Su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (Nanotomy) di sana e feriti Zebrafish Cervello

L'obiettivo generale di questa microscopia elettronica su larga scala o di un esperimento di nanotomia è quello di definire le alternanze dal livello macromolecolare al livello tissutale, nel caso odierno, nel cervello degenerato del pesce zebra. La nanotomia può aiutare a rispondere a domande chiave nelle scienze della vita. Ad esempio, nella neurodegenerazione e nella ricerca sul diabete di tipo 1.

Il vantaggio principale della nanotomia è che vengono acquisite informazioni imparziali, che vanno dalle macromolecole, agli organelli, alle cellule e ai tessuti. Ciò consente la quantificazione e la condivisione dei dati ad accesso aperto tramite nanotomy.org. Sebbene la nanotomia fornisca informazioni sul mantenimento immunitario e sulla microglia nel cervello neurodegenerativo del pesce zebra, viene applicata anche ad altri modelli di malattia, tra cui colture cellulari, topi e persino tessuti umani.

In generale, gli scienziati che non conoscono questa tecnica hanno difficoltà perché la quantità di dati è schiacciante. Questo può essere mille volte superiore a quello ottenuto con l'EM tradizionale. Dopo aver fissato le larve di pesce zebra secondo il protocollo di testo, tagliare le teste larvali rostralmente al rombencefalo per facilitare la penetrazione dell'osmio. Mettere le larve in tetrossido di osmio all'1%, ferrocianuro di potassio all'1,5%, in cacodilato di sodio molare 0,1 molare e incubare su ghiaccio per due ore.

Quindi utilizzare acqua distillata doppia per sciacquare gli embrioni tre volte per cinque minuti ogni volta. Prima dell'inclusione, i campioni devono essere disidratati in una serie di etanolo. Per incorporare gli embrioni, dopo l'incubazione in resina epossidica diluita per una notte secondo il protocollo di testo, rimuovere la resina diluita e utilizzare resina pura per sostituirla.

Incubare per 30 minuti, quindi sostituire la resina una seconda volta e incubare per altri 30 minuti. Dopo aver rinfrescato la resina una terza volta, incubare a temperatura ambiente per tre ore. Quindi, incubare a 58 gradi Celsius per 15 minuti.

Infine, incubare a bassa pressione a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un ago o uno stuzzicadenti per orientare le teste negli stampi di inclusione piatti in silicone disponibili in commercio. Quindi polimerizzare la resina epossidica a 58 gradi Celsius durante la notte.

Quando il campione è completamente indurito, usa le lame di rasoio per tagliare la resina in eccesso dal mozzicone di rasoio. Per rilevare il corretto posizionamento, utilizzare un coltello di vetro o un istocoltello diamantato su un ultramicrotomo per tagliare sezioni di larve semisottili per blu di toluidina/fucsina basica. Trasferire le sezioni semisottili su vetrini microscopici prelevandole con una pipetta di vetro Pasteur la cui punta è stata chiusa sciogliendola in una fiamma.

Asciugare su una piastra calda fino a quando non rimane acqua. Successivamente, immergere i campioni in blu di toluidina all'1% in acqua e incubare le sezioni su una piastra calda per 10 secondi per colorarle. Quindi, dopo aver usato l'acqua per risciacquare le sezioni, utilizzare la fucsina basica allo 05% in tetraborato di sodio all'1% per colorare i campioni per altri 10 secondi.

Con un normale microscopio ottico da 10X a 40X, esaminare i campioni. Quando viene raggiunto il sito o l'orientamento corretto, utilizzare strutture anatomiche facilmente identificabili, tra cui fosse olfattive, occhi o confini della materia grigio-bianca, per identificare la regione cerebrale di interesse durante il sezionamento ultrasottile e per regolare l'angolo di sezionamento quando il campione è inclinato. Continuare a sezionare il blocco di resina epossidica con un coltello diamantato per tagliare sezioni ultrasottili a 70 nanometri.

Monta ogni sezione su una singola fessura L2 per 1 a forma di griglia di rame con codice a barre per consentire l'acquisizione senza interruzioni da barre di griglia. Un millimetro quadrato potrebbe sembrare piccolo. Si adatterà semplicemente all'apertura.

In questo modo, evitiamo che le barre della griglia blocchino il nostro campione. Renditi conto che ogni artefatto introdotto nel nostro campione verrà registrato rispetto all'EM tradizionale. Confrontare i campioni con i metalli pesanti secondo il protocollo di testo e conservarli in una scatola a griglia. Per montare il campione nel microscopio elettronico a scansione, o SEM, posizionare la griglia dalla scatola di trasferimento con la sezione nel supporto del campione a griglia multipla e trasferirla nella camera del SEM.

Dopo aver allineato il rivelatore secondo il protocollo di testo, pre-irradiare il campione rimpicciolendolo in modo che l'intera area da scansionare si adatti alla finestra dell'immagine. Una volta che l'apertura è stata modificata a 120 micrometri e l'immagine è stata sfocata, utilizzare l'opzione di scansione dell'area ridotta per rendere l'area scansionata il più stretta possibile. Quindi, imposta la frequenza dei fotogrammi per scansionare il fotogramma in circa uno o due secondi.

Quindi ingrandisci almeno 100X e scansiona una piccola area per 10 secondi. Se la luminosità nell'area continua a cambiare, continuare la pre-irradiazione. Quando quest'area non cambia luminosità rispetto all'ambiente circostante, è sufficiente la pre-irradiazione.

Mentre sei a fuoco, seleziona l'area o la funzione più chiara e imposta la velocità di scansione in modo che i dettagli siano visibili. Nel software del microscopio, regolare la luminosità e il contrasto osservando attentamente l'istogramma per mantenere tutti i pixel nella gamma dinamica. Fai lo stesso per le aree e le funzioni più scure.

Torna all'area luminosa e controlla di nuovo in modo che ci sia un po' di spazio su entrambi i lati dell'istogramma. Per i passaggi da quattro sei a quattro otto, la regolazione della luminosità e del contrasto deve essere eseguita con molta attenzione in modo che l'intera area rientri nella gamma dinamica. Rimpicciolisci in modo che l'intera area da scansionare si adatti alla finestra di imaging e avvia il programma di acquisizione di grandi aree.

Quindi utilizzare l'opzione della procedura guidata per impostare un mosaico selezionando un'area dallo schermo. Utilizza una dimensione dei pixel da due a cinque nanometri, a seconda dei dettagli necessari, e imposta un tempo di permanenza di tre microsecondi per la microscopia elettronica a scansione a trasmissione o STEM. Premere ottimizza per controllare le impostazioni del microscopio e verrà visualizzato il tempo necessario.

Quindi riaccendere il generatore di scansione esterno e premere continua. Per analizzare i dati STEM, apri un programma di visualizzazione di file EM su larga scala e apri il file chiamato mosaic info, che aprirà i file tif affiancati. Scegli l'opzione Cuci automaticamente l'intero mosaico e scegli i seguenti parametri: la modalità di sovrapposizione è uguale a metà, la soglia di cucitura è uguale a 0,90 e la riduzione del rumore è uguale ad automatica.

Se i criteri di unione non possono essere soddisfatti, ingrandisci e posiziona manualmente la piastrella in posizione e fai clic su Continua così com'è.Esporta i dati come file HTML o come un singolo tif. Includi la dimensione finale in pixel e il nome del file per abilitare le misurazioni in un secondo momento, quindi analizza i dati secondo il protocollo di testo. Come mostrato qui, la nanotomia delle sezioni cerebrali di controllo rivela caratteristiche ultrastrutturali tipiche del tessuto neurale del proencefalo rostrale, inclusi fasci di fibre olfattive, nuclei neuronali e sottocompartimenti neuronali tra cui le sinapsi.

Qui, le strutture subcellulari includono diverse morfologie nucleari e focolai in diversi tipi di cellule e organelli, tra cui l'apparato di Golgi, il reticolo endoplasmatico, i mitocondri, le vescicole sinaptiche e le densità post-sinaptiche. Inaspettatamente, i nuclei delle cellule che rivestono il ventricolo sono molto densi di elettroni rispetto ad altre cellule disperse più lateralmente nel cervello. Nella microglia, i nuclei mostrano anche focolai scuri, forse eterocromatina, che sono assenti in altre cellule del cervello.

Questa immagine da un EM su larga scala di una sezione coronale in una larva di zebrafish sottoposta ad ablazione neuronale rivela la microglia fagocitica. In queste cellule sono state trovate anche caratteristiche caratteristiche della microglia nelle cellule di mammifero, tra cui l'apparato di Golgi prominente e numerose inclusioni come i lisosomi. Una volta padroneggiata, l'acquisizione può essere effettuata in un giorno, mentre l'EM tradizionale ti costerà almeno una settimana.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante che un operatore del microscopio svolga un ruolo cruciale nell'ottenere immagini di alta qualità. Questa non è solo una tecnica a pressione di un pulsante. Ora abbiamo applicato la nanotomia non solo al modello di degenerazione neurale del pesce zebra, ma l'abbiamo anche utilizzata per l'immunomarcatura delle cellule e per studiare i tessuti delle mosche, i tessuti umani e altro ancora.

Questa tecnica apre la strada a tutti i ricercatori in qualsiasi campo. Possono rivedere i set di dati online su nanotomy.org. Possono quindi esplorare le alterazioni putative, che vanno dalla scala nanometrica a quella millimetrica e tutti i modelli studiati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare la nanotomia alla tua domanda di ricerca e al sistema cellulare o tissutale che stai indagando. Non dimenticare, solo un professionista dovrebbe fare la preparazione del campione a causa dei reagenti tossici e della considerazione etica, ma tutti possono provare il sito web nanotomy. org a casa.