Stimolazione diretta correnti e multi-elettrodo Array registrazione di sequestro simile attività nei topi cervello fetta di preparazione

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di accedere alla disposizione degli elettrodi nella camera di registrazione per la stimolazione a corrente continua di una fetta di cervello e il suo effetto sull'attività convulsiva registrata con un array multi-elettrodo. Questo può aiutare a rispondere meglio alle domande chiave nella stimolazione a corrente continua e un array multi-elettrodo ha registrato un'attività simile a una crisi epilettica nella fetta di cervello del topo. Un vantaggio di questa tecnica è che gli effetti della stimolazione a corrente continua possono essere valutati nel percorso specifico della fetta di cervello del topo.

A dimostrare la procedura saranno Hsiang Chin e Wei-Jen Chang, tecnici del mio laboratorio. In questa procedura, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con una soluzione di etanolo al 75% prima dell'esperimento. Quindi, esponi il cranio dell'animale e taglia il muscolo rimanente.

Quindi, stacca la superficie dorsale del cranio usando i rongeur e taglia via i lati. Successivamente, utilizzando una spatola, tagliare i bulbi olfattivi e le connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello prima di rimuoverlo. Trasferisci rapidamente il cervello in un becher riempito di ACSF ghiacciato, ossigenato.

Per preparare le fette contenenti la via MT-ACC, eseguire un taglio sagittale, 2 mm lateralmente alla linea mediana in ciascun emisfero, per visualizzare l'anatomia sottocorticale. Quindi, fai un taglio trasversale angolato parallelo al tratto di fibra visibile nello striato. Eseguire il secondo taglio trasversale angolato dalla connessione tra il cervelletto e la corteccia visiva, fino al punto medio tra la commessura anteriore e il tratto ottico, che sono ventrali e paralleli alla via cingolata del talamo.

Successivamente, attacca il blocco cerebrale a una piastra angolare con un adesivo cianoacrilato. Fai un taglio appena sopra il punto di svolta del percorso. Dopodiché, apri la piastra, appiattiscila e incollala sul palco della camera di un vibratomo.

Successivamente sezionare le fette di cervello a 500 micrometri di spessore e conservarle in ACSF ossigenato ghiacciato. Trasferire una fetta nella camera di registrazione a 32 gradi Celsius con profusione continua di ACSF ossigenato per un'ora. Confermare il posizionamento di una sonda MEA sul sistema multicanale.

Utilizzare un tubo per guidare l'ACSF nella camera MEA e l'altro tubo per guidare l'ACSF fuori dalla camera. Perfondere continuamente il preparato con ACSF caldo e ossigenato a 30 gradi Celsius. Usando un batuffolo di cotone bagnato, trasferisci una fetta di cervello nel MEA.

Spostare con cautela la fetta cerebrale per orientare l'ACC sopra gli elettrodi, quindi stabilizzare la fetta cerebrale con un'ancora a fetta per garantire una buona connessione elettrica tra la fetta e gli elettrodi. Successivamente, posizionare l'elettrodo anodico prossimalmente all'ACC e l'elettrodo catodico distale all'ACC. Registrare l'intensità di campo in base ai due orientamenti di campo di MEA.

Quindi erogare le correnti elettriche utilizzando uno stimolatore. Regolare la distanza tra i due elettrodi di cloruro d'argento a circa 1,5-2 cm e regolare l'intensità di corrente dello stimolatore per rendere il DCS tra 0,5 e 2 milliampere. In questa procedura, posizionare un elettrodo di tungsteno in MT e rilasciare impulsi dallo stimolatore alla regione talamica della fetta.

Quindi, utilizzare varie intensità di corrente per determinare la soglia che suscita una risposta ACC. Spostare l'elettrodo di tungsteno lungo il percorso del cingolo del talamo per ottenere il profilo di risposta ottimale. Registra da 1 a 20 risposte ACC e utilizza il software per calcolare automaticamente la media di tutte le risposte ACC evocate dalla mia stimolazione MT.

Per indurre un'attività simile a una crisi epilettica, aggiungere 250 micromolari 48P e 5 micromolari di bicucullina alla soluzione di perfusione e continuare a cospargere la fetta per due o tre ore. Mantenere la pompa a una velocità di perfusione relativamente elevata, che può aiutare a prevenire l'accumulo di un gradiente di pH. Quindi, posizionare l'elettrodo di tungsteno su MT ed erogare la stimolazione elettrica per ottenere un profilo di risposta ACC.

Registra 10-20 scansioni e fai la media delle risposte. Successivamente, sostituire la soluzione di prefusione con ACSF fresco per lavare via i farmaci. In questa procedura, garantire la generazione di campi elettrici uniformi, facendo passare correnti tra due fili d'argento paralleli rivestiti di cloruro d'argento che vengono posizionati all'interno della camera MEA.

Se non ci sono problemi, il DCS dovrebbe rimanere tra 0,5 e 2 milliampere. Quindi, spegni il DCS e stimola il talamo con un elettrodo di tungsteno. Per ottenere risposte sinaptiche massime nell'ACC, registrare 10-20 risposte e poi fare la media.

Quindi, accendi il MDD e stimola contemporaneamente il talamo. Valutare le variazioni di ampiezza della risposta ACC evocata dalla stimolazione talamica durante la MDD. Ora, spegni il MDD, aggiungi 250 micromolari 48P e 5 micromolari di bicucullina alla soluzione di perfusione e attendi 2-3 ore.

Se i farmaci hanno effetto sulla fetta di cervello, la fetta dovrebbe produrre risposte convulsive corticali. Successivamente, raccogliere 10-20 risposte corticali cingolate anteriori e misurare l'ampiezza e la durata delle risposte convulsive corticali evocate elettricamente. Nidifica, accendi il MDD e stimola contemporaneamente il talamo.

Valutare i cambiamenti nell'ampiezza e nella durata delle risposte alle crisi corticali evocate durante l'applicazione della MDD. Successivamente, sostituire la soluzione di perfusione con ACSF fresco per lavare via i farmaci. Questa figura mostra diverse risposte evocate, che includono le risposte evocate dalla stimolazione talamica nell'ACC, l'attività simile alle convulsioni indotta da farmaci e sia la stimolazione talamica che l'attività simile alle convulsioni indotte da farmaci.

Questa figura mostra l'effetto di diversi orientamenti nella MDD, come i diversi orientamenti nel campo elettrico, le risposte evocate dalla stimolazione talamica con la MDD e l'effetto della MDD catodica sull'attività convulsiva. E in questa figura, 15 minuti di MDD catodica sono mostrati come hanno effettivamente indotto la depressione a lungo termine e le risposte evocate depresse. La durata della crisi è stata significativamente ridotta dopo 15 minuti di MDD catodica rispetto a nessuna applicazione di MDD.

più veloce, questo tecnicamente può essere fatto in quattro ore se viene eseguito correttamente. Dopo questa procedura, possono essere eseguite altre questioni come la stimolazione magnetica transcranica, al fine di rispondere a ulteriori domande come fornire approcci non invasivi per il controllo delle crisi di resistenza. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia non invasiva per esplorare i trattamenti delle crisi epilettiche in un modello animale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la stimolazione attuale per valutare l'attività simile a una crisi epilettica nelle fette di cervello.