Stimolazione diretta correnti e multi-elettrodo Array registrazione di sequestro simile attività nei topi cervello fetta di preparazione

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è analizzare la disposizione degli elettrodi nella camera di registrazione per la stimolazione con corrente continua di una sezione cerebrale e il suo effetto sull'attività simile a crisi epilettiche registrata mediante un array multiplo di elettrodi. Questo approccio può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la stimolazione con corrente continua e l'attività simile a crisi epilettiche registrata con un array multiplo di elettrodi in sezioni cerebrali di topo. Un vantaggio di questa tecnica è che gli effetti della stimolazione con corrente continua possono essere valutati in una via specifica della sezione cerebrale di topo.

La procedura sarà dimostrata da Hsiang Chin e Wei-Jen Chang, tecnici del mio laboratorio. In questa procedura, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con soluzione di etanolo al 75% prima dell'esperimento. Successivamente, esporre il cranio dell'animale e rimuovere i residui di muscolo.

Successivamente, rimuovere la superficie dorsale del cranio utilizzando rongeur e tagliare i lati. In seguito, utilizzando una spatola, recidere i bulbi olfattivi e le connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello prima di rimuoverlo. Trasferire rapidamente il cervello in un becher riempito con ACSF freddo di ghiaccio e ossigenato.

Per preparare sezioni contenenti il percorso MT-ACC, effettuare un taglio sagittale, a 2 mm lateralmente rispetto alla linea mediana in ciascun emisfero, per visualizzare l'anatomia sottocorticale. Successivamente, eseguire un taglio trasversale angolato parallelo al tratto di fibre visibile nello striato. Eseguire il secondo taglio trasversale angolato dal collegamento tra cervelletto e corteccia visiva fino al punto medio tra il commissura anteriore e il tratto ottico, posizionati ventralmente e paralleli al percorso talamo-cingolato.

Successivamente, fissare il blocco cerebrale a una piastra angolare utilizzando un adesivo a base di cianoacrilato. Effettuare un taglio appena al di sopra del punto di svolta del percorso. Successivamente, aprire la piastra, appiattirla e incollarla sulla piattaforma della camera di un vibratomo.

Successivamente sezionare le fette cerebrali con uno spessore di 500 micrometri e mantenerle in ACSF ossigenata e fredda. Trasferire una fetta nella camera di registrazione a 32 gradi Celsius con un'irrorazione continua di ACSF ossigenata per un'ora. Verificare il posizionamento di una sonda MEA sul sistema multicanale.

Utilizzare un tubo per indirizzare l'ACSF nella camera della MEA e l'altro tubo per far uscire l'ACSF dalla camera. Perfundere continuamente il preparato con ACSF ossigenato e caldo a 30 gradi Celsius. Trasferire una sezione cerebrale nella MEA utilizzando un bastoncino di cotone imbevuto.

Spostare con attenzione la sezione cerebrale in modo da posizionare la corteccia cingolata anteriore (ACC) sopra gli elettrodi, quindi stabilizzare la sezione cerebrale con un ancoraggio per garantire un buon contatto elettrico tra la sezione e gli elettrodi. Successivamente, posizionare l'elettrodo anodico in prossimità della ACC e l'elettrodo catodico in posizione distale rispetto alla ACC. Registrare l'intensità del campo in base alle due orientazioni del campo della MEA.

Quindi erogare le correnti elettriche utilizzando uno stimolatore. Regolare la distanza tra i due elettrodi di cloruro d'argento a circa 1,5-2 cm e regolare l'intensità della corrente dello stimolatore in modo da ottenere una DCS compresa tra 0,5 e 2 milliampere. In questa procedura, posizionare un elettrodo al tungsteno nell'area MT ed erogare impulsi dallo stimolatore alla regione talamica della sezione.

Successivamente, utilizzare diverse intensità di corrente per determinare la soglia in grado di provocare una risposta della corteccia cingolata anteriore (ACC). Spostare l'elettrodo al tungsteno lungo il percorso talamo-cingolato per ottenere il profilo di risposta ottimale. Registrare da 1 a 20 risposte della ACC e utilizzare il software per calcolare automaticamente la media di tutte le risposte della ACC evocate dalla stimolazione del MT.

Per indurre un'attività simile a una crisi epilettica, aggiungere 250 micromolari di 48P e 5 micromolari di bicucullina alla soluzione di perfusione e continuare a perfondere la sezione per due o tre ore. Mantenere la pompa a una velocità di perfusione relativamente elevata, il che può aiutare a prevenire la formazione di un gradiente di pH. Successivamente, posizionare l'elettrodo al tungsteno nel MT ed erogare una stimolazione elettrica per ottenere un profilo di risposta della corteccia anteriore del cingolo (ACC).

Registrare 10-20 sweep e mediare le risposte. Successivamente, sostituire la soluzione prefusione con ACSF fresco per eliminare i farmaci. In questa procedura, assicurarsi della generazione di campi elettrici uniformi, facendo passare correnti tra due fili di argento rivestiti di cloruro di argento posti all'interno della camera MEA.

Se non ci sono problemi, il DCS dovrebbe rimanere compreso tra 0,5 e 2 milliampere. Successivamente, spegnere il DCS e stimolare il talamo con un elettrodo al tungsteno. Per ottenere risposte sinaptiche massimali nell'ACC, registrare 10-20 risposte e quindi calcolarne la media.

Quindi, accendere il DCS e stimolare contemporaneamente il talamo. Valutare le variazioni di ampiezza della risposta del cingolo anteriore (ACC) evocata dalla stimolazione talamica durante il DCS. Spegnere ora il DCS, aggiungere 250 micromolar 48P e 5 micromolar bicucullina alla soluzione di perfusione, e attendere 2-3 ore.

Se i farmaci hanno effetto sulla sezione cerebrale, la sezione dovrebbe produrre risposte epilettiche corticali. Successivamente, acquisire 10-20 risposte della corteccia cingolata anteriore e misurare l'ampiezza e la durata delle risposte epilettiche corticali evocate elettricamente. Poi, attivare la stimolazione continua diretta (DCS) e stimolare contemporaneamente il talamo.

Valutare le variazioni nell'ampiezza e nella durata delle risposte corticali convulsive evocate durante l'applicazione della DCS. Successivamente, sostituire la soluzione di perfusione con ACSF fresco per eliminare i farmaci. Questa figura mostra diverse risposte evocate, che includono le risposte evocate dalla stimolazione talamica nell'ACC, l'attività di tipo convulsivo indotta da farmaci e l'attività di tipo convulsivo indotta sia dalla stimolazione talamica che dai farmaci.

Questa figura mostra l'effetto di diverse orientazioni nella DCS, come ad esempio diverse orientazioni del campo elettrico, le risposte evocate dalla stimolazione talamica con DCS e l'effetto della DCS catodica sull'attività di tipo epilettico. In questa figura, si osserva che 15 minuti di DCS catodica inducono efficacemente una depressione a lungo termine e riducono le risposte evocate. La durata delle crisi è risultata significativamente ridotta dopo 15 minuti di DCS catodica rispetto all'assenza di applicazione di DCS.

più velocemente, tecnicamente ciò può essere eseguito in quattro ore se effettuato correttamente. A seguito di questa procedura, possono essere svolte altre attività come la stimolazione magnetica transcranica, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio fornendo approcci non invasivi per il controllo delle crisi resistenti. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia non invasiva per esplorare trattamenti contro le crisi in modelli animali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la stimolazione elettrica per valutare l'attività simile a crisi epilettiche in fette cerebrali.