidina. Mediante un microscopio confocale a disco rotante, visualizzare la crescita dei microtubuli dopo 30 minuti a 26 gradi Celsius.

Durante l'acquisizione delle immagini, la crescita dei microtubuli può essere promossa aumentando la temperatura a 28 o persino a 30 gradi Celsius. Per le proiezioni Z, acquisire serie di immagini con intervalli di un micron, il che richiederà circa 20 immagini per goccia. Andare al pannello principale della fotocamera, fare clic su Modifica Z e impostare l'intervallo Z su 1,0.

Fare clic su Avanti per salvare le impostazioni. Successivamente, impostare il guadagno EM lineare massimo facendo clic sulla scheda Camera nel pannello di acquisizione e spostando la barra del guadagno EM a 300. Quindi, impostare il tempo di esposizione a 200 millisecondi nella stessa scheda.

Fare clic su Registra per salvare le impostazioni. Per esperimenti di imaging in tempo reale, effettuare proiezioni Z ogni due minuti per due ore riducendo i tempi di esposizione a circa 100 millisecondi e aumentando gli intervalli Z a due micron. Per esperimenti di imaging in tempo reale, utilizzare una coppetta in PDMS invece di una normale cella a flusso per massimizzare l'immobilizzazione del campione.

Utilizzando i protocolli descritti, la formazione degli astri è stata studiata in gocce emulsionate di acqua e olio contenenti centrosomi. Inizialmente, i centrosomi diffondono liberamente all'interno dei volumi confinati. Dopo circa 20-30 minuti, compaiono i primi microtubuli, e la diffusione dei centrosomi diventa limitata man mano che i microtubuli crescono contro la corteccia in tutte le direzioni.

Quando i microtubuli crescono più della metà del diametro della goccia, i centrosomi vengono spinti verso margini opposti, con i microtubuli che crescono lungo la corteccia della goccia. In assenza di streptavidina, la dineina è diffusa all'interno della goccia. Tuttavia, in presenza di streptavidina, entro circa 10 minuti dalla formazione della goccia, la dineina si lega ai lipidi biotinilati.

Quando si osserva la tubulina fluorescente in presenza di dineina corticale, è evidente che i centrosomi sono posizionati al centro. Al contrario, in assenza di dineina, i centrosomi vengono spinti verso lati opposti della goccia. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che la dineina promuove le catastrofi dei microtubuli e le forze di trazione corticali, il che determina il posizionamento centrale delle stelle di microtubuli.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le tecnologie microfluidiche per creare strutture simili a fusi all'interno di gocce emulsionate sferiche. Una volta padroneggiata la tecnica, la formazione delle gocce e l'acquisizione delle immagini possono essere completate in due o tre ore se eseguite correttamente. Utilizzando questa procedura, è possibile incapsulare altri fattori di assemblaggio del fuso per studiarne l'effetto sulla morfologia e sul posizionamento del fuso.

Precauzioni come l'indossare guanti devono essere sempre adottate durante l'uso di cloroformio o PDMS.