Name: Ricostituzione di base Mitotic mandrini sferici Emulsione goccioline (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Impara a ricostituire strutture simili a fusi mitotici in goccioline di emulsione acqua-in-olio con confinamento geometrico. Questo metodo bottom-up permette di studiare l'assemblaggio e il posizionamento dei fusi cellulari in condizioni che mimano l'ambiente mitotico.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Dogterom per le preziose discussioni. Ringraziamo Stefan Diez e Marcel Janson per i reagenti e Samara Reck-Peterson per l'aiuto nella purificazione della dineina. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento del Consiglio europeo della ricerca (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

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<li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li>
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<li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li>
<li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li>
<li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li>
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<li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li>
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<li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+production+by+disassembling+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li>
<li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li>
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<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li>
<li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I metodi descritti sforzi qui presenti recenti per ricostituire fusi mitotici di base in acqua-in-olio di goccioline di emulsione. Studiando l&#39;assemblaggio del fuso all&#39;interno dei confini geometrici offre numerosi vantaggi. meccanismi importanti di feedback esistono tra microtubuli del fuso mitotico ei vincoli geometrici in cui sono assemblati. I microtubuli possono generare forze di spinta quando crescono in confini geometrici, che può risultare in spostamento fuso mitotico. Inoltre, cresce in una barriera fisica può indurre catastrofi microtubuli. Inoltre, del fuso entro una geometria confinato può portare ad un progressivo esaurimento delle singole componenti, come tubulina, che a sua volta influisce direttamente sulla velocità di crescita dei microtubuli 36. Questi sono tutti fattori determinanti essenziali di assemblaggio del fuso, che possono essere studiati utilizzando i saggi descritti qui. I saggi descritti sono molto sensibili alla piccola differe concentrazioneNCEs dei componenti di una goccia. Questo è il caso per la tubulina, in cui le differenze di concentrazione minori possono risultare in crescita troppo lento o troppo rapido microtubuli. In questo caso, i tassi di crescita microtubuli spesso possono ancora essere corrette regolando la temperatura durante il primo ~ 30 min dell&#39;esperimento. del fuso mitotico e posizionamento è anche molto sensibile alle variazioni della concentrazione di generatori (corticale) di forza. Questo è probabilmente dipende dalla concentrazione, la purezza e l&#39;attività dei componenti purificati e deve essere titolato con attenzione per ogni nuova proteina purificata. Inoltre, alcuni compromessi devono essere effettuate in ambienti di imaging, a seconda della natura del saggio. Inizialmente, alti livelli di dimeri di tubulina fluorescenti solubili rendono difficile immagine singoli microtubuli. Come microtubuli si allungano e tubulina solubile è esaurito lentamente, il rapporto segnale-rumore diventa gradualmente più elevata e permette l&#39;imaging del individuAl microtubuli. In contrasto con configurazioni con sistemi aperti, il confinamento geometrico impedisce lo scambio di molecole fluorescenti e componenti di sistema assorbitore di ossigeno all&#39;interno di un serbatoio di massa, con conseguente sbiancamento significativo. Soprattutto per monitorare assemblaggio del fuso e posizionamento nel tempo, si richiede di immagine con basse intensità di luce, anche in presenza di un potente sistema di ossigeno scavenger. Questi metodi consentono la ricostituzione bottom-up di semplificate strutture mandrino simili in vitro. Oltre ai componenti introdotti qui, molti altri fattori sono stati descritti da influenzare la formazione bipolare mandrino, posizionamento, orientamento, sagomatura, ecc 3. Questo sistema può essere ulteriormente ampliato per studiare gli effetti individuali e combinati di generatori di forza aggiuntivi. contributori importanti per la formazione del fuso che sono attualmente assente da questo sistema sono i cromosomi mitotici. cromatina mitotico ha dimostrato diformazione diretta mandrino (1) chromokinesins che possono generare la cosiddetta &#39;forze polari-espulsione&#39; 3, (2) la formazione di un gradiente RanGTP dalla cromatina-bound RanGEF RCC1 38, (3) cinetocori che possono interagire con (depolimerizzante ) microtubuli 39 e (4) la cromatina stessa, che può funzionare come una molla meccanica in-tra microtubuli opposte 40. Infine, il sistema descritto fornisce attualmente limitato controllo temporale e spaziale sull&#39;attività e localizzazione di forza generatori introdotte. Nelle cellule, molti fattori di assemblaggio del fuso localizzano a compartimenti specifici o sono attivi all&#39;interno di una finestra temporale limitata. Un esempio lampante è l&#39;attività di dineina, che è specificamente arricchito sul lato posteriore del C. elegans una cellula embrionale per promuovere il posizionamento del mandrino asimmetrica e la divisione cellulare. In questo sistema, stiamo esplorando la possibilità di imitare tale tattività utilizzando metodi emporal e asimmetrici presi in prestito dalle tecniche opto-genetiche. Inoltre, come è il caso per la C. elegans embrione e cellule con una parete cellulare rigida, molte cellule non completano in mitosi. La forma del confinamento geometrica avrà un impatto fondamentale sulle forze che agiscono sul mandrino 41. Sarà quindi importante ricostituire assemblaggio del mandrino e posizionamento nelle goccioline non sferiche e, potenzialmente utilizzando sistemi microfluidici più complessi che permettono di plasmare e la memorizzazione di emulsione di goccioline di 42,43. Infine, nei tessuti, cellula-cellula e cellula-segnalazione substrato e attaccamento forniscono stimoli esterni che possono essere tradotti in orientamento del mandrino diretto, come spesso osservato in cellule epiteliali e le cellule staminali. Tutti questi aspetti specialistici non sono stati presi in considerazione in questo studio e potrebbe fornire le sfide del futuro per costruire verso più in vivo -come ricostruzioni di mitotico assemb mandrinoly e posizionamento.

Durante la mitosi, i cromosomi del genoma replicato sono organizzati all&#39;equatore cella per garantire la parità di distribuzione di cromatidi fratelli negli cellule figlie di nuova formazione. il posizionamento e la segregazione dei cromosomi è mediato da loro attaccamento ai microtubuli del fuso provenienti da due centrosomi opposte. Oltre a garantire la distribuzione cromosomica fedeli, l&#39;orientamento del fuso mitotico detta anche il piano divisione cellulare 1. Orientamento coordinato di divisione cellulare è essenziale durante molte fasi di sviluppo e per il tessuto omeostasi 2. In particolare, regolata posizionamento fuso mitotico può comportare la distribuzione asimmetrica del contenuto cellulare o anche produrre cellule figlie di diverse dimensioni 2. Assemblaggio del fuso mitotico e l&#39;orientamento inizia in profase e è orchestrato da una complessa interazione tra cooperazione e inimicarsi forza-generatori 3,4. Le forze generate consistono btirando e spingendo le forze di OTH. Queste forze provengono sia dai contatti mandrino con la corteccia cellule così come all&#39;interno del mandrino, e possono essere generati da dinamica dei microtubuli e da motori molecolari e reticolanti (Figura 1). spinte possono essere generati quando microtubuli crescono contro strutture rigide come la corteccia cellulare. A seconda della forza resistente totale generato all&#39;interno del sistema, questo può portare a riposizionamento del fuso mitotico (forze inferiori) o innescare instabilità microtubuli o catastrofi (elevate forze) 5-8. La quantità di forza che può essere generato premendo dipende dalla lunghezza dei microtubuli, poiché la lunghezza è un forte determinante di microtubuli buckling 9. Inoltre, microtubuli che hanno origine da uno dei centrosomi possono spingere contro l&#39;altro centrosoma, un meccanismo che è stato suggerito di guidare la separazione centrosome nei primi mesi del profase 3,10. in annunciocondizione per spingere le forze generate da microtubuli in crescita, microtubuli che tocca la corteccia cellula può anche mediare forze di trazione 11. Studi di molteplici laboratori hanno mostrato che l&#39;attività controllata di generatori di forza corticali è necessaria per il posizionamento asimmetrico dei fusi mitotici in vivo 1. Essenziale per queste forze di trazione è Cortex-localizzato dynein citoplasmatica (di seguito denominato &#39;dynein&#39;), un meno-end microtubuli diretto proteine ​​motore 8,12,13. Ad esempio, in il lievito, interazioni laterali di dynein corticale con il risultato lattice microtubuli in microtubuli base al motore scorrevole lungo la corteccia 14. Tuttavia, le forze di trazione corticali possono essere generati anche dalla capacità di dynein di formare raccordi di estremità-a depolimerizzante microtubuli 8. L&#39;energia generata dal restringimento microtubuli può portare a forze che sono generalmente di un ordine di grandezza superiore (~ 50 pN (riferimento 15 </sup&gt;)) che le forze generate dai singoli proteine ​​motrici (~ 7-8 pN (rif. 16)). Attaccamento Fine-in di dynein corticale ai microtubuli depolimerizzante promuove posizionamento del mandrino in erba lievito 17 e C. elegans 13. Sia che sia in base al motore scorrevole e microtubuli depolimerizzazione guidato forze di trazione corticali possono cooperare o si escludono a vicenda in vivo è attualmente sconosciuto. Oltre a spinta forze microtubuli e forze di trazione corticali dynein-mediata, posizionamento centrosoma è controllata all&#39;interno del fuso mitotico da numerose altre proteine. Kinesin-5 motori, ad esempio, esistono come tetrameri che può reticolare antiparalleli microtubuli interpolari, con conseguente generazione di forze di scorrimento verso l&#39;esterno 18-20. I membri della famiglia del motore chinesina-5 sono necessari per la separazione centrosome e montaggio fuso bipolare in tutti gli eucarioti studiati, con l&#39;eccezione di C. elegans<html> (recensito in riferimento 21). Inoltre, sono anche noti diffusibili reticolanti della famiglia / PRC1 Ase1 localizzare per sovrapposizione delle regioni microtubuli di microtubuli interpolari in vivo e in vitro 22-27. Le forze generate dalla espansione Ase1-driven del microtubulo-regione di sovrapposizione sono grandi abbastanza per controbilanciare kinesin-14 delle forze di scorrimento in vitro mediata 28,29. Nelle cellule, Ase1 / PRC1 è necessario per la formazione stabile di sovrapposizione regioni microtubuli nella zona mediana del mandrino 25-27,30, il che suggerisce che le forze generate da diffusibili reticolanti possono contribuire in modo significativo alla organizzazione del mandrino. Infine, le forze della cromatina mitotico e cinetocori influenzano assemblaggio del fuso mitotico e il posizionamento attraverso vari percorsi 3. Dal momento che questi componenti non sono parte dei saggi ricostituzione qui descritte, non saranno discussi in dettaglio. jove_content &quot;&gt; Diverse teorie esistono su come le diverse componenti molecolari e forze sopra descritte cooperano nel montaggio e posizionamento del mandrino, ma siamo ancora lontani da una comprensione quantitativa. Oltre a esperimenti nelle cellule viventi, gli esperimenti in vitro con componenti purificati forniscono un potente percorso per aiutare raggiungere questo obiettivo. presentiamo qui una guida visiva per una versione adattata ed estesa dei metodi pubblicati recentemente (Roth et al. 31), in cui mandrini base sono ricostituiti in acqua-in-olio di goccioline di emulsione, iniziando con un numero minimo di componenti. Utilizzando tecniche di microfluidica, goccioline sferiche vengono generati con i formati che sono paragonabili alle cellule in mitosi. All&#39;interno di queste goccioline, centrosomi purificati e tubulina possono essere combinati al fine di studiare la dinamica aster microtubuli, forzare le interazioni generazione e Aster-Aster. di introducendo corticali (come dineina) e inter-polari (come ad esempio kinesin-5 / Ase1) forza-generatori, abbiamoricostituire strutture sempre più complesse mandrino-like che iniziano ad assomigliare alla situazione in vivo.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Preparazione di chip microfluidici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Fotomaschera su substrato di pellicola)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicio (wafer di silicio da 4 pollici p/Boro < 1-0-0>10-20 &Omega;-cm, 500-550 &mu; m, SSP, con 2 piatti)</td><td>WRS Materiali</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater&nbsp;</td><td>Polo</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pre-polimero RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Trattamento corona</td><td>Prodotti elettrotecnici</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. Configurazione microfluidica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-( biotinil))</td><td>Avanti Lipidi polari</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td></td>di</tr><tr><td>vetro Tubi</td><td></td><td></td><td></td>di vetro</tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Camera a vuoto</td><td>Kartell</td><td>Polipropilene Essiccatore</td><td></td></tr><tr><td>a vuoto Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Tensioattivo (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td></td><td></td><td>coprioggetti 24 mm x 60 mm, spessore 1,5</td></tr><tr><td>Vetrini</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Perforatore</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Sigillatura da laboratorio film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (vaselina, lanolina, cera di paraffina sciolta a concentrazioni uguali)</td><td></td><td></td><td>Microscopio a campo chiaro fatto in casa</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>Qualsiasi campo chiaro invertito sarebbe sufficiente</td></tr><tr><td>Regolatore di pressione</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in PEEK</td><td>Cluzeau Info. Labo, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiale di microfluidica (Tubi Micrew 0,5 ml e 1 ml)</td><td>VWR, Paesi Bassi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. Formazione e posizionamento del mandrino di ricostituzione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10.000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosio (D-(+)-Glucosio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio-ossidasi (Glucosio ossidasi da Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-ditiolitolo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi (Catalasi dal fegato bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina (Tubulina da cervello bovino)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulina-488/561 (Tubulina marcata con HiLyte-488/Rhodamine dal cervello suino)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosina-'5-trifosfato, sale sodico idrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa;-caseina (&kappa;-caseina da siero di latte bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (Ultracentrifuga ad aria)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>4. Presentazione dei fattori di assemblaggio del mandrino</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina-'5-trifosfato, sale disodico idrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Acido fosfo(enol)piruvico sale monosodico idrato &ge; 97% (enzimatico))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Piruvato chinasi/enzimi lattico deidrogenasi dal muscolo del coniglio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

ricostituzione di base mitotic mandrini sferici emulsione goccioline

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

L'assemblaggio, il posizionamento e l'orientamento del fuso mitotico dipendono dalle forze combinate generate dalla dinamica dei microtubuli, dalle proteine motorie dei microtubuli e dai reticolanti. I microtubuli in crescita possono generare forze di spinta, mentre i microtubuli depolimerizzanti possono convertire l'energia dal restringimento dei microtubuli in forze di trazione, quando sono attaccati, ad esempio, alla dineina corticale o ai cromosomi. Inoltre, le proteine motrici e i reticolanti diffusibili all'interno del fuso contribuiscono all'architettura del fuso collegando e facendo scorrere i microtubuli antiparalleli. In vivo, si è dimostrato difficile svelare il contributo relativo dei singoli attori all'equilibrio complessivo delle forze. Qui presentiamo i metodi che abbiamo recentemente sviluppato nei nostri sforzi per ricostituire i fusi mitotici di base dal basso verso l'alto in vitro. Utilizzando tecniche microfluidiche, i centrosomi e la tubulina sono incapsulati in goccioline di emulsione acqua-in-olio, portando alla formazione di astri microtubulici geometricamente confinati (doppi). Introducendo inoltre dineina ancorata corticalmente, motori a microtubuli diretti plus-end e reticolanti diffusibili, questo sistema viene utilizzato per ricostituire strutture simili a fusi. I metodi qui presentati forniscono un punto di partenza per la ricostituzione di fusi mitotici più completi, consentendo uno studio dettagliato del contributo di ogni singolo componente e per ottenere una visione quantitativa integrata del bilancio di forza all'interno del fuso mitotico.

I metodi presentati nelle sezioni precedenti permettono la ricostituzione di strutture mandrino-come al crescere della complessità utilizzando il confinamento geometrico di acqua-in-olio di goccioline di emulsione. Questa sezione descrive i risultati rappresentativi che qualitativamente dimostrare la capacità di questi test. Durante la mitosi, quando il fuso bipolare è assemblato, cellule completano a formare sfere con un diametro di circa 15 micron, come misurato per le cellule umane. Questa caratteristica forma cellulare mitotico fornisce un confine geometrico che sia limita e dirige le dimensioni del mandrino e l&#39;orientamento 35,36. Tecniche di microfluidica, forniscono un livello di confinamento geometrica che ricorda con precisione la situazione osservata nelle cellule viventi, e quindi permette la ricostruzione bottom-up di mandrini mitotico in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-Pagina = &quot;1&quot;&gt; astri di microtubuli sono di per sé già in grado di comportamento complesso quando la crescita dei microtubuli è limitato da confini geometrici. Come microtubuli crescono, forze che spingono generate dalla incorporazione di nuovi dimeri di tubulina guidano i due centrosomi a lati opposti delle goccioline di emulsione. Dapprima, centrosomes liberamente diffondono all&#39;interno del volume confinato (Figura 4a, pannello di sinistra). Dopo circa 20-30 minuti, i primi microtubuli diventano visibili diffusione e centrosome diventa limitato come microtubuli crescono contro la corteccia in tutte le direzioni. Asters con microtubuli di lunghezza intermedia (circa il 50% del diametro delle gocce) possono (stericamente) respingono un&#39;altra, con microtubuli spingendo contro l&#39;altro, gli altri centrosomi e la corteccia. Ciò si traduce in una tipica disposizione mandrino come &#39;bipolare&#39; con i due centrosomes opposti tra loro (figura 4a, pannello centrale). Quando microtubuli crescono più di ~ 50% della goccia-diametro, i centrosomi ottenere spinto ulteriormente al opposti confini della gocciolina, con microtubuli che crescono lungo la corteccia delle gocce (Figura 4a, pannello di destra). È importante notare che i tassi di crescita dei microtubuli in questi test sono molto sensibili alla temperatura e tubulina concentrazioni. Questi parametri saranno quindi influenzare fortemente il momento in cui nucleazione viene prima osservato e quando si raggiungono posizioni di aster steady-state. Nelle cellule, le forze di trazione corticali sono generati attraverso la formazione di collegamenti portanti tra microtubuli plus-end e dynein Cortex-associata. In cellule animali, questa associazione dipende dal complesso Gαi / LGN / NuMA, che si rivolge alla membrana plasmatica tramite myristoylation N-terminale della Gαi 1. In questi saggi ricostituzione, il requisito del complesso Gαi / LGN / NuMA viene bypassato accoppiando direttamente dynein di lipidi biotinilati attraverso laformazione di complessi biotina-streptavidina-biotina. Questi legami sono relativamente stabili (K D ~ 10 -14 M) 37 e formano rapidamente (di solito entro 10 min dopo la formazione dell&#39;emulsione gocciolina, prima microtubuli nucleazione diventa evidente) (Figura 4b). In presenza di dineina corticale, centrosomes tipicamente mantengono una posizione più centrale, mentre in assenza di dineina, centrosomi sono spinti ai lati opposti della corteccia goccia (figura 4c). Abbiamo ragione per cui questo è il risultato di due effetti, che prevenire e contrastare le forze di microtubuli spingere. (1) Dynein promuove direttamente catastrofi microtubuli, limitando in tal modo la lunghezza dei microtubuli e prevenendo eccessiva deformazione dei microtubuli, e (2) forze di trazione corticali portare alla forza risultante di centraggio sulle singole astri 8, che contrastano le forze di repulsione Aster-Aster. Il diffusibile cross-linker Ase1 induce forces che tendono ad aumentare la regione di sovrapposizione dei microtubuli anti-parallele 29. Coerentemente con questo, in presenza di Ase1 (e l&#39;assenza di dineina) centrosomi si trovano vicini tra loro con Ase1 localizzazione di bundle microtubuli interpolari (Figura 4D). I membri della famiglia kinesin-5 auto separazione dei centrosomi, fornendo forze che spingono dall&#39;interno del mandrino (vedi introduzione). In presenza di Cut7 (S. pombe chinesina-5 ortologo), centrosomi sono spinti a lati opposti delle goccioline di emulsione, anche in presenza di Ase1 (figura 4e). Grazie alla combinazione di generatori di forza corticali e inter-polari, il livello di complessità può essere ulteriormente aumentata in questi esperimenti, alla fine portano a una comprensione globale del montaggio mitotico fuso bipolare. Una descrizione quantitativa dettagliata di questi risultati saranno disponibili in futuro (Roth et al., Manoscritto in preparazione). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Oltre ad osservare la posizione dei centrosomi in momenti fissi nel tempo, e relative loro comportamento alle lunghezze osservati dei microtubuli, preziose informazioni possono essere ottenute seguendo il processo di posizionamento sopra tempo. Riducendo i tempi di esposizione e intensità del laser, è ora possibile seguire il posizionamento aster ad intervalli di 2 min per almeno 1 ora con solo il 30% ~ sbiancamento. Questo consente il monitoraggio di assemblaggio aster e posizionamento di centrosomi liberamente diffondenti (0 min.) Via centralizzata (12 min.) Di astri decentrate (36 min e oltre) (Figura 5C). Questo facilita lo studio del comportamento sia stato stazionario e cinetica di montaggio del mandrino. Combinando goccioline con diversi contenuti nello stesso campione, è, ad esempio, possibile confrontare direttamente centrosoma posizionamento e montaggio del mandrino cinetica in goccioline con e senza generatori di forza corticali (Figura 5b). Figura 1: forze agenti sul mitotica mandrino diverse molecole genera forza agiscono sui microtubuli del fuso mitotico per promuovere la formazione del fuso e posizionamento.. I microtubuli che crescono nella corteccia delle cellule generano una forza di spinta sul centrosoma. dineina corticale (viola) cattura microtubuli depolimerizzante e genera una forza di trazione sulle centrosomi. All&#39;interno del mandrino, kinesin-5 proteine ​​motrici / Cut7 forniscono una forza di scorrimento verso l&#39;esterno microtubuli anti-parallele, mentre cross-linkers della famiglia PRC1 / Ase1 generano un avversario verso l&#39;esterno forza di scorrimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Figura 2:. Microfluidic Chip Design (A) Progettazione di fotomaschere 4 pollici contenente 4 chip microfluidica. (B) Rappresentazione dettagliata di un singolo chip. Chips contengono un canale di uscita e tre canali di entrata seguita da una polvere filtro. canale di ingresso 1 contiene l&#39;acqua-fase canale 2 lipide / fase oleosa e il canale 3 può essere utilizzato per diluire le goccioline formate con ulteriori lipidi / fase oleosa. (C) Rappresentazione dettagliati di giunzione in cui il lipide / fase oleosa (proveniente dalla parte superiore e inferiore) incontra con l&#39;acqua-fase (proveniente da sinistra). Al bivio, goccioline formeranno e fluire verso il canale di uscita a destra. (D) la rappresentazione dettagliata di un polvere filtro con 2 micron canali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Figura 3:. Metodologia per la formazione di acqua-in-olio Emulsione gocciolina (A) chip microfluidico e tubi microfluidica su un microscopio in campo chiaro. Entrambi i tubi di acqua e lipidi / olio-fase sono collegate agli ingressi di chip 1 e 2 rispettivamente. (B) Restrizioni sul chip microfluidica in cui l&#39;acqua e lipidi / olio-fasi si incontrano. Cambiando le pressioni, goccioline formato può essere controllato. (C) Design di portate cellule PDMS rivestite. Dopo aver caricato le goccioline nella cella a flusso, le estremità aperte vengono chiuse con ulteriori Valap. (D) Schema di formazione di goccioline. Goccioline vengono utilizzati per incapsulare centrosomi, tubulina e componenti aggiuntivi necessari per la formazione del fuso mitotico. (E) Schema del targeting corticale-dynein. Biotinilato (Bio) dynein si rivolge a lipidi biotinilati attraverso streptavidina (Strp). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Figura 4:. Risultati rappresentativi di mandrini-Reconstitutions con complessità crescente (A) proiezioni di massima intensità di goccioline contenenti due centrosomi che mostrano esempi di brevi, intermedi, e lungo i microtubuli. Centrosomi e microtubuli sono visualizzate con l&#39;aggiunta di 10% HiLyte-488 marcato tubulina. Barre di scala = 10 micron. (B) Localizzazione di GFP-biotina-dynein-TMR in assenza (-, a sinistra) e la presenza (+, a destra) di streptavidina (Strp). Posizionamento (C) Microtubulo aster in assenza (-, a sinistra) o la presenza (+, a destra) della corticale GFP-biotina-dynein-TMR. (D) Microtubulo aster (pannello di sinistra, green) posizionamento in presenza di Ase1 (pannello centrale, rosso). (E) Microtubulo aster (pannello di sinistra, verde) il posizionamento in presenza di Ase1 e Cut7 (kinesin-5) (pannello centrale, rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Figura 5: Imaging Aster Posizionamento Dynamics in vitro (a) Progettazione di una tazza PDMS che permette l&#39;imaging delle gocce per diverse ore.. (B) generazione, lo stoccaggio e l&#39;imaging di goccioline (trasmessa) che contiene diversi contenuti, illustrate da assenza (a sinistra) inclusione (a destra) di destrano fluorescente (Alexa 647). (C) le immagini solo piano di un 60 min time-lapse (2 min intervalli) tratto da un z-stack (2 micron distanze) di annuncioroplet contenente un singolo centrosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

L'assemblaggio e il posizionamento del fuso mitotico dipendono dalle forze combinate generate dalla dinamica dei microtubuli, dalle proteine motorie e dai reticolanti. Qui presentiamo i nostri metodi recentemente sviluppati in cui il confinamento geometrico di goccioline di emulsione sferica viene utilizzato per la ricostituzione dal basso verso l'alto di fusi mitotici basici.

Ricostituzione di base Mitotic mandrini sferici Emulsione goccioline

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è ricostituire strutture simili al fuso mitotico all'interno del confinamento geometrico di gocce di emulsione acqua in olio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'assemblaggio del fuso mitotico, come ad esempio come vengono posizionati e assemblati i fusi, e qual è il contributo specifico dei singoli componenti a questi processi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizziamo un approccio bottom-up per ricostituire strutture simili al fuso all'interno di un confinamento geometrico che imita la forma di una cellula mitotica.Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare altri processi che dipendono dal confinamento cellulare. Mescolare 10 parti di prepolimero di PDMS con una parte di agente indurente per una massa totale di circa 40 grammi. Successivamente, collocare il composto in una camera a vuoto per circa 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria.Nel frattempo, avvolgere della carta d'alluminio attorno allo stampo per creare una coppetta profonda un centimetro e con un diametro di quattro pollici. Quando pronto, versare circa i 3/4 della miscela di PDMS nello stampo. Successivamente, riposizionare il PDMS in una camera a vuoto per altri 30 minuti.Dopo la degasificazione, polimerizzare il PDMS per un'ora a 100 gradi Celsius. Nel frattempo, preparare alcuni vetrini per la deposizione mediante centrifugazione rimuovendo la polvere con aria compressa. Successivamente, depositare la miscela rimanente di PDMS sui vetrini mediante centrifugazione.Incubare queste vetrine per un'ora a 100 gradi Celsius per indurire il PDMS. Successivamente, rimuovere delicatamente il PDMS utilizzando una lametta e perforare i fori necessari nelle strisce di PDMS per creare chip microfluidici. Ora, sottoporre il chip microfluidico e una vetrina di vetro rivestita con PDMS a un trattamento al plasma corona per alcuni secondi.Infine, posizionare un chip microfluidico su ogni vetrino con i canali rivolti verso il basso e cuocere i chip tutta la notte a 100 gradi Celsius. Per prima cosa, utilizzando vetreria lavata con cloroformio, preparare circa 250 microgrammi di lipidi disciolti nel cloroformio. Asciugare con attenzione la miscela lipidica utilizzando un gas inerte.E quindi posizionarlo in una camera a vuoto per un'ora. Successivamente, sciogliere i lipidi in olio minerale e surfattante al 2,5% fino a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro, pari a circa 500 microlitri. Per sciogliere completamente i lipidi, sottoporre la miscela a sonificazione per 30 minuti a 40 kilohertz.Successivamente, applicare il PDMS per spin-coating su coprioggetti con uno spessore adatto all'obiettivo del microscopio. Quindi, applicare il PDMS per spin-coating su lamelle di vetro. A questo punto, polimerizzare i coprioggetti e le lamelle di vetro rivestiti con PDMS per un'ora a 100 gradi Celsius.Successivamente, preparare le celle di flusso posizionando a distanza ravvicinata sottili strisce di pellicola sigillante da laboratorio sui vetrini rivestiti con PDMS. Disporre delle strisce da tre millimetri a circa due millimetri di distanza l'una dall'altra. Quindi, coprire le celle di flusso con un'ulteriore lamellina rivestita in PDMS e sigillare l'assemblaggio sciogliendo la pellicola a 100 gradi Celsius per circa un minuto.Dopo averlo riscaldato, premere delicatamente il vetrino coprioggetto e sigillarlo con Valap. Successivamente, preparare una coppa in PDMS per l'acquisizione di immagini a lungo termine. Praticare un foro di diametro quattro millimetri in una fetta di PDMS spessa tre millimetri.Quindi, sottoporre a trattamento al plasma corona la fetta di PDMS e un'ampolla di vetro coperta con PDMS. Dopo il trattamento, posizionarle una sull'altra e cuocere l'insieme tutta la notte a 100 gradi Celsius. Monitorare la formazione delle goccioline mediante un microscopio a campo chiaro invertito.Collegare la fase oleosa dei lipidi al controllore di pressione e aumentare la pressione fino a quando una goccia di olio fuoriesce dal tubo di punta. Collegare il tubo di punta all'ingresso due del chip microfluidico. Successivamente, riempire completamente i chip microfluidici con la fase oleosa dei lipidi dall'ingresso due.Successivamente, introdurre la fase acquosa a base di MRB-80 dall'ingresso uno. Controllare la dimensione delle goccioline modificando le pressioni della fase oleosa lipidica e della fase acquosa, in modo da generare goccioline con un diametro di circa 15 micron. Un valore di circa 800 millibar per la fase oleosa lipidica e di 200 millibar per la fase acquosa rappresenta un buon punto di partenza.Dopo aver ottenuto la dimensione desiderata delle goccioline, riempire completamente la cella di flusso con le goccioline. Queste goccioline vengono formate utilizzando piccoli volumi della fase acquosa. Ciò significa che l'allestimento microfluidico deve funzionare rapidamente per evitare di perdere l'intera fase acquosa prima che si formino goccioline della dimensione corretta.Dopo aver riempito, chiudere con attenzione le estremità della cella di flusso utilizzando Valap. Se le goccioline non smettono di muoversi, significa che la sigillatura non è completa o potrebbero essersi introdotte bolle d'aria. Per l'immagine a lungo termine, trasferire le goccioline in una coppetta in PDMS e coprire con uno strato di miscela oleosa di lipidi.Scongelare i centrosomi a temperatura ambiente e incubarli a 37 gradi Celsius per 20 minuti per garantire una corretta nucleazione dei microtubuli. Nel frattempo, preparare la miscela per il saggio sul ghiaccio. Questa deve contenere tubulina, GTP, un sistema scavenger di ossigeno, generatori di forza molecolare come cross-linker dei microtubuli, ATP e un sistema rigenerante dell'ATP.Dopo aver miscelato, centrifugare il campione nel rotore Airfuge refrigerato a 30 psi per tre minuti. Successivamente, aggiungere i centrosomi pre-riscaldati alla miscela. Ottimizzare la quantità di centrosomi aggiunta per ottenere uno o due centrosomi per goccia.Quindi, utilizzare questa miscela per produrre goccioline emulsionate come descritto in precedenza. Per reclutare la dineina sui lipidi biotinilati alla cortice delle goccioline, aggiungere alla fase acquosa GFP-dineina TMR e streptavidina. Mediante un microscopio confocale a disco rotante, visualizzare la crescita dei microtubuli dopo 30 minuti a 26 gradi Celsius.Durante l'acquisizione delle immagini, la crescita dei microtubuli può essere promossa aumentando la temperatura a 28 o persino a 30 gradi Celsius. Per le proiezioni Z, acquisire serie di immagini con intervalli di un micron, il che richiederà circa 20 immagini per goccia. Andare al pannello principale della fotocamera, fare clic su Modifica Z e impostare l'intervallo Z su 1,0.Fare clic su Avanti per salvare le impostazioni. Successivamente, impostare il guadagno EM lineare massimo facendo clic sulla scheda Camera nel pannello di acquisizione e spostando la barra del guadagno EM a 300. Quindi, impostare il tempo di esposizione a 200 millisecondi nella stessa scheda.Fare clic su Registra per salvare le impostazioni. Per esperimenti di imaging in tempo reale, effettuare proiezioni Z ogni due minuti per due ore riducendo i tempi di esposizione a circa 100 millisecondi e aumentando gli intervalli Z a due micron. Per esperimenti di imaging in tempo reale, utilizzare una coppetta in PDMS invece di una normale cella a flusso per massimizzare l'immobilizzazione del campione.Utilizzando i protocolli descritti, la formazione degli astri è stata studiata in gocce emulsionate di acqua e olio contenenti centrosomi. Inizialmente, i centrosomi diffondono liberamente all'interno dei volumi confinati. Dopo circa 20-30 minuti, compaiono i primi microtubuli, e la diffusione dei centrosomi diventa limitata man mano che i microtubuli crescono contro la corteccia in tutte le direzioni.Quando i microtubuli crescono più della metà del diametro della goccia, i centrosomi vengono spinti verso margini opposti, con i microtubuli che crescono lungo la corteccia della goccia. In assenza di streptavidina, la dineina è diffusa all'interno della goccia. Tuttavia, in presenza di streptavidina, entro circa 10 minuti dalla formazione della goccia, la dineina si lega ai lipidi biotinilati.Quando si osserva la tubulina fluorescente in presenza di dineina corticale, è evidente che i centrosomi sono posizionati al centro. Al contrario, in assenza di dineina, i centrosomi vengono spinti verso lati opposti della goccia. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che la dineina promuove le catastrofi dei microtubuli e le forze di trazione corticali, il che determina il posizionamento centrale delle stelle di microtubuli.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le tecnologie microfluidiche per creare strutture simili a fusi all'interno di gocce emulsionate sferiche. Una volta padroneggiata la tecnica, la formazione delle gocce e l'acquisizione delle immagini possono essere completate in due o tre ore se eseguite correttamente. Utilizzando questa procedura, è possibile incapsulare altri fattori di assemblaggio del fuso per studiarne l'effetto sulla morfologia e sul posizionamento del fuso.Precauzioni come l'indossare guanti devono essere sempre adottate durante l'uso di cloroformio o PDMS.

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