Ricostituzione di base Mitotic mandrini sferici Emulsione goccioline

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ricostituire strutture mitotiche simili a fusi all'interno del confinamento geometrico dell'acqua in goccioline di emulsione oleosa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'assemblaggio di mandrini mitotici, come ad esempio come vengono posizionati e assemblati i mandrini e qual è il contributo specifico dei singoli componenti a questi processi? Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizziamo un approccio dal basso verso l'alto per ricostituire strutture simili a fusi all'interno del confinamento geometrico che imita la forma di una cellula mitotica.

Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare altri processi che dipendono dal confinamento cellulare. Mescolare 10 parti di prepolimero PDMS con una parte di agente indurente in una massa totale di circa 40 grammi. Quindi, porre il composto in una camera a vuoto per circa 30 minuti per eliminare le bolle d'aria.

Nel frattempo, avvolgere un foglio di alluminio attorno allo stampo per creare una tazza profonda un centimetro con un diametro di quattro pollici. Quando è pronto, versare circa 3/4 del composto PDMS nello stampo. Quindi, rimettere il PDMS in una camera a vuoto per altri 30 minuti.

Dopo il degasaggio, polimerizzare il PDMS per un'ora a 100 gradi Celsius. Nel frattempo, preparare alcuni vetrini per la centrifuga spolverandoli con aria compressa. Quindi, centrifugare la miscela PDMS rimanente sui vetrini.

Polimerizzare questi vetrini per un'ora a 100 gradi Celsius per indurire il PDMS. Quindi, rimuovere delicatamente il PDMS usando una lama di rasoio e praticare i fori necessari dalle strisce PDMS per creare chip microfluidici. Ora, corona tratta il chip microfluidico e un vetrino rivestito PDMS per alcuni secondi.

Infine, posiziona un chip microfluidico su ogni vetrino con i canali rivolti verso il basso e cuoci i chip per una notte a 100 gradi Celsius. Per prima cosa, utilizzando vetreria lavata con cloroformio, preparare circa 250 microgrammi di lipidi disciolti con cloroformio. Asciugare accuratamente la miscela lipidica con gas inerte.

E poi mettilo in una camera a vuoto per un'ora. Quindi, sciogliere i lipidi nell'olio minerale e nel tensioattivo al 2,5% a 0,5 milligrammi per millilitro, che è di circa 500 microlitri. Per sciogliere completamente i lipidi, sonicare la miscela per 30 minuti a 40 kilohertz.

Quindi, far girare il PDMS su vetri di copertura con uno spessore che corrisponda all'obiettivo del microscopio. Quindi, centrifugare il PDMS sui vetrini. Ora, polimerizzare i vetri di copertura rivestiti di PDMS e i vetrini per un'ora a 100 gradi Celsius.

Quindi, realizzare le celle di flusso distanziando strettamente fette sottili di pellicola sigillante da laboratorio sui vetrini rivestiti con PDMS. Posizionare strisce di tre millimetri a circa due millimetri di distanza. Quindi, coprire le celle di flusso con un vetrino copricapo rivestito in PDMS e sigillare il gruppo fondendo la pellicola a 100 gradi Celsius per un minuto veloce.

Una volta riscaldato, premere delicatamente il vetrino copricoperchio e sigillarlo con Valap. Quindi, preparare una coppetta PDMS per l'imaging a lungo termine. Praticare un foro di quattro millimetri di diametro in una fetta di PDMS spessa tre millimetri.

Quindi, trattare a corona la fetta PDMS e un vetro di copertura rivestito in PDMS. Una volta trattati, posizionarli uno sopra l'altro e cuocere il gruppo per una notte a 100 gradi Celsius. Monitora la formazione di goccioline su un microscopio a campo chiaro invertito.

Collegare la fase dell'olio lipidico al regolatore di pressione e aumentare la pressione fino a quando una goccia d'olio non fuoriesce dal tubo di punta. Collegare il tubo di picco all'ingresso due del chip microfluidico. Quindi, riempire completamente i chip microfluidici con la fase di olio lipidico dall'ingresso due.

Quindi, introdurre la fase acquosa a base di MRB-80 da quella di ingresso. Controlla la dimensione delle goccioline modificando la fase dell'olio lipidico e le pressioni della fase acquosa per creare goccioline con un diametro di circa 15 micron. Circa 800 millibar per la fase di olio lipidico e 200 millibar per la fase acquosa sono un buon punto di partenza.

Dopo aver ottenuto la dimensione delle goccioline desiderata, riempire completamente la cella di flusso con le goccioline. Queste goccioline si formano utilizzando piccoli volumi della fase acquosa. Ciò significa che l'impianto microfluidico deve funzionare rapidamente per non perdere l'intera fase acquosa prima che si siano formate goccioline della dimensione corretta.

Una volta riempita, chiudere con cura le estremità della cella a flusso utilizzando Valap. Se le goccioline non smettono di muoversi, la tenuta non è completa o potrebbero essere state introdotte bolle d'aria. Per l'imaging a lungo termine, trasferire le goccioline in una tazza PDMS e coprire con uno strato di miscela di lipidi oleosi.

Scongelare i centrosomi a temperatura ambiente e metterli a 37 gradi Celsius per 20 minuti per garantire una corretta nucleazione dei microtubuli. Durante l'attesa, preparare la miscela di saggio su ghiaccio. Questo dovrebbe contenere tubulina, GTP, un sistema di scavenger di ossigeno, generatori di forza molecolare come reticolanti di microtubuli, ATP e sistema di rigenerazione dell'ATP.

Una volta miscelato, far girare il campione nel rotore Airfuge raffreddato a 30 psi per tre minuti. Quindi, aggiungi i centrosomi preriscaldati al composto. Ottimizza la quantità di centrosomi aggiunti per ottenere uno o due centrosomi per gocciolina.

Quindi, utilizzare questa miscela per produrre goccioline di emulsione come descritto in precedenza. Al fine di reclutare la dineina per i lipidi biotinilati nella corteccia delle goccioline, includere GFP-dineina TMR e streptavidina nella fase acquosa. Su un microscopio confocale a disco rotante, visualizzare la crescita dei microtubuli dopo 30 minuti a 26 gradi Celsius.

Durante l'imaging, la crescita dei microtubuli può essere promossa aumentando la temperatura a 28 o addirittura 30 gradi Celsius. Per le proiezioni Z, prendi pile con intervalli di un micron, che dovrebbero richiedere circa 20 immagini per gocciolina. Vai al pannello principale della fotocamera, fai clic su Modifica Z e imposta Z Step su 1.0.

Fare clic su Avanti per memorizzare le impostazioni. Quindi, impostare il guadagno EM lineare massimo facendo clic sulla scheda Camera nel pannello Acquisizione e facendo scorrere la barra del guadagno EM su 300. Quindi, imposta Tempo di esposizione su 200 millisecondi nella stessa scheda.

Fare clic su Registra per memorizzare le impostazioni. Per gli esperimenti di imaging dal vivo, effettuare proiezioni Z ogni due minuti per due ore riducendo i tempi di esposizione a circa 100 millisecondi e aumentando gli intervalli Z a due micron. Per gli esperimenti di imaging dal vivo, utilizzare una coppa PDMS invece di una normale cella a flusso per la massima immobilizzazione del campione.

Utilizzando i protocolli descritti, la formazione di astro è stata studiata in goccioline di emulsione di acqua e olio contenenti centrosomi. Inizialmente, i centrosomi si diffondono liberamente all'interno dei volumi confinati. Dopo circa 20-30 minuti, i primi microtubuli diventano visibili e la diffusione del centrosoma si restringe man mano che i microtubuli crescono contro la corteccia in tutte le direzioni.

Quando i microtubuli crescono più lunghi della metà del diametro della gocciolina, i centrosomi vengono spinti a confini opposti, con i microtubuli che crescono lungo la corteccia della gocciolina. Senza streptavidina, la dimeina è diffusa all'interno della gocciolina. Tuttavia, con la streptavidina, entro circa 10 minuti dalla formazione delle goccioline, la dineina si collega ai lipidi biotinilati.

Quando si osserva la tubulina fluorescente in presenza di dineina corticale, è chiaro che i centrosomi sono posizionati centralmente. Mentre in assenza di dineina, i centrosomi vengono spinti ai lati opposti della gocciolina. Ciò è probabilmente dovuto alle catastrofi dei microtubuli che promuovono la dineina e alle forze di trazione corticale, che si traducono nella centratura degli astri.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le tecnologie microfluidiche per creare strutture simili a fusi in goccioline di emulsione sferica. Una volta padroneggiati, la formazione delle goccioline e l'imaging possono essere eseguiti in due o tre ore se eseguiti correttamente. Utilizzando questa procedura, è possibile incapsulare altri fattori di assemblaggio del mandrino per studiarne l'effetto sulla morfologia e sul posizionamento del fuso.

Precauzioni come indossare i guanti devono essere sempre prese durante l'uso del cloroformio o del PDMS.