Calcificazione vascolare cellule muscolari lisce e imaging di aortica calcificazioni e infiammazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la calcificazione vascolare aortica ex vivo e di modellare la calcificazione vascolare in vivo utilizzando cellule muscolari lisce dell'aorta murina primarie in coltura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle malattie vascolari fornendo un modello in vitro per studiare i meccanismi molecolari della calcificazione vascolare e consentendo la valutazione della calcificazione vascolare e dell'infiammazione dei macrofagi in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione sensibile e la co-localizzazione dell'attività dei macrofagi con i depositi di calcio nelle lesioni aterosclerotiche anche negli stati iniziali della malattia.

A dimostrare questa procedura, oltre a Caitlin e a me, sarà Robert Tainsh, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, disinfettare la coda con un tampone imbevuto di alcol e individuare lateralmente le vene della coda. Quindi, applicare una leggera pressione in avanti sulla siringa mentre un ago calibro 30 viene fatto avanzare nella coda senza resistenza.

Quindi iniettare 100 microlitri di calcio NIR e/o 100 microlitri di catepsina NIR a una velocità costante. Estrarre l'ago dopo cinque secondi e prelevare le aorte da tre a 24 ore dopo l'iniezione. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere il peritoneo per rivelare gli organi addominali.

Successivamente, asportare gli organi gastrointestinali facendo attenzione a non sezionare l'aorta. Successivamente, praticare un'incisione laterale nel diaframma anteriore e continuare l'incisione attraverso l'addome. Usando le forbici da dissezione, rilasciare la gabbia toracica tagliando i lati delle costole e rimuovendo il tessuto molle aderente alla parte superiore dello sterno.

Quindi rimuovere la gabbia toracica e rivelare i polmoni. Con attenzione, rimuovere i polmoni. Quindi, rimuovere la trachea e l'esofago con cura, assicurandosi che l'aorta rimanga intatta.

Successivamente rimuovere il tessuto molle che circonda l'aorta dalla biforcazione iliaca all'arco aortico. Prestare attenzione quando si rimuove il grasso peri-aortico. Successivamente, rimuovere il grasso rimanente e i tessuti molli che circondano l'aorta toracica e i grandi rami dell'arco aortico.

Quindi, rimuovi il timo. Ora rimuovi il cuore dalla cavità toracica staccandolo con cura dall'aorta prossimale. Quindi sezionare l'aorta distale alla biforcazione iliaca.

Usando un ago da insulina, iniettare soluzione fisiologica normale nell'aorta dall'arco aortico per lavare via le cellule del sangue rimanenti. Staccare l'aorta insieme ai vasi dell'arco aortico e rimuoverla completamente dal corpo. Mettere l'aorta in una normale soluzione salina su ghiaccio fino al momento dell'imaging.

In questa fase, posizionare le aorte in HBSS freddo fino al completamento delle dissezioni. In una cappa sterile per coltura tissutale, trasferire le aorte nella soluzione di digestione aortica nelle piastre per coltura tissutale da 35 X 10 millimetri. Quindi incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti con un leggero dondolio intermittente.

Dopo la digestione, le aorte dovrebbero mostrare un aspetto allungato o sfilacciato. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere lo strato avventizio esterno di un'aorta mantenendo intatto lo strato mediale. Per fare ciò, staccare lo strato esterno dell'aorta a un'estremità e rimuoverlo dallo strato mediale sottostante come un calzino.

Una volta rimosso lo strato avventizio, incubare l'aorta rimanente in una nuova piastra di coltura con terreno di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per due o quattro ore. Successivamente, tagliare l'aorta in anelli larghi uno o due millimetri. Trasferire gli anelli in una nuova piastra di coltura tissutale con soluzione di digestione aortica e incubare a 37 gradi Celsius con un leggero dondolo intermittente per 120 minuti.

Durante l'incubazione, pipettare la soluzione su e giù più volte per risospendere le cellule. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura cellulare caldo alla soluzione di digestione e trasferirla in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare la provetta per cinque minuti a 200 G, quindi aspirare il terreno e risospendere le cellule nel volume desiderato di terreno di coltura cellulare.

Per indurre la calcificazione nelle cellule muscolari lisce vascolari, trasferire le cellule nella piastra di coltura a sei pozzetti e lasciarle aderire. Quindi realimentare le cellule in terreni di calcificazione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per almeno sette giorni.

Successivamente, aspirare il terreno dalla piastra di coltura cellulare. Lavare le cellule una volta in acqua ionizzata. Fissare le cellule mettendole in un millilitro di formalina al 10% a temperatura ambiente per 20 minuti.

Quindi rimuovere la formalina e lavare le celle fissate con acqua distillata per cinque minuti. Successivamente, incubare le cellule in un millilitro di soluzione di nitrato d'argento al 5% sotto una lampadina da 60 a 100 watt per una o due ore. Successivamente, aspirare la soluzione di nitrato d'argento e lavare con acqua distillata per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, rimuovere l'argento non reagito mettendo le celle in un millilitro di soluzione di tiosolfato di sodio al 5% in acqua distillata per cinque minuti. Successivamente, sciacquare le celle con acqua distillata per cinque minuti. Le cellule colorate con von Kossa sono ora pronte per l'imaging con la microscopia ottica invertita standard.

In questa figura, i topi knockout MGP wild type e i topi knockout LDLR sono stati iniettati con NIR di calcio e catepsina NIR tramite iniezione nella vena caudale e le aorte sono state raccolte 24 ore dopo e valutate con imaging a fiorescenza NIR. I topi wild type non mostrano praticamente alcuna calcificazione aortica o presenza di macrofagi. Le aorte dei topi knockout per LDLR hanno un'estesa calcificazione che co-localizza con l'accumulo di macrofagi.

Al contrario, i topi knockout per MGP hanno una calcificazione aortica che si verifica in assenza di infiltrazione di macrofagi. In questo esperimento, VSMC aortiche in coltura sono state isolate da topi knockout per MGP e infettate con adenovirus che esprime GFP o MGP. Le VSMC aortiche isolate da topi wild type, sono state trasfettate con siRNA criptato di controllo o siRNA mirato a MGP.

Le cellule sono state coltivate nel terreno di calcificazione A per sette giorni e successivamente fissate e colorate con von Kossa. La colorazione del calcio è stata quantificata utilizzando il software ImageJ dopo la sottrazione del fondo. Dopo il suo sviluppo, queste tecniche hanno permesso agli scienziati di visualizzare l'aterosclerosi e la calcificazione vascolare ex vivo.

E per modellare la calcificazione vascolare in vitro. Ciò sta aprendo la possibilità di testare gli effetti di nuovi trattamenti farmacologici sulle malattie vascolari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le aorte nelle cellule muscolari lisce vascolari dell'aorta murina primaria, visualizzare le placche aterosclerotiche utilizzando sonde di imaging fluorescenti nel vicino infrarosso e calcificare la muscolatura liscia vascolare in vitro.