Name: Imaging strutture subcellulari nellembrione Living Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri l'imaging di centrosomi e mitocondri in embrioni viventi di Danio rerio con microscopia confocale e wide-field. Questo metodo non invasivo permette di studiare la dinamica subcellulare in vivo.

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P.E. è supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 e dalla Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. è stato supportato da TUM-GS. L.T. è supportato da una borsa di studio EMBO (EMBO ALTF 108-2013). Il lavoro di D.P. sul pesce zebra è stato sostenuto dal DFG attraverso il Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); il Centro per le Scienze Integrate delle Proteine (Monaco di Baviera) e il Settimo Programma Quadro della Comunità Europea (FP7/2007-2013) nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 200611 (MEMOSAD). Attualmente è membro della New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller ed è stato sostenuto da una borsa di studio dell'Accademia tedesca delle scienze Leopoldina. L.G. è sostenuta da finanziamenti del DFG attraverso SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Progetto A11. 
Siamo grati a Kristina Wullimann per la manutenzione del nostro impianto ittico, a Yvonne Hufnagel per il supporto tecnico e a Thomas Misgeld per i commenti sul manoscritto. Siamo grati a R. Köster (Technische Universität Braunschweig) per aver fornito il vettore M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) da cui abbiamo clonato Centrin-YFP e S.C. Suzuki e T. Yoshimatsu (University of Washington) per aver fornito la cassetta 14xUAS:MA-cerulea che abbiamo utilizzato per generare il costrutto reporter per creare CentrinFish. Ringraziamo inoltre S.C. Suzuki e T. Yoshimatsu (University of Washington) per la linea transgenica Otx2:Gal4, A. Sagasti per il costrutto Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) e M. Nonet (Washington University in St. Louis) per il vettore pCold Heart Tol2. Ringraziamo Bettina Schmid, Alexander Hruscha e Christian Haass (Centro tedesco per le malattie neurodegenerative di Monaco di Baviera - DZNE) per aver contribuito allo sviluppo di MitoFish.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, dimostriamo la versatilità del sistema di espressione GAL4-UAS ai mitocondri tag fluorescenza, centrosomi e le membrane cellulari del specifici tipi di cellule in vivo in embrioni di zebrafish. Molte proteine ​​di fusione fluorescenti che etichettano altri organelli o strutture subcellulari si possono trovare nella letteratura pubblicata e possono essere ottenuti dal rispettivo laboratorio, fonti commerciali o depositari plasmide non commerciali (ad esempio, Addgene). Per progettare una nuova prot...

Imaging in vivo fornisce la visualizzazione diretta dei comportamenti cellulari nel contesto più fisiologico. La trasparenza di embrioni di zebrafish, il loro sviluppo rapido ed esterna e una ricca gamma di strumenti genetici che consentono l&#39;etichettatura fluorescente hanno contribuito al crescente utilizzo della microscopia in vivo per chiarire la dinamica degli eventi chiave dello sviluppo. Studi di imaging di sviluppo del sistema nervoso in zebrafish hanno ad esempio notevolmente ampliato la nostra conoscenza del comportamento delle cellule progenitrici neurali e il destino della loro progenie compreso il loro successiva migrazione, differenziazione e integrazione del circuito 1-8. Il palcoscenico è ora impostata per indagare le dinamiche subcellulari alla base di tali comportamenti cellulari. Infatti, zebrafish sono già sfruttate come strumenti per in vivo biologia cellulare. Ora è possibile visualizzare i mitocondri 9-11, centrosomi 2,8,12-14, Golgi 15, Il citoscheletro microtubuli 4 e actina 16, endosomi 17 e componenti della membrana apicale complesso 1,18, tra le altre strutture subcellulari in embrioni di zebrafish in vivo. Finora, gran parte di ciò che si conosce la funzione di questi organelli viene da studiare il loro comportamento in cellule in coltura. Mentre gli studi in vitro hanno dato un enorme comprensione della biologia delle cellule, cellule in coltura non rappresentano appieno la complessità della situazione in vivo e quindi non riflettono necessariamente la funzione e le dinamiche di organelli subcellulari in vivo. Embrioni di zebrafish offrono una valida alternativa in vivo per esaminare le dinamiche subcellulari. Come vertebrati, zebrafish possiede molti organi (ad esempio, retina neurale) che sono omologhi a quelli trovati in specie di mammiferi. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono sempre più utilizzati per modellare malattie umane 19,20 </sup&gt;, compresi quelli relativi alla funzione centrosomica (ad esempio, microcefalia 21 e amaurosi 22 congenita di Leber) e per la funzione mitocondriale (ad esempio, il morbo di Parkinson 23, tauopatie 10,24 e sindrome di Barth 25). In vivo l&#39;imaging a livello cellulare e subcellulare in questi casi consenta una migliore comprensione della biologia cellulare alla base di questi stati patologici. L&#39;obiettivo generale dei metodi descritti qui è quello di fornire una guida completa per indagare organelli e altre strutture subcellulari in embrioni di zebrafish utilizzando in microscopia ottica vivo. L&#39;intero flusso di lavoro coinvolti nella visualizzazione e il monitoraggio delle strutture subcellulari in vivo è descritto - da approcci genetici di etichettatura, a generare transitoriamente esprimere e pesce transgenico stabile, e, infine, per l&#39;imaging con grande campo e microscopia confocale. Mentre ciascuno di questi procedures è utilizzato da numerosi laboratori di zebrafish, i protocolli descritti sono ottimizzati e semplificato per indagare le dinamiche di strutture subcellulari. Due aspetti specifici del lavoro descritto qui meritano menzione: In primo luogo, l&#39;uso del sistema di espressione GAL4-UAS in più configurazioni per geneticamente organelli etichette in specifici tipi di cellule. In secondo luogo, un confronto diretto di tutto il campo e microscopia confocale a strutture subcellulari di immagini in vivo. Le attuali strategie geneticamente organelli etichette e altre strutture subcellulari in zebrafish o fare uso di capped mRNA 1,4,8 o costrutti di DNA a base dove elementi promotori di auto direttamente l&#39;espressione di proteine ​​di fusione 9,14,15. Trascritto in vitro ricoperto risultati di RNA a rapida e ampia espressione, che non è tessuto-specifica però. Inoltre, i livelli di espressione diminuiscono nel tempo come RNA capped viene diluito o degradato. Pertanto, l&#39;uso di RNA basatocostruisce per esaminare le dinamiche organelli in fasi successive di sviluppo è limitata (in genere fino a 3 giorni dopo la fecondazione). Queste limitazioni possono essere superate usando costrutti di DNA, dove il controllo spaziale e temporale di espressione è determinato da elementi promotori specifici. Quando costrutti di DNA a base sono utilizzati nel contesto del sistema GAL4-UAS significativi miglioramenti a livello di espressione del transgene si osservano 26,27. In questo sistema di espressione bilaterale, di tipo a cella specifici elementi promotori guidano l&#39;espressione di un attivatore trascrizionale GAL4, mentre geni reporter vengono clonati a valle della sequenza attivante a monte GAL4-binding (UAS). Combinando UAS giornalisti con opportuni driver GAL4, espressione può essere limitata a specifici tipi di cellule, eludendo la necessità di clonare geni reporter dietro vari promotori ogni volta che un pattern di espressione specifici si desidera. Inoltre, l&#39;espressione di geni multipli UAS giornalista può essereguidato da un unico attivatore GAL4. Il sistema GAL4-UAS fornisce quindi un approccio genetico versatile e flessibile per l&#39;etichettatura subcellulare. Wide-field e microscopi confocale sono i cavalli di lavoro della maggior parte dei laboratori. sistemi a grande campo tipicamente utilizzano una lampada ad arco come sorgente luminosa e rilevare la luce emessa con una camera sensibile che è posto al termine del percorso della luce. Questa modalità di imaging è in genere limitata a campioni sottili come fuori-di luce fuoco oscura informazioni di messa a fuoco in campioni più spessi. Microscopi confocali differiscono dai sistemi largo campo dal fatto che essi sono costruiti per favorire segnali provenienti dal piano focale rispetto a quelli che hanno origine fuori fuoco (cioè, &quot;sezionamento ottico&quot;) 28. Per ottenere sezionamento ottico un foro è inserito nel percorso di emissione in grado coniugato alla sorgente di luce puntiforme. I laser sono utilizzati come sorgenti di luce ed i segnali vengono rilevati con tubi fotomoltiplicatori (PMT). In pratica, un laserfascio viene strisciato sul campione punto per punto e l&#39;emissione di fluorescenza ad ogni punto (pixel) viene rilevata dal PMT. Qui immagine le stesse strutture subcellulari in embrioni di zebrafish vivere utilizzando sia a livello di campo e di microscopia confocale per fornire un confronto diretto di entrambe le modalità di microscopia. L&#39;obiettivo di fondo di fornire tali confronti è quello di offrire le linee guida per la scelta della tecnica di microscopia più appropriata per la questione specifica a portata di mano. Utilizzando gli approcci descritti qui dimostriamo GAL4-UAS basato etichettatura genetica dei mitocondri e dei centrosomi. Questi organelli vengono esposte in diversi tipi di cellule del sistema nervoso e in cellule muscolari con largo campo e microscopia confocale a dimostrare l&#39;idoneità di ogni modalità di imaging. I metodi descritti qui possono essere facilmente adattate per indagare altri organelli e strutture subcellulari nell&#39;embrione zebrafish vivente.

<table><tbody><tr><td>Agarosio (2-idrossietilagarosio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>Bassa temperatura di gelificazione Tipo VII</td></tr><tr><td>Riscaldatore a blocchi</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer compatto</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 Nitrato di calcio idrato, 99,996%&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>Per preparare la telecamera CCD 30x di Danieau</td></tr><tr><td></td><td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Coated Dumont #5 Forcipe</td><td>Dumont - Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td>#5 Pinze</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore per piatti di coltura</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>Anello riscaldante</td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato metanosolfato sale</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaina PharmaQ-25g</td><td>Tricaina (anestetico)</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Kit GeneClean</td><td>MP Biomedicals 111001200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture con fondo in vetro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Piastra di Petri da 35 mm, micropozzetto da 14 mm, vetro di copertura n. 0</td></tr><tr><td>Aghi di vetro</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>Per microiniezioni</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>Per preparare 30x</td></tr><tr><td>grasso per alto vuoto</td> di Danieau <td>Dow Corning</td><td>DCC000001242 150g</td><td>Grasso al biossido di silicio</td></tr><tr><td>KCl 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>Per preparare 30x MgSO</td></tr><tr><td>4.7H2O &nbsp; &nbsp; Reagente Solfato di magnesio eptaidrato 98+% A.C.S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>Per preparare 30x Microiniettore di Danieau</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>tips Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0,5-20 ul</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per micropipette</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGGIO mMACHINE SP6 Kit di trascrizione</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Per trascrivere PCS-Transposase</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>Per preparare 30x</td></tr><tr><td>Nanofotometro</td><td></td><td></td> di Danieau <td>Per misurare la concentrazione di DNA/RNA</td></tr><tr><td>Estrattore ad ago</td><td>Strumento Sutter</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0,80W&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Obiettivo a cono per immersione in acqua</td></tr><tr><td>N-Feniltiourea Grado I, circa 98%</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (previene la pigmentazione)</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Stampi in plastica&nbsp;</td><td>Strumenti scientifici adattivi</td><td>TU-1</td><td>Per microiniezioni Coperchio</td></tr> in <tr><td>plexiglas con foro</td><td>Su</td><td></td> misura <td>Il foro nel coperchio in plexiglas deve essere 3 mm più grande del diametro dell'obiettivo a cono per immersione nell'acqua</td></tr><tr><td>Filtro per il tè (plastica)</td><td></td><td></td> <td>Per raccogliere le uova di pesce zebra</td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>Doppia temperatura automatica Controller</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>Pipette di trasferimento in plastica da 3,5 ml</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1,00 W</td><td>Obiettivo a cono per immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0,50 W&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Obiettivo a cono per immersione in acqua</td></tr><tr><td>Microscopio a campo largo</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (50x Stock)</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 76 mg di PTU in 50 ml di acqua distillata Mescolare energicamente a temperatura ambiente&nbsp; Conservare a -20 oC in aliquote da 1 ml Utilizzare a 1x soluzione di lavoro</td></tr><tr><td>Tricaina (20x Stock)</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 200 mg di Tricaina in 48 ml di acqua distillata Aggiungere 2 ml di base Tris 1M (pH9) Regolare a pH 7&nbsp; Conservare a -20 oC in aliquote da 1 ml Utilizzare a 1x soluzione di lavoro</td></tr><tr><td>Soluzione di Danieau (30x Stock)</td><td></td><td></td><td>1.740 mM&nbsp; NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MgSO4.7H2O&nbsp; 18 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; Tampone HEPES&nbsp; Acqua distillata fino a 1 L&nbsp; Store a 4 oC&nbsp; Utilizzare con soluzione di lavoro 0,3x</td></tr></tbody></table>

imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione living zebrafish

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

L'imaging in vivo fornisce un accesso senza precedenti al comportamento dinamico delle strutture cellulari e subcellulari nel loro contesto naturale. L'esecuzione di tali esperimenti di imaging in vertebrati superiori come i mammiferi richiede generalmente l'accesso chirurgico al sistema in studio. L'accessibilità ottica del pesce zebra embrionale e larvale consente di eludere tali procedure invasive e consente l'imaging nell'organismo intatto. Infatti, il pesce zebra è ora un modello consolidato per visualizzare comportamenti cellulari dinamici utilizzando la microscopia in vivo in una vasta gamma di contesti di sviluppo, dalla proliferazione alla migrazione e differenziazione. Uno sviluppo più recente è l'uso crescente del pesce zebra per studiare eventi subcellulari, tra cui il traffico mitocondriale e la dinamica del centrosoma. La relativa facilità con cui queste strutture subcellulari possono essere marcate geneticamente da proteine fluorescenti e l'uso di tecniche di microscopia ottica per visualizzarle sta trasformando il pesce zebra in un modello in vivo di biologia cellulare. Qui descriviamo i metodi per generare costrutti genetici che etichettano in modo fluorescente gli organelli, evidenziando i mitocondri e i centrosomi come esempi specifici. Utilizziamo il sistema bipartito Gal4-UAS in molteplici configurazioni per limitare l'espressione a specifici tipi di cellule e fornire protocolli per generare pesci transgenici stabili e ad espressione transitoria. Infine, forniamo linee guida per la scelta dei metodi di microscopia ottica più adatti per l'imaging della dinamica subcellulare.

Qui l&#39;uso di tutto il campo e microscopia confocale a mitocondri immagini e centrosomi in embrioni di zebrafish vivente è direttamente confrontato e contrapposto. A seconda della posizione delle cellule in cui dinamiche organelli devono essere esaminate e la frequenza intrinseca degli specifici eventi subcellulari, generalmente o grande campo o la microscopia confocale è la scelta migliore. Abbiamo ripreso organelli nei neuroni RB situati sulla superficie dell&#39;embrione e in cellu...

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging è lo studio degli organelli subcellulari in un vertebrato in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare neuronale, come la dinamica dei mitocondri o dei centrosomi in un contesto in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'intero esperimento può essere eseguito in un vertebrato integro, senza la necessità di alcuna procedura chirurgica.Questo metodo può fornire informazioni non solo sulla dinamica subcellulare in condizioni fisiologiche, ma può essere applicato anche allo studio di modelli di tesi, come la malattia di Alzheimer. Dopo aver generato embrioni con espressione transitoria mediante microiniezione o aver ottenuto embrioni da linee transgeniche stabili, secondo il protocollo indicato nel testo, alla fine del primo giorno selezionare le uova morte o non fecondate. Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, trasferire gli embrioni vitali in soluzione di Danieau contenente PTU 1x per prevenire la formazione del pigmento e mantenere gli embrioni in soluzione di Danieau con PTU 1x fino alla selezione per l'espressione del transgene.Nel giorno dell'esperimento di imaging, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per esaminare gli embrioni anestetizzati alla ricerca di espressione del transgene. Successivamente, trasferire gli embrioni selezionati in una piastra di Petri separata contenente buffer di Danieau con PTU 1x e tricaina 1x. Una volta che gli embrioni sono stati anestetizzati, pipettare delicatamente alcuni di essi nell'agarosio a basso punto di fusione contenente PTU 1x e tricaina 1x, trasferendo il minor quantitativo possibile di liquido per evitare di diluire l'agarosio.Trasferire gli embrioni con una piccola quantità di agarosio in una piastra di Petri con fondo in vetro. Successivamente, lavorando relativamente in fretta, utilizzare le pinzette per posizionare gli embrioni nell'orientamento desiderato in base alla struttura da acquisire. Gli embrioni devono essere orientati correttamente, ad esempio in posizione laterale per l'acquisizione della retina o di un neurone di Rohon-Beard.Un orientamento preciso garantirà la migliore qualità dell'immagine e ottimizzerà la velocità di acquisizione. Dopo aver lasciato solidificare l'agarosio per almeno 15 minuti, aggiungere il buffer di Danieau con PTU 1x e tricaina 1x per coprire gli embrioni. Per eseguire la microscopia a campo ampio, dopo aver equilibrato una piastra con i pesci montati in una camera riscaldata a 28,5 gradi Celsius, sullo stage di un microscopio a campo ampio e aver selezionato un'area di interesse, aprire il software del microscopio.Sotto Illuminazione, fare clic su Impostazioni di configurazione per definire i corretti set di filtri per la lunghezza d'onda di interesse. Nelle Impostazioni della fotocamera, inserire il tempo di esposizione necessario per acquisire un'immagine adeguata. Quindi, scegliere un obiettivo a immersione in acqua con lunga distanza lavorativa, con un ingrandimento compreso tra 40x e 100x, che abbia l'apertura numerica più elevata ed sia corretto cromaticamente.Fare clic su Live per selezionare il campo visivo. Nel caso di un neurone R-B, acquisire il trasporto mitocondriale nel ramo assiale principale, proveniente dal corpo cellulare o nell’arborizzazione periferica. Successivamente, nel menu di ImageJ, fare clic sul pulsante di selezione rettangolare e definire una regione di interesse, o ROI.E fare clic su ROI nella finestra di micromanager. Dopo aver selezionato l'area di interesse per l'acquisizione delle immagini, fare clic su Stop e Salva per registrare la morfologia neuronale nel canale YFP. Per acquisire l'immagine del trasporto mitocondriale, fare clic su Acquisizione Multi-D.Quindi, nella finestra denominata Acquisizione Multidimensionale, selezionare il numero di punti temporali e l'intervallo tra i punti temporali. Nella finestra Acquisizione Multidimensionale, fare clic su Canali, quindi aggiungere e definire la lunghezza d'onda per l'acquisizione delle immagini e il tempo di esposizione. Fare clic su Salva immagini per salvare automaticamente i file nella cartella specifica indicata nel percorso della directory.Ora, fare clic su Acquisisci nell'angolo in alto a destra per iniziare l'acquisizione di immagini in lapse temporale. Per la microscopia confocale, dopo aver posizionato gli embrioni montati in una camera riscaldata a 28,5 gradi Celsius sul palchetto del microscopio confocale, aprire il software del microscopio e fare clic su Trans Lamp o Epi Lamp. Quindi, utilizzando rispettivamente la luce trasmessa o la luce di fluorescenza attraverso gli oculari del microscopio, identificare la regione di interesse.Nella finestra delle impostazioni di acquisizione, verificare che l'obiettivo scelto per l'acquisizione delle immagini corrisponda a quello visualizzato nel menu a discesa degli obiettivi disponibili. Quindi, nella finestra di controllo dell'acquisizione dell'immagine, fare clic sul pulsante della lista dei coloranti e selezionare i fluorocromi appropriati. In alternativa, fare clic sul pulsante Percorso della luce e coloranti per impostare manualmente i parametri.Nella finestra Impostazioni di acquisizione, regolare il fattore di zoom e il rapporto dimensionale dell'immagine scansionata per ottenere la dimensione del pixel necessaria a risolvere al meglio le strutture in fase di imaging. Impostare la dimensione del pixel a circa metà della risoluzione teorica dell'obiettivo, seguendo così i criteri di campionamento di Nyquist. Per determinare la dimensione del pixel di un'immagine acquisita, nella finestra di controllo acquisizione immagine, fare clic sul pulsante I.Successivamente, impostare la velocità di scansione al valore più elevato possibile. Quindi, nella finestra di controllo dell'acquisizione delle immagini, fare clic su mediazione delle linee Kalman e impostarla su un fattore di due o tre per ridurre il rumore. Per selezionare una modalità di scansione sequenziale per l'acquisizione di fluorofori con spettri sovrapposti, fare clic su Sequenziale e Linea.Quindi, regolare l'uscita di potenza delle linee laser pertinenti. Per scansionare continuamente la regione selezionata regolando contemporaneamente le impostazioni del rilevatore per ogni canale, fare clic su XY Ripeti oppure su Focalizza x2 o Focalizza x4. Successivamente, regolare HV, Guadagno e Offset per ogni canale al fine di acquisire immagini con il massimo intervallo dinamico di valori di grigio.Ora, premere Controllo più H per visualizzare le immagini acquisite tramite una tabella di consultazione che identifica i pixel sottoesposti in blu e quelli sovraesposti in rosso, entrambi da evitare. Rivalutare l'output di potenza delle linee laser interessate e le impostazioni del rilevatore. Per definire i limiti superiore e inferiore del volume da acquisire, fare clic sul pulsante Imposta fine nel limite superiore nelle Impostazioni di acquisizione, quindi mettere a fuoco sul limite inferiore e premere Imposta inizio.Per verificare la risoluzione Z dell'obiettivo, nel controllo di acquisizione dell'immagine, fare clic sul simbolo I. Quindi selezionare un incremento pari alla metà della risoluzione Z per l'obiettivo in uso. Nella finestra secondaria TimeScan, impostare la frequenza con cui acquisire gli Z-stack e il numero di acquisizioni previste, in modo da configurare una serie temporale adeguata alla dinamica della struttura sottocellulare da immaginare.Fare clic sui pulsanti Profondità e Tempo per confermare che verranno acquisiti lo Z-stack e la serie temporale. Infine, fare clic sul pulsante XY Zt per iniziare l'acquisizione delle immagini in lapse temporale. Al termine dell'acquisizione delle immagini, nell'interfaccia del software, fare clic su Serie completata.Salvare le immagini in formato OIB per registrare le immagini e i metadati associati. Questa figura mostra gli organelli e i neuroni R-B localizzati sulla superficie dell'embrione, ottenuti mediante microscopia a campo ampio e microscopia confocale. In questo caso, l'acquisizione di immagini in time-lapse mediante un microscopio a campo ampio è stata utilizzata per tracciare lo spostamento di un singolo mitocondrio nell'arborizzazione periferica di un neurone R-B.L'immagine confocale è significativamente più lenta e può portare a una sottostima della dinamica di specifici eventi subcellulari. Le immagini delle cellule retiniche acquisite mediante microscopia a campo ampio soffrono di un contrasto ridotto, poiché i segnali fluorescenti provenienti da un grande volume di tessuto offuscano i dettagli nel piano focale. In questo caso, la capacità di sezione ottica della microscopia confocale migliora in modo evidente il contrasto.Gli insetti mostrano dettagli di una regione del livello nucleare interno, con marcatura delle membrane cellulari e dei mitocondri. Grazie a un driver neuronale sensoriale specifico Gau-4, l'espressione mosaicale derivante dalle iniezioni di UAS-mito-CFP e UAS MAY-FP permette il tracciamento di singole cellule nel corso di giorni, come osservato in questo neurone sensoriale R-B a due e tre giorni dalla fecondazione. Oltre ai mitocondri, altri organelli subcellulari come i centrosomi possono essere marcati in modo fluorescente.In questo esempio, due cassette UAS in un singolo costrutto contiguo hanno indotto l'espressione di YFP localizzata ai centrosomi e di cerulea localizzata alla membrana nelle cellule retiniche. Gli insetti mostrano una cellula in fase M. L'intera procedura richiede diversi giorni, dall'accoppiamento, al prelievo delle uova, alle iniezioni e infine all'acquisizione delle immagini a tre o quattro giorni dalla fecondazione.L'esperimento di imaging effettivo al microscopio può richiedere da alcuni minuti fino a un'intera giornata. Seguendo questa procedura, altri organelli come i microtubuli o i perossisomi possono essere marcati e osservati al fine di comprenderne la dinamica in vivo. Non dimenticare che il PTU è cancerogeno e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare guanti, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l'imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

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Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

La mitosi è fondamentale per ogni organismo vivente e i difetti spesso portano al cancro e ai disturbi dello sviluppo. Utilizzando questo protocollo di imaging e il pesce zebra come sistema modello, i ricercatori possono visualizzare la mitosi in un organismo vertebrato vivo e la moltitudine di difetti che si verificano quando i processi mitotici sono difettosi.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

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Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Scopri l'imaging di centrosomi e mitocondri in embrioni viventi di Danio rerio con microscopia confocale e wide-field. Questo metodo non invasivo permette di studiare la dinamica subcellulare in vivo.

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

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