Name: Su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (Nanotomy) di sana e feriti Zebrafish Cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri la nanotomia su larga scala per analizzare il cervello di zebrafish sano e ferito. Questa tecnica di microscopia elettronica a trasmissione offre risoluzione nanometrica per studiare neurodegenerazione e manutenzione immunitaria.

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La maggior parte del lavoro è stata eseguita presso la all&#39;UMCG Microscopia e Imaging Center (UMIC), che è sponsorizzato da NWO 175-010-2009-023 e ZonMw 91.111.006; STW &quot;Microscopia Valley 12718&quot; per BNGG. Questo lavoro è stato sponsorizzato da una sovvenzione ZonMw VENI, una borsa di studio di integrazione carriera Marie Curie (risparmio morendo neuroni) e una borsa di Alzheimer Nederland a TJvH

Tutti gli esperimenti con larve di zebrafish sono stati approvati dal Comitato di Sperimentazione Animale dell&#39;Università di Groningen secondo le direttive nazionali e comunitarie. Preparazione 1. Esempio <ol><li> Fissazione e Embedding <ol><li> Fissazione <ol><li> Anestetizzare larve di pesci in tricaine (0,003%) aggiunto alla E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7,6) acqua zebrafish e test per la profondità dell&#39;anestesia colpendo delicatamente con una punta di pipetta 200 microlitri al microscopio dissezione fino a quando il movimento non viene più rilevato (Figura 1A). </li><li> Durante l&#39;elaborazione di campioni per EM correlativo dopo l&#39;acquisizione di dati di imaging in vivo utilizzando confocale o immagini 2 fotoni a 1,8% agarosio come descritto, 5,15 correzione larve in agarosio utilizzando 4% PFA in PBS contenente Triton-X-100 (0,05%). </li><li> Tagliare le larve da agarosio e di processo perEM su larga scala 5. </li><li> Fix larve fresca 4% paraformaldeide in PBS contenente Triton-X-100 (0,05%) per 2 ore a temperatura ambiente in tubi di plastica. Nota: Le cellule in coltura (in vitro) può essere fissato direttamente in glutaraldeide, come descritto nel passaggio successivo (1.1.1.5). </li><li> Rimuovere la soluzione e aggiungere 100 microlitri 0,5% PFA, 2% glutaraldeide (GA), e 0,1 M cacodilato di sodio (pH 7,4). Conservare una notte a 4 ° C. campioni Sciacquare due volte in cacodilato 0,1 M di sodio. </li><li> Tagliare le teste larvali rostralmente per romboencefalo per facilitare la penetrazione di osmio. Utilizzare siringhe sottili / pinze. </li><li> Postfix larve in 1% tetrossido di osmio (OSO 4) /1.5% ferrocianuro di potassio (K 4 [Fe (CN) 6]) in 0,1 M cacodilato di sodio in ghiaccio per 2 ore e sciacquare 3 x 5 min a doppia H 2 O. distillata </li><li> Disidratare in etanolo per 20 min incubazioni in concentrazioni crescenti di etanolo (50%, 70%, 3 volte 100%). </li></ol></li><li>Incorporare <ol><li> Preparare resina epossidica secondo le ricette standard utilizzate nei laboratori EM. Nota: Usiamo resina epossidica come segue: mescolare 19,8 g glicidi etere 100, 9.6 g di 2-dodecenil succinica anidride dell&#39;acido e 11,4 g di anidride methylnadic con un agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 g DMP-30 (tris (dimetil) fenolo) e mescolare ancora. </li><li> Incubare larve notte in resina epossidica 50% in etanolo (v / v) durante la rotazione (RT). </li><li> Sostituire diluito resina epossidica con resina pura. Incubare per 30 minuti, aggiungere nuovamente resina fresca e incubare per altri 30 min. Ancora aggiornare la resina e quindi incubare 3 ore a RT, seguita da 15 minuti a 58 ° C ed un altro 1 ora a RT sotto bassa pressione (200 mbar). </li><li> Orientare le teste in stampi all&#39;incorporamento silicio piatta disponibili in commercio sotto un microscopio di dissezione con un ago o uno stuzzicadenti con anteriore rivolta verso il lato dello stampo o quando necessario (Figura 1B). </li><li> Polimerizzare res epossidichein una notte a 58 ° C. Se la resina epossidica è ancora troppo morbido permettere un altro giorno per polimerizzare e indurire a 58 ° C. Test di rigidità facendo pressione con pinze. Se questo lascia facilmente una rientranza permettono un altro giorno per polimerizzare e indurire a 58 ° C. Quando campione è completamente indurito procedere al taglio e sezionamento. </li><li> Tagliare via la resina in eccesso dalle stub usando lame di rasoio (Figura 1B). </li></ol></li></ol></li><li> Sezionamento, a contrasto, e di montaggio <ol><li> sezionamento <ol><li> blocco di resina epossidica Sezione utilizzando un ultramicrotomo. </li><li> Utilizzare un coltello di vetro o un histoknife diamante per tagliare sezioni semisottili (500 nm) per toluidina blu fucsina / base (Figura 1D) colorazione per rilevare il corretto posizionamento. </li><li> Trasferimento semi-sottili sezioni su preparati microscopici di raccoglierli con una pipetta Pasteur di vetro la cui punta è stato chiuso per fusione in una fiamma. Asciutto su una piastra calda uino senza acqua è a sinistra. Macchia per 10 secondi con 1% blu toluidina in acqua su una piastra calda e dopo il risciacquo con acqua, macchia per 10 secondi con 0,05% fucsina base in tetraborato di sodio 1%. Esaminare con un normale microscopio ottico a 10X a 40X. </li><li> Quando viene raggiunta la corretta sito / orientamento all&#39;interno del cervello, continua sezionare il blocco di resina epossidica con una lama di diamante per tagliare sezioni ultrasottili (~ 70 nm; Figura 1E) </li><li> Utilizzare strutture anatomiche facilmente identificabili in e intorno al cervello, compresi pozzi olfattive, occhi, frontiere materia grigia-bianco, per identificare la regione di interesse durante ultrasottile sezionamento e per regolare l&#39;angolo di taglio quando il campione è inclinato. </li><li> Sezione Monte su griglie L2 x 1 rame singola scanalatura (Figura 1F), per consentire l&#39;acquisizione ininterrotto dalle barre della griglia. Utilizzare Formvar griglie rivestite per sostenere le sezioni. </li></ol></li><li> contrasto <ol><li> sezioni ultrasottili macchia sulla griglias per 2 minuti in 2% acetato di uranile in metanolo seguita da Reynolds citrato di piombo per altri 2 min 16. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Acquisizione di immagini <ol><li> Grande STEM Scale Nota: Usiamo la scansione EM con un generatore di scansione esterna in grado di acquisire più grandi campi di vista ad alta risoluzione 3,5,7,17 ​​utilizzando il rilevamento staminali. In genere, una immagine generato in questo modo è equivalente ai campi di vista di circa 100 immagini Transmission Electron Microscope (TEM), riducendo in modo significativo la quantità di cuciture. <ol><li> Montaggio del campione in microscopio <ol><li> Posizionare griglia con sezione nel portacampioni griglia multipla e trasferire nella camera del SEM. </li></ol></li><li> Allineamento del rilevatore STEM <ol><li> Mettere la griglia con il campione sotto la trave e spostarlo in modo che sarà circa. 5 mm dalla pole lenti. Acquisire un&#39;immagine a 20 kV utilizzandoil rilevatore in-lente. </li><li> Focus sul bordo della griglia e regolare distanza di lavoro di 4,0 mm. </li><li> Spostare il supporto del campione ad una posizione sicura e portare nel rivelatore STEM. </li><li> Centrare il foro del rivelatore STEM nell&#39;immagine campo girando le viti regolazioni mentre immagini alla massima velocità con il rilevatore in-lente. </li><li> riportare delicatamente indietro il supporto del campione, che sarà solo in forma tra il polo della lente e il rivelatore. </li><li> Acquisire un&#39;immagine con il rilevatore in-lente per essere sicuri di essere sulla area della sezione. </li><li> Passa per arginare il rilevamento (mezzo di guadagno e tutti i quadranti impostati su &#39;minus&#39;) e acquisire un&#39;immagine e selezionare l&#39;area da sottoporre a scansione. </li><li> Sollevare tensione di accelerazione di 21 kV e attendere la stabilizzazione del fascio (un&#39;immagine stabile di nuovo) e poi andare a 29 kV in passi di 2 kV. </li></ol></li><li> Acquisizione Immagini <ol><li> Pre-irradiare il campione (per evitare modifiche di luminosità provocate dalla e-beam) per lo zoomfuori così l&#39;intera area da sottoporre a scansione adatta la finestra dell&#39;immagine. </li><li> Cambiare l&#39;apertura a 120 micron (per mantenere la gamma dinamica corretta i guadagni rilevatore devono essere ridotti ad un passo). </li><li> De-focus per cui l&#39;immagine è sfocata. </li><li> Rendere l&#39;area sottoposta a scansione il più stretto possibile con l&#39;opzione di scansione area ridotta. </li><li> Imposta velocità di scansione in modo tale che un frame viene analizzato in ca. 1 - 2 sec. Nota: A seconda delle dimensioni e del tessuto che assume tipicamente ½ ora (100 x 100 micron FOV) fino a 3 ore (1.000 x 500 micron). </li><li> Zoom in almeno 100X e la scansione di una piccola area per 10 sec. Nota: quando questa zona non cambia luminosità rispetto ai suoi dintorni, pre-irradiazione è sufficiente. </li><li> Riportare l&#39;apertura 30 micron (e lo stelo guadagno il fluido) </li><li> Mettere a fuoco il campione. </li><li> Allineare l&#39;apertura utilizzando il disco oscillante (a ~ 40,000X ingrandimenti). </li><li> Mentre a fuoco selezionare il più leggero zona / funzione, impostare la velocità di scansione in modo tale che i dettaglisono visibili. </li><li> Nel software microscopio regolare la luminosità e il contrasto guardando con attenzione l&#39;istogramma per mantenere tutti i pixel nella gamma dinamica. Fare lo stesso per più bui dell&#39;area / caratteristiche. </li><li> Torna alla zona luminosa e prova di nuovo. Essere sul sicuro quindi c&#39;è qualche spazio su entrambi i lati dell&#39;istogramma. </li><li> Diminuire così l&#39;intera area da sottoporre a scansione adatta alla finestra di imaging, e avviare il programma di grandi dimensioni di acquisizione dell&#39;area. </li><li> Utilizzare l&#39;opzione procedura guidata per configurare un mosaico selezionando un&#39;area dallo schermo. Usa dimensione dei pixel 2-5 nm a seconda di ciò sono necessari dettagli. Utilizzare tempo di sosta 3 ms per STEM. </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;messa a fuoco automatica su piastrelle precedente&quot;, utilizzare il software di acquisizione scala messa a fuoco automatica di grandi dimensioni con le impostazioni di default aziendali, la casella di controllo &quot;, verificare l&#39;impostazione prima dell&#39;esecuzione&quot; e definire dove salvare i dati. </li><li> Premere &quot;ottimizzare&quot; per controllare le impostazioni del microscopio. Nota: Ora il tempo necessario sarà shproprio. Questo potrebbe essere fino a 72 ore per 1 x 0,5 mm aree. </li><li> Nella finestra di tipo &quot;risoluzione massima tile&quot; 20.000 così singole tessere non saranno più grandi di 20k x 20k, evitando effetti di bordo smussato. Premere &quot;esecuzione&quot;. </li><li> Quando è stato chiesto per il controllo messa a fuoco e Luminosità / Contrasto (B / C), spegnere generatore di scansione esterna e con attenzione la messa a fuoco e l&#39;astigmatismo nel software microscopio. Non cambiare B / C. Nota: La fase può essere spostato e l&#39;ingrandimento cambiato, ma l&#39;ingrandimento deve essere arretrato per la dimensione in pixel desiderata. </li><li> Accendere generatore di scansione esterna di nuovo e premere il tasto &quot;continua&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> Analisi 3. Dati <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aprire il programma visualizzatore di file EM su larga scala e aprire il file &quot;informazioni mosaico&quot;. Si aprirà tutti i TIF file di tegole. Questa preferenza viene eseguita su un&#39;altra stazione di lavoro di non ostacolare nuove acquisizioni. </li><li> Scegliere l&#39;opzione &#39;aucucire intero mosaico (parametri modalità sovrappongono sul mezzo, cuciture soglia di 0,90, la riduzione automatica del rumore. Nel caso i criteri di cucitura non può essere soddisfatta, zoom in e posizionare manualmente piastrelle in posizione e fare clic su &#39;continuare come è&#39;). </li><li> Esporta come file HTML, o in alternativa come un unico TIF. Si noti che per l&#39;esportazione TIF potrebbe essere necessario un ridimensionamento. Includere la dimensione dei pixel finale nel nome del file che consente misurazioni più tardi. </li><li> Eseguire le annotazioni nel file TIF aprendolo in un programma di editing di immagini. In parallelo, aprire il file html stradale in un browser Web per l&#39;osservazione ottimale risoluzione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

EM permette l&#39;analisi del contesto cellulare con imaging ad alta risoluzione delle macromolecole in contesto biologico. Tuttavia, questo limita tipicamente il campo visivo. Scala più ampia 3D EM è particolarmente adatto per la connettività mappatura neuronale con la creazione di risoluzione nanometrica 3 ricostruzioni tridimensionali, che richiedono un trattamento di dati complessi 10. Al contrario, 2D su larga scala EM richiede solo una singola sezione e cucitura dei dati di imaging, e la valutazione dei dati è possibile da chiunque abbia accesso ad un browser Internet. Noi e gli altri utilizzati in precedenza EM su larga scala per analizzare i tessuti e animali interi. Per quanto riguarda la maggior parte degli approcci, TEM e cuciture SEM-based non hanno i loro vantaggi. Qui, la trasmissione scansione EM (STEM) è stato utilizzato che consente la generazione di un ampio campo visivo ad alta risoluzione. In genere, una sola immagine STEM è equivalente ai campi di vista di circa 100 immagini TEM, riducendo in modo significativo la quantità di cucitura quando l&#39;imaging grande fields di vista ad alta risoluzione. Se è necessaria una maggiore risoluzione, TEM può essere vantaggioso. STEM ha il vantaggio rispetto TEM che i campioni non contrastata possono essere utilizzati con un buon contrasto ultrastrutturale 6. Inoltre, il metodo descritto qui può essere regolato semplicemente per l&#39;uso con il rilevamento elettronico ridiffusa (BSD) su sezioni montate su wafer di silicio, ampliando l&#39;uso di più sistemi microscopio. Tessuti HTML-stradale file EM sono molto utili per la quantificazione, la condivisione di dati che non possono essere stati analizzati per il contenuto completo, che unisce LM e dati EM (CLEM) 8, scopo di presentazione nella ricerca scientifica, per analizzare i dati dei pazienti, e per l&#39;istruzione. In alternativa, in EM larga scala in un SEM, ma non in un TEM, wafer silice può essere usato, che ha due vantaggi principali: BSD può essere utilizzato, più generalmente disponibile sui microscopi a scansione elettronica di STEM rilevamento. In secondo luogo, il montaggio di grandi sezioni (&gt; 1 mm 2 aree diinteressi) è semplice. Montaggio su griglie a fessura singoli è laborioso e tecnicamente impegnativo. Confronto dettagliato tra TEM, SEM e STEM è dettagliato altrove 6. Uno svantaggio di immagini BSD è che, rispetto al gambo, le immagini sono aumentati del rumore. Questo può essere in parte compensato aumentando il tempo di permanenza del pixel, con conseguente tempi di acquisizione più lunghi. Anche se per la preparazione dei campioni di elaborazione relativamente standard EM (fissazione, inclusione e sezionamento) è necessaria 5-7, è tecnicamente impegnativo per tagliare grandi sezioni ultrasottili completamente priva di artefatti. Le sezioni sono molto fragili, si rompono facilmente, piegare o vengono distrutti durante l&#39;imaging, che richiede in genere più ore al set di dati. Tuttavia, a causa della condivisione online dei dati grezzi imparziali, dovrebbe diventare possibile confrontare più facilmente i dati pubblicati, e utilizzare set di dati pubblicati nel dominio aperta come controlli. Attualmente, pochi dispositivi in ​​grado di EM laanalisi RGE scala sono in uso, e quindi l&#39;accessibilità a questa tecnica è piuttosto limitata, anche se la maggior parte dei centri di imaging accolgono gli sforzi di collaborazione. Per le sezioni larga scala il tessuto deve essere fissata correttamente in tutto il campione. Ecco perché una miscela di veloce ma moderata fissativo PFA è usato in combinazione con la lenta ma forte fissativo GA. Taglio e raccogliendo grandi sezioni senza artefatti è difficile. Lavorare con le cialde in combinazione con BSD è più facile rispetto alla raccolta sezioni su griglie singole buche. Heavy post di metallo colorazione è più critica rispetto a EM classica. Poiché l&#39;intera sezione viene esposta ogni manufatto sarà visibile. utenti TEM tipicamente trovano difficoltà a passare ad un SEM, a causa della differenza di funzionamento microscopio. La quantificazione e la condivisione dei dati - Quantificare caratteristiche subcellulari è difficile in singole immagini EM. La possibilità di ingrandire e rimpicciolire su larga scalaimmagini permette facilmente l&#39;identificazione delle cellule di interesse, che possono essere seguiti da misurazioni su scala nanometrica all&#39;interno delle cellule. Questi set di dati indicano che specifici tipi di cellule possono essere rapidamente identificati e quantificati in modo imparziale in questi grandi sezioni di tessuto, sulla base di caratteristiche rilevabili a scale diverse. Per esempio microglia possono essere identificati in base alla loro morfologia e citoplasma denso. Successivamente, dopo lo zoom sulle singole cellule, su scala nanometrica caratteristiche subcellulari e molecolari di queste cellule possono essere misurati all&#39;interno dello stesso insieme di dati, come abbiamo dimostrato in precedenza per la larghezza ER all&#39;interno di una grande scala del tessuto EM cultura dataset 2. Un ulteriore vantaggio del nanotomy è quello di hosting di set di dati di grandi dimensioni in linea permetterà ad altri di esaminare i dati, forse per altre funzioni, e trarre le conclusioni sulla nuova ipotesi. CLEM - Oltre a facilitare EM quantitativa, EM larga scala rende più facile da correlare microsco luceetichettatura pic a livello EM 8. Nel presente esempio è mostrato la presenza di microglia fagocitiche in un modello di ablazione zebrafish. Una questione importante nel campo delle neuroscienze è quello che le singole funzioni e contributi sono di microglia e potenziali altre fonti di fagocitosi e di cellule immunitarie. I primi studi EM hanno dimostrato caratteristiche distintive subcellulare di microglia nella malattia 18. Purtroppo, è difficile etichettare selettivamente microglia in particolare in un ambiente patologico, in quanto presentano un&#39;ampia sovrapposizione con altre cellule immunitarie nella espressione genica, la morfologia e la funzione. Pertanto, non è chiaro se e quando microglia a livello ultrastrutturale differiscono dalle cellule immunitarie da altre fonti, monociti infiltranti derivato macrofagi. Capire se ci sono differenze ultrastrutturali tra queste cellule forniranno un punto di partenza per l&#39;analisi delle differenze funzionali. La combinazione di marcatori transgenici o l&#39;espressione selettiva e CLEM permette detezione di caratteristiche ultrastrutturali selettive per specifiche popolazioni. Diagnosi e la presentazione e l&#39;educazione - Visualizzando nanoscala a microscala all&#39;interno di un unico set di dati di dati EM è notevolmente facilitato ad un vasto pubblico. Con l&#39;aumento delle possibilità e gli strumenti per EM correlativa e su larga scala ci aspettiamo una ripresa di EM nella ricerca di base e medica. Il nostro metodo qui rappresentata viene applicato ad un modello di lesione cerebrale zebrafish 5, ma è stato usato il tessuto umano 7, cervello di ratto 3, in un modello di ratto per il diabete 4 e in coltura cellulare 2, e può essere utilizzato anche in combinazione con un TEM approccio basato il 1 mostra la versatilità di questo metodo. L&#39;operatore al microscopio non è più la registrazione altamente selezionati, e le immagini, quindi, di parte, ma tutte le numerose caratteristiche ultrastrutturali sono registrati e aperto per l&#39;analisi di tutto il mondo.

Recenti sviluppi tecnici hanno migliorato la versatilità, l&#39;applicabilità e la natura quantitativa di EM, che porta a una rinascita di analisi ultrastrutturale. I progressi includono 3D EM, su larga scala 2D EM e metodi migliorati e reagenti per correlato luce microscopia e microscopia elettronica (CLEM) per confrontare altre modalità di analisi microscopica direttamente al livello EM 8-10. Su larga scala 2D EM è particolarmente adatto per quantificare o identificare (romanzo) caratteristiche della malattia di patologia umana, lo studio di modelli animali per i modelli di malattia e di coltura dei tessuti. A causa tipicamente piccolo campo di vista è difficile correlare i cambiamenti ad alto ingrandimento ad una vasta scala di tessuto, nonché unbiasedly e quantitativamente analizzare caratteristiche ultrastrutturali. Per l&#39;analisi patologica di tessuto umano o la valutazione della patologia in modelli animali, ematossilina e eosina (H &amp; E) colorato sezioni di formaldeide paraffina fisso incorporato (FFPE) tisSue è lo standard. Oltre semplice colorazione H &amp; E immunomarcatura viene eseguita anche per identificare le anomalie patologiche. Se tali tessuti possono essere analizzate a livello EM, specifici tipi cellulari, e potrebbero essere identificati modifiche subcellulari. La natura imparziale della EM larga scala permette di trovare caratteristiche inaspettate e nuove di malattia. In larga scala aree em up a millimetri quadrati possono essere visualizzati. Noi e gli altri in precedenza nanotomy di ratto isole pancreatiche 4, coltura cellulare 2, cervello di ratto 3, della pelle e delle mucose 7 e tutto larve di pesce zebra 1,5 (www.nanotomy.org) applicato. Zebrafish sono molto adatto per l&#39;imaging in vivo, in particolare per visualizzare tipi di cellule che sono di difficile accesso nei tessuti dei mammiferi compreso cerebrali cellule immunitarie 11. Qui la procedura nanotomy è descritta in dettaglio, applicato a sezioni coronali di teste zebrafish sottoposti condizionale ablazione neuronale mediante conversione di metronidazolo da neuronaleespresso nitroreduttasi (www.nanotomy.org) 5,12-14. Tutti i dati grezzi si presenta come file HTML zoomabile, la visualizzazione molecolare per cambiamenti di scala dei tessuti. La presentazione dei dati grezzi permette analisi imparziali di set di dati provenienti da altre angolazioni da parte di esperti di tutto il mondo.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>basso punto di fusione agarosio</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>tricaina</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeide</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>cacodilato di sodio</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>tetrossido di osmio</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>ferrocianuro di potassio (K4[Fe(CN)]6)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>acetato di uranile&nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>tetraborato di sodio</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>blu toluidene</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>fucsina basica</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>citrato di piombo</td><td>BDH</td><td>fuori produzione</td><td></td></tr><tr><td><forte>EPON</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-anidride di acido dodecenilsuccinico&nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>anidride metilnadica</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>etere glicidico 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>standard piatto per inclusione stampo</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>coltello diamantato</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>griglie in rame&nbsp;</td>Nastro biadesivo in carbonio <td>per le scienze</td><td></td><td></td>della microscopia</tr><tr><td>elettronica&nbsp;</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scansione EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultramicrotomo Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlante generatore di scansione esterno&nbsp;</td><td>Fibics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (nanotomy) di sana e feriti zebrafish cervello

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Su larga scala di elettroni 2D microscopia (EM), o nanotomy, è l&#39;applicazione a livello dei tessuti della microscopia elettronica risoluzione nanometrica. Altri e abbiamo precedentemente applicati EM su larga scala a pelle umana isole pancreatiche, coltura di tessuti e tutta larve di zebrafish 1-7. Qui si descrive un metodo universalmente applicabile per la scansione dei tessuti scala EM per la rilevazione imparziale delle caratteristiche sub-cellulari e molecolari. Nanotomy è stata applicata per indagare il sano e un cervello zebrafish neurodegenerativa. Il nostro metodo si basa su protocolli di preparazione del campione standardizzati EM: Fixation con glutaraldeide e osmio, seguita da embedding resina epossidica, ultrasottile sezionamento e montaggio di ultrasottili-sezioni di griglie di un foro, seguita da colorazione con posta uranile e piombo. Su larga scala le immagini 2D EM mosaico vengono acquisite utilizzando una scansione EM collegato ad un generatore di un&#39;ampia area di scansione esterna usando EM trasmissione scansione (STEM). Su larga scala le immagini EM sono in genere ~ 5 - 50 G pixel Idimensione n, e ottimizzato per l&#39;utilizzo di file HTML zoomabile, che possono essere aperti in qualsiasi browser web, simili a carte geografiche HTML on-line. Questo metodo può essere applicato al tessuto (umano), sezioni trasversali di animali interi nonché coltura tissutale 1-5. Qui, cervelli zebrafish sono stati analizzati in un modello di ablazione neuronale non invasivo. Visualizziamo all&#39;interno di un unico tessuto set di dati, cellulare e subcellulare cambiamenti che può essere quantificato in vari tipi di cellule, tra cui i neuroni e microglia, i macrofagi del cervello. Inoltre, nanotomy facilita la correlazione di EM con microscopia ottica (CLEM) 8 sul tessuto stesso, come grandi superfici precedentemente ripreso con microscopia a fluorescenza, può essere successivamente sottoposto a grande area EM, conseguente nano-anatomia (nanotomy) di tessuti. In tutto, nanotomy permette la rilevazione imparziale di funzioni a livello EM in maniera quantificabile a livello dei tessuti.

Su larga scala EM set di dati di sezioni coronali del capo di 1 settimane di età larve di zebrafish mostra molti dei tessuti e le caratteristiche cellulari singola immagine larga scala in (www.nanotomy.org). Nanotomy di sezioni di cervello di controllo rivela caratteristiche tipiche ultrastrutturali del tessuto neurale del cervello anteriore rostrale tra cui fasci di fibre, olfattive nuclei neuronali e neuronali sub-comparti tra cui sinapsi (Figura 2A, www.nanotomy.org). tipi di cellule nella testa, che possono essere distinti includono condrociti con grandi vacuoli nella mascella inferiore, mielina osmiophilic delle cellule nervose olfattive, cellule endoteliali di una piccola imbarcazione, strutture includono la meninge (la controparte zebrafish delle meningi, lo strato membranoso encasing il cervello dei mammiferi). strutture subcellulari includono glicocalice dell&#39;epidermide, diverse morfologie nucleari e focolai in diversi cel<html> tipi L e organelli, tra cui apparato di Golgi, reticolo endoplasmatico (ER), mitocondri e vescicole sinaptiche e densità post-sinaptica. Inaspettatamente i nuclei delle cellule che rivestono ventricolo sono molto elettroni dense rispetto ad altre cellule disperse più lateralmente nel cervello. Inoltre, questi nuclei ventricolari mostrano focolai scura che sono assenti in altre cellule del cervello e appaiono diverse per dimensioni e struttura dal heterochromatin, che si trova in nuclei di microglia fagociti (Figura 2). Cellule che rivestono il ventricolo nello sviluppo di zebrafish sono cellule gliali radiali per lo più e progenitori neuronali, che può riflettere uno stato della cromatina alterata di cellule più differenziate. Come le cellule staminali nel tessuto sono generalmente abbastanza rari, nanotomy di correlare l&#39;etichettatura dei tessuti per i marcatori di cellule staminali con scala tessuto EM potrebbe quindi essere utilizzato per identificare caratteristiche ultrastrutturali delle cellule staminali. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; su larga scala EM (www.nanotomy.org) di una sezione coronale in una larva zebrafish fase di ablazione neuronale rivela molti tessuti specifici, e le caratteristiche cellulari e molecolari che non si trovano in animali di controllo. caratteristiche cellulari includono microglia fagociti e vacuoli le dimensioni delle cellule, probabilmente rappresentano cellule morenti (Figura 2b, www.nanotomy.org). precedenti studi hanno identificato EM microglia nei vertebrati 18,19. caratteristiche dei microglia includono nuclei allungati , ciuffi di cromatina chiazze vicino alla membrana nucleare, apparato di Golgi prominente, poliribosomi liberi, granulari reticolo endoplasmatico (ER) con una lunga cisterne stretto, relativamente scura densa citoplasma / e numerose inclusioni, come phagosomes, gocce lipidiche e lisosomi. Tutti questi caratteristiche, attribuiti a microglia nei tessuti dei mammiferi, sono stati trovati anche in queste cellule nel cervello di zebrafish (Figura 2b, www.nanotomy.org). &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> Figura 1: Flusso di lavoro di tessuto larga scala microscopia elettronica a Brains Zebrafish. (A) 7 giorni vecchio larva zebrafish. (B) Zebrafish teste larvali incorporati fianco a fianco in resina epossidica. Coltello (C) vetro per semi-sottile sezionamento e orientare il campione. Rappresentante semisottile blu di toluidina sezione colorato che mostra due (D) side-by-side integrato larve di pesce zebra. (E) diamante coltello per tagliare ultrasottili sezioni (70 nm). (F) immagine modificata in (D) di tutta la sezione del cervello larve zebrafish sulla griglia da un unico foro per indicare il posizionamento. (G) sistema di Microscopia utilizzato su larga scala 2D EM in questo studio. (H) Flusso di elaborazione delle immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui</a>per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . Figura 2: Nanotomy Risultati:. Da macromolecola al tessuto (A) Nanotomy del cervello di 7 giorni di controllo dopo la fecondazione e (B) trattati (ablazione neuronale; Figura 1), che mostra le caratteristiche specifiche del neuronale ablated degenerativa del cervello (B) Questi includere microglia fagociti, cellule scure sottoposti morte cellulare e l&#39;aspetto spugnoso del tessuto neurale ((A) e (B)). Pannelli superiori (adattati da 5): 10X vista ingrandita della regione indicati in pannelli centrali. Pannelli di cuore: vista 10 volte ingrandita della regione indicati in pannelli inferiori. (A, pannello centrale) Vista di alto ingrandimento neuropil mostrando sinapsi in (A, pannello inferiore), vescicole sinaptiche (SVS) edensità postsinaptica (PD). (B, pannello centrale) vista Alto ingrandimento della microglia ameboidi o, eventualmente, un macrofago (pannello centrale, M) che mostra caratteristiche tipiche ameboidi microgliali (pannello inferiore) tra cui Golgi di primo piano (G), inclusioni tra cui vacuoli lisosomiali (L). Barre di scala: 50 micron (in alto), 5 micron (al centro) e 0,5 micron (in basso). Questo dato è stato modificato da 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura</a> , o visitare i dati on-line completo (nanotomy.org).

La microscopia elettronica 2D su larga scala (EM), o nanotomia, è l'applicazione tissutale della risoluzione EM su scala nanometrica. Qui descriviamo un metodo universale per la nanotomia applicato per studiare il cervello larvale di zebrafish in salute e su lesioni cerebrali non invasive.

Su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (Nanotomy) di sana e feriti Zebrafish Cervello

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

L'obiettivo generale di questo esperimento su larga scala di microscopia elettronica o di nanotomia è definire le alterazioni dal livello macromolecolare a quello tissutale, nel caso specifico nel cervello del pesce zebra in degenerazione. La nanotomia può contribuire a rispondere a domande fondamentali nelle scienze della vita, ad esempio nella ricerca sulla neurodegenerazione e sul diabete di tipo 1.Il vantaggio principale della nanotomia è che vengono acquisite informazioni prive di bias, che spaziano da macromolecole, organelli, cellule fino ai tessuti. Questo consente la quantificazione e la condivisione aperta dei dati tramite nanotomy.org. Sebbene la nanotomia fornisca informazioni sul mantenimento immunitario e sulla microglia nel cervello neurodegenerativo del pesce zebra, essa viene applicata anche ad altri modelli di malattia, inclusi colture cellulari, topo e persino tessuti umani.Generalmente, i ricercatori alle prime armi con questa tecnica incontrano difficoltà a causa della quantità di dati, che risulta schiacciante. Tale quantità può essere mille volte superiore rispetto a quella ottenuta con la microscopia elettronica tradizionale. Dopo aver fissato le larve di zebrafish secondo il protocollo descritto nel testo, tagliare le teste larvali in posizione rostrale rispetto al rombencefalo per facilitare la penetrazione dell'osmio. Collocare le larve in una soluzione di tetraossido di osmio al 1%, ferrocianuro di potassio all'1,5%, in cacodilato sodico 0,1 molare e incubare sul ghiaccio per due ore.Quindi utilizzare acqua bidistillata per risciacquare gli embrioni tre volte, per cinque minuti ogni volta. Prima dell'inclusione, i campioni devono essere disidratati in una serie di etanolo. Per includere gli embrioni, dopo averli incubati in resina epossidica diluita durante la notte secondo il protocollo descritto, rimuovere la resina diluita e sostituirla con resina pura.Incubare per 30 minuti, quindi sostituire la resina una seconda volta e incubare per altri 30 minuti. Dopo aver rinnovato la resina per la terza volta, incubare a temperatura ambiente per tre ore. Successivamente, incubare a 58 gradi Celsius per 15 minuti.Infine, incubare sotto pressione ridotta a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare un ago o uno stuzzicadenti per orientare le teste in stampi per inclusione piani in silicone disponibili in commercio. Quindi polimerizzare la resina epossidica a 58 gradi Celsius per tutta la notte.Quando il campione è completamente indurito, utilizzare lame di rasoio per rimuovere la resina in eccesso dal supporto. Per individuare la corretta posizione, utilizzare un coltello di vetro o un coltello istologico in diamante su un ultramicrotomo per tagliare sezioni semipiatte di larve per la colorazione con blu di toluidina/fucsina basica. Trasferire le sezioni semipiatte sui vetrini microscopici raccogliendole con una pipetta Pasteur di vetro il cui estremo è stato chiuso fondendolo in una fiamma.Asciugare su una piastra riscaldante fino a quando non rimane acqua. Successivamente, posizionare i campioni in una soluzione acquosa al 1% di blu di toluidina e incubare le sezioni su una piastra riscaldante per 10 secondi per colorarle. Poi, dopo aver sciacquato le sezioni con acqua, colorare i campioni con fucsina basica allo 0,5% in tetraborato di sodio all'1% per altri 10 secondi.Con un microscopio ottico normale a 10X-40X, esaminare i campioni. Una volta raggiunto il sito o l'orientamento corretto, utilizzare strutture anatomiche facilmente identificabili, come le fossette olfattive, gli occhi o i confini tra materia grigia e bianca, per identificare l'area cerebrale di interesse durante la sezione ultrasottile e per regolare l'angolo di taglio quando il campione è inclinato. Continuare il taglio del blocco in resina epossidica con un coltello al diamante per ottenere sezioni ultrasottili di 70 nanometri.Montare ciascuna sezione su una griglia di rame codificata a barre con un singolo alloggiamento L2 per forma 1, in modo da consentire l'acquisizione senza interruzioni causate dalle sbarre della griglia. Un millimetro quadrato può sembrare piccolo. Entrerà esattamente nell'apertura.In questo modo, evitiamo che le sbarre della griglia ostruiscano il nostro campione. Tieni presente che tutti gli artefatti introdotti nel campione verranno registrati, a differenza della microscopia elettronica tradizionale. Contrasta i campioni con metalli pesanti seguendo il protocollo descritto nel testo e conservali in una scatola per griglie. Per montare il campione nel microscopio elettronico a scansione, o SEM, posiziona la griglia dalla scatola di trasferimento, con la sezione, nel portacampione per griglie multiple e trasferiscilo nella camera del SEM.Dopo aver allineato il rivelatore secondo il protocollo descritto, preirradiare il campione eseguendo uno zoom indietro in modo che l'intera area da scansionare rientri nella finestra dell'immagine. Una volta modificata l'apertura a 120 micrometri e sfocata l'immagine, utilizzare l'opzione di scansione di area ridotta per rendere l'area scansionata il più possibile stretta. Successivamente, impostare la frequenza dei fotogrammi in modo da scansionare il fotogramma in circa uno-due secondi.Quindi effettuare uno zoom di almeno 100X e scansionare una piccola area per 10 secondi. Se la luminosità nell'area continua a cambiare, proseguire la pre-irradiazione. Quando questa area non presenta variazioni di luminosità rispetto all'ambiente circostante, la pre-irradiazione è sufficiente.Mantenendo la messa a fuoco, selezionare l'area o la caratteristica più chiara e impostare la velocità di scansione in modo che i dettagli siano visibili. Nel software del microscopio, regolare luminosità e contrasto osservando attentamente l'istogramma per mantenere tutti i pixel entro il range dinamico. Procedere allo stesso modo per le aree e le caratteristiche più scure.Torna nell'area luminosa e verifica nuovamente che ci sia spazio su entrambi i lati dell'istogramma. Per i passaggi da quattro sei a quattro otto, l'aggiustamento della luminosità e del contrasto deve essere eseguito con molta attenzione in modo che l'intera area rientri nel campo dinamico. Riduci lo zoom in modo che l'intera area da scansionare si adatti alla finestra di immagine e avvia il programma di acquisizione su vasta area.Quindi utilizzare l'opzione della procedura guidata per impostare un mosaico selezionando un'area dallo schermo. Utilizzare una dimensione del pixel compresa tra due e cinque nanometri, a seconda dei dettagli necessari, e impostare un tempo di permanenza di tre microsecondi per la microscopia elettronica a trasmissione in scansione, o STEM. Premere ottimizza per verificare le impostazioni del microscopio e verrà visualizzato il tempo necessario.Quindi riaccendere nuovamente il generatore di scansione esterno e premere continua. Per analizzare i dati STEM, aprire un programma visualizzatore di file EM su larga scala ed aprire il file denominato informazioni sul mosaico, che aprirà i file tif affiancati. Selezionare l'opzione Unisci automaticamente l'intero mosaico e scegliere i seguenti parametri: modalità di sovrapposizione pari a metà, soglia di unione pari a 0,90 e riduzione del rumore pari ad automatica.Se i criteri di assemblaggio non possono essere soddisfatti, eseguire uno zoom e posizionare manualmente il campo nella posizione desiderata, quindi fare clic su Continua così com'è. Esportare i dati come file HTML o come singolo file tif. Includere la dimensione finale del pixel e il nome del file per consentire misurazioni successive, quindi analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo. Come mostrato qui, la nanotomia di sezioni cerebrali di controllo rivela caratteristiche ultrastrutturali tipiche del tessuto neurale del proencefalo rostrale, inclusi fasci di fibre olfattive, nuclei neuronali e sottocompartimenti neuronali quali le sinapsi.Qui, le strutture subcellulari includono diverse morfologie nucleari e foci in diversi tipi cellulari e organelli, tra cui apparato di Golgi, reticolo endoplasmatico, mitocondri, vescicole sinaptiche e densità post-sinaptiche. Inaspettatamente, i nuclei delle cellule che rivestono il ventricolo sono molto densi in elettroni rispetto ad altre cellule disperse più lateralmente nel cervello. Nelle microglia, i nuclei mostrano anche foci scuri, probabilmente eterocromatina, che sono assenti in altre cellule del cervello.Questa immagine ottenuta da una microscopia elettronica su larga scala di una sezione coronale in un larva di pesce zebra sottoposto ad ablazione neuronale rivela microglia fagocitica. In queste cellule sono state riscontrate anche caratteristiche tipiche della microglia nelle cellule dei mammiferi, tra cui un apparato di Golgi ben evidente e numerose inclusioni come i lisosomi. Una volta acquisita padronanza, l'acquisizione può essere completata entro un giorno, mentre con la microscopia elettronica tradizionale si impiegherebbe almeno una settimana.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è fondamentale che l'operatore del microscopio svolga un ruolo cruciale per ottenere immagini di alta qualità. Non si tratta semplicemente di una tecnica che richiede di premere un pulsante. Ora abbiamo applicato la nanotomia non solo al modello di degenerazione neuronale del pesce zebra, ma l'abbiamo utilizzata anche per l'etichettatura immunologica delle cellule e per lo studio di tessuti di moscerini, tessuti umani e altro ancora.Questa tecnica apre la strada a ricercatori di qualsiasi settore. Essi possono riesaminare i set di dati online su nanotomy.org. Potranno quindi esplorare alterazioni putative, che vanno dalla scala nanometrica a quella millimetrica, e tutti i modelli studiati.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare la nanotomia alla tua domanda di ricerca e al sistema cellulare o tissutale che stai studiando. Non dimenticare che solo un professionista dovrebbe eseguire la preparazione dei campioni a causa dei reagenti tossici e delle considerazioni etiche, ma chiunque può provare il sito web nanotomy.org da casa.

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Biologia dello sviluppo

In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Questo video descrive la tecnica di microdissezione del cervello da un pesce zebra adulto. Questo metodo aiuta a ottenere neuorosfere derivate dall'intero cervello che possono essere studiate ulteriormente.

Dissezione cerebrale del pesce zebra: una tecnica di neurobiologia dei pesci

Questo video mostra un metodo per studiare la lesione cerebrale larvale del pesce zebra utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione su larga scala (STEM), una tecnica che combina elementi di microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per produrre immagini ad alta risoluzione. Descrive le fasi coinvolte nella preparazione dei campioni e nell'acquisizione di immagini STEM ad alta risoluzione per identificare le lesioni cerebrali.

Indagine su una lesione cerebrale larvale di pesce zebra utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione su larga scala

Per far luce sui meccanismi cellulari e molecolari della neurogenesi e della rigenerazione adulta del pesce zebra, abbiamo sviluppato un protocollo per la chirurgia invasiva che causa lesioni meccaniche nel telencefalo adulto del pesce zebra e il successivo monitoraggio dei cambiamenti nell'emisfero pugnalato mediante immunoistochimica o ibridazione in situ.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Qui presentiamo un metodo per immaginare il cervello embrionale del pesce zebra in vivo fino agli stadi larvale e giovanile. Questa procedura microinvasiva, adattata da approcci elettrofisiologici, fornisce l'accesso ai dettagli cellulari e subcellulari del neurone maturo e può essere combinata con studi optogenetici e neurofarmacologici per caratterizzare la funzione cerebrale e l'intervento farmacologico.

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Abbiamo modificato il modello di calo di peso di Marmarou per il pesce zebra adulto per esaminare un'ampia gamma di patologie a seguito di lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) e i meccanismi alla base della successiva rigenerazione neuronale. Questo modello di TBI a forza smussata è scalabile, induce un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola l'eterogeneità delle lesioni osservata nel TBI umano.

Un modello scalabile per studiare gli effetti della lesione da forza smussata nel pesce zebra adulto

Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.

Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

La microscopia a tre fotoni consente l'imaging a fluorescenza ad alto contrasto in profondità nei tessuti biologici viventi, come il cervello di topo e zebrafish, con un'elevata risoluzione spaziotemporale.

Microscopia a fluorescenza a tre fotoni nei tessuti profondi nel cervello intatto di topo e zebrafish

Presentato qui è un protocollo per l'imaging in vivo dell'intero cervello del pesce zebra larvale utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale. La procedura sperimentale include la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini e la visualizzazione.

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

Scopri la nanotomia su larga scala per analizzare il cervello di zebrafish sano e ferito. Questa tecnica di microscopia elettronica a trasmissione offre risoluzione nanometrica per studiare neurodegenerazione e manutenzione immunitaria.

Su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (Nanotomy) di sana e feriti Zebrafish Cervello

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