Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging è studiare gli organelli subcellulari in un vertebrato in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare neuronale, come la dinamica dei mitocondri o i centrosomi in un contesto in-vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'intero esperimento può essere eseguito in un vertebrato intatto, senza la necessità di alcuna procedura chirurgica.

Questo metodo può fornire informazioni non solo sulle dinamiche subcellulari in condizioni fisiologiche, ma può anche essere applicato a studi di modelli di tesi, come il morbo di Alzheimer. Dopo aver generato embrioni che esprimono transitoriamente mediante microiniezione, o aver ottenuto embrioni da linee transgeniche stabili, secondo il protocollo di testo, alla fine del primo giorno, screening per ovuli morti o non fecondati. Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, trasferire gli embrioni vitali nella soluzione di Danieleau contenente 1x PTU per prevenire la formazione di pigmenti e mantenere gli embrioni nella soluzione di Danieleau contenente 1x PTU fino allo screening per l'espressione transgenica.

Il giorno dell'esperimento di imaging, utilizzare un microscopio da dissezione a fluorescenza per esaminare gli embrioni anestetizzati per l'espressione transgenica. Quindi trasferire gli embrioni selezionati in una capsula di Petri separata contenente il tampone di Danieau con 1x PTU e 1x tricaina. Una volta che gli embrioni sono stati anestetizzati, pipettarne delicatamente alcuni nell'agarosio a basso punto di fusione contenente 1x PTU e 1x tricaina, trasferendo il minor liquido possibile per evitare di diluire l'agarosio.

Trasferire gli embrioni con una piccola quantità di agarosio in una capsula di Petri con fondo di vetro. Quindi, lavorando in modo relativamente veloce, utilizzare una pinza per posizionare gli embrioni nell'orientamento desiderato a seconda della struttura da visualizzare. Gli embrioni devono essere orientati correttamente, ad esempio, piatti sul lato per l'imaging della retina o di un neurone di Rohon-Beard.

Un orientamento preciso garantirà la migliore qualità dell'immagine e ottimizzerà la velocità di acquisizione. Dopo aver lasciato solidificare l'agarosio per almeno 15 minuti, aggiungi il tampone di Danieau con 1x PTU e 1x tricaina per coprire gli embrioni. Per eseguire la microscopia a campo largo, dopo aver bilanciato una piastra di pesce montato in una camera di riscaldamento a 28,5 gradi Celsuis, sul tavolino di un microscopio a campo largo, e aver scelto un'area di interesse, aprire il software del microscopio.

In Illuminazione, fare clic su Impostazioni di configurazione per definire i set di filtri corretti per la lunghezza d'onda di interesse. In Impostazioni fotocamera, immettere il tempo di esposizione necessario per acquisire un'immagine adatta. Quindi, scegli un obiettivo a cono a immersione in acqua a lunga distanza di lavoro, con ingrandimento compreso tra 40x e 100x, con l'apertura numerica più alta e corretto cromaticamente.

Fare clic su Live per scegliere il campo visivo. Nel caso di un neurone R-B, visualizzare il trasporto mitocondriale all'assone staminale, emanato dal corpo cellulare o nell'albero periferico. Quindi, nel menu ImageJ, fare clic sul pulsante di selezione rettangolare e definire una regione di interesse, o ROI.

E fai clic su ROI nella finestra del micromanager. Dopo aver selezionato il ROI per l'imaging, fare clic su Interrompi e salva per registrare la morfologia neuronale nel canale YFP. Per visualizzare il trasporto mitocondriale, fare clic su Acquisizione Multi-D.

Quindi, nella finestra chiamata Acquisizione multidimensionale, selezionare il numero di punti temporali e l'intervallo tra i punti temporali. Nella finestra Acquisizione multidimensionale, fare clic su Canali e aggiungere e definire la lunghezza d'onda per l'imaging e il tempo di esposizione. Fare clic su Salva immagini per salvare automaticamente i file nella cartella specifica delineata nel percorso della directory.

Ora, fai clic su Acquisisci nell'angolo in alto a destra per avviare l'imaging time lapse. Per la microscopia confocale, dopo aver posizionato gli embrioni montati in una camera di riscaldamento a 28,5 gradi Celsius sul tavolino confocale, aprire il software del microscopio e fare clic su Trans Lamp o Epi Lamp. Quindi, tramite gli oculari del microscopio, utilizzare rispettivamente la luce trasmessa o la luce fluorescente per identificare la regione di interesse.

Nella finestra Impostazioni acquisizione, verificare che l'obiettivo scelto per l'imaging corrisponda all'obiettivo che appare nel menu a tendina degli obiettivi disponibili. Quindi, nella finestra Controllo acquisizione immagini, fare clic sul pulsante dell'elenco dei coloranti e selezionare i fluorofori appropriati. In alternativa, fare clic sul pulsante Percorso luce e coloranti per impostare manualmente i parametri.

Nella finestra Impostazioni di acquisizione, regolare il fattore di zoom e le proporzioni delle dimensioni dell'immagine acquisita per ottenere la dimensione in pixel necessaria per risolvere al meglio le strutture da riprendere. Impostare la dimensione dei pixel in modo che sia circa la metà della risoluzione teorica dell'obiettivo, seguendo così i criteri di campionamento di Nyquist. Per determinare la dimensione in pixel di un'immagine acquisita, nella finestra Controllo Acquisizione Immagini, fare clic sul pulsante I.

Quindi, imposta la velocità di scansione al massimo possibile. Quindi, nella finestra Controllo acquisizione immagini, fare clic sulla media della linea di Kalman e impostarla su un fattore di due o tre per ridurre il rumore. Per selezionare una modalità di scansione sequenziale per l'imaging di fluorofori con spettri sovrapposti, fare clic su Sequenziale e lineare.

Quindi, regolare la potenza di uscita delle linee laser pertinenti. Per eseguire la scansione continua della regione selezionata mentre si regolano le impostazioni del rilevatore per ciascun canale, fare clic su XY Repeat o su Focus x2 o Focus x4. Quindi, regolare HV, Guadagno e Offset per ciascun canale per acquisire immagini con la gamma dinamica più alta di valori di grigio.

Ora, premi Ctrl più H per visualizzare le immagini acquisite tramite una tabella di ricerca che identifica i pixel sottosaturi in blu e i pixel sovrasaturi in rosso, entrambi da evitare. Rivalutare la potenza di uscita delle linee laser pertinenti e le impostazioni del rivelatore. Per definire i limiti superiore e inferiore del volume da riprendere, in Impostazioni di acquisizione fare clic sul pulsante Termina impostazione in corrispondenza del limite superiore, quindi mettere a fuoco fino al limite inferiore e premere Avvia impostazione.

Per verificare la risoluzione Z dell'obiettivo, in Controllo acquisizione immagini, fare clic sul simbolo I. Quindi seleziona una dimensione del passo che sia la metà della risoluzione Z per l'obiettivo dato. Nella sottofinestra TimeScan, inserire la frequenza con cui devono essere acquisiti gli Z-stack e il numero di volte in cui le immagini devono essere acquisite, per impostare una serie temporale appropriata per la dinamica della struttura subcellulare da visualizzare.

Fare clic sui pulsanti Profondità e Tempo per confermare che lo Z-stack e la serie temporale verranno acquisiti. Infine, fai clic sul pulsante XY Zt per iniziare ad acquisire immagini time lapse. Dopo l'acquisizione dell'immagine, nell'interfaccia del software, fare clic su Serie completata.

E salva le immagini in formato OIB per registrare le immagini e i metadati associati. Questa figura mostra gli organelli e i neuroni R-B situati sulla superficie dell'embrione utilizzando ampi campi e microscopia confocale. Qui, l'imaging time lapse su un microscopio ad ampio campo è stato utilizzato per tracciare il movimento di un singolo mitocondrio nell'albero periferico di un neurone R-B.

L'imaging confocale è significativamente più lento e può portare a una sottostima della dinamica di specifici eventi subcellulari. Le immagini di cellule retiniche acquisite con la microscopia a campo largo soffrono di scarso contrasto, poiché i segnali fluorescenti provenienti da un grande volume di tessuto oscurano i dettagli sul piano focale. In questo caso, la capacità di sezionamento ottico della microscopia confocale migliora notevolmente il contrasto.

I riquadri mostrano i dettagli di una regione dello strato nucleare interno, con l'etichettatura delle membrane cellulari e dei mitocondri. Guidata dal driver Gau-4 specifico di un neurone sensoriale, l'espressione a mosaico delle iniezioni di UAS-mito-CFP e UAS MAY-FP consente il tracciamento delle singole cellule per giorni, come si vede in questo neurone sensoriale R-B a due e tre giorni dopo la fecondazione. Oltre ai mitocondri, altri organelli subcellulari come i centrosomi possono essere marcati in fluorescenza.

In questo esempio, due cassette UAS su un singolo costrutto contiguo hanno guidato l'espressione di YFP mirato al centrosoma e di ceruleo mirato alla membrana nelle cellule retiniche. I riquadri mostrano una cella in fase M. L'intera procedura richiede diversi giorni dall'accoppiamento, alla raccolta degli ovuli, alle iniezioni e infine all'imaging tre o quattro giorni dopo la fecondazione.

L'esperimento di imaging vero e proprio al microscopio può richiedere da alcuni minuti a un'intera giornata. Seguendo questa procedura, altri organelli come i microtubuli o i perossisomi possono essere etichettati e visualizzati per comprendere la loro dinamica in vivo. Non dimenticare che la PTU è cancerogena e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i guanti.