Name: Protocollo sperimentale per produzione di biodiesel con isolamento di Alkenones come coprodotti da Commercial Isochrysis Biomassa algale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Impara a produrre biodiesel da Isochrysis con co-isolamento di alchenoni come coprodotti di valore. Questo metodo sostenibile utilizza estrazione Soxhlet e transesterificazione per ottenere rese superiori al 90%.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (CHE-1.151.492), il Nord-Ovest avanzata Renewables Alliance (borsa di studio di J. Wilson-Peltier), e attraverso una donazione privata da parte di amici di WHOI. Ringraziamo Kevin R. Steidley e Kim Ascherl (USDA / ARS / NCAUR) per un&#39;eccellente assistenza tecnica.

1. Le microalghe e biomassa Preparazione Nota: Il marine microalghe Isochrysis sp. &quot;T-iso&quot; utilizzato in questo studio può essere acquistato (vedi elenco dei materiali). Quantità Multi-chilogrammo di Isochrysis possono essere acquistati come una pasta umida congelata (Iso -paste) contenente circa 80% di acqua e il 20% della biomassa, ed è verde scuro quasi nero / colore con un odore pungente odore del mare. Isochrysis può anche essere acquistato come un luogo asciutto (95% secco) di colore giallo-marrone in polvere (Iso -powder) con un odore simile. <ol><li> Al fine di asciugare la pasta Isochrysis, aprire un pacchetto di 1 kg, tagliando un 1 - 2 pollici buco in un angolo del packaging in plastica con le forbici. </li><li> Comprimere circa 300 g di questa Isochrysis pasta attraverso il foro in 150 mm x 75 mm cristallizzando piatto per creare un sottile strato (~ 20 mm). </li><li> Lasciare la pasta ad asciugare a temperatura ambiente fino a quando diventa secca e squamosa (tipicamente, 48 -96 ore). Nota: tempi di asciugatura effettivi possono variare e dipendono dalla temperatura. Tuttavia, nessuna differenza è stata notata nei rendimenti o la qualità dei prodotti con tempi di asciugatura ancora più lunghi (fino a due settimane). Il processo di essiccazione può essere resa più uniforme e / o accelerata posizionando il piatto di cristallizzazione su una piastra calda (30 - 40 ° C). </li><li> Raschiare la biomassa secca dal piatto cristallizzare con una spatola e raccogliere in una estrazione di cellulosa ditale (lunghezza: 123 millimetri, 43 millimetri ID). Registrare il peso della biomassa Isochrysis secca. </li></ol> 2. Soxhlet Estrazione di Dry Isochrysis biomassa <ol><li> Caricare un Isochrysis -aventi tenore di estrazione della cellulosa ditale (tipicamente 50 - 60 g di biomassa secca) in un apparato per estrazione Soxhlet. </li><li> Riempire il pallone di Soxhlet con esano (400 ml), attivare la sorgente acqua condensatore e calore, e consentire l&#39;Soxhlet pedalare per 24 - 48 ore (finché il colore del solvente va dal verde scuro altenue giallo). </li><li> Spegnere il fuoco e lasciare l&#39;apparato per raffreddare a temperatura ambiente, poi staccare il pallone dalla estrazione Soxhlet. </li><li> Rimuovere le esani usando un evaporatore rotante e registrare il peso del materiale esani-estraibili ( &quot;olio esano algale&quot; (h-AO)). </li></ol> 3. saponificazione del olio algale e separazione di acidi grassi e lipidi neutri <ol><li> Al residuo h-AO nello stesso pallone a fondo rotondo da passaggio 2.4 con metanolo: diclorometano (2: 1, volume = 10 x massa di olio algale). </li><li> Aggiungere un ancoretta e allegare un refrigerante a ricadere (Coil: 500 mm di lunghezza). </li><li> Aggiungere H 2 O (volume = 2,67 x massa di olio algale) e KOH (50% w / w olio algale) e riscaldare il contenuto sotto agitazione a 60 ° C per 3 ore. </li><li> Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, rimuovere i solventi organici (metanolo e diclorometano) su un evaporatore rotante. </li><li> Trasferire la miscela acquosa restante versando in un 1-L Imbuto separatore. Aggiungere esano (equivalenti in volume, a soluzione acquosa), scuotere l&#39;imbuto separatore, e permettono gli strati si separino. </li><li> Scolate lo strato acquoso inferiore in una beuta, e versare la fase organica superiore in un Erlenmeyer separata. </li><li> Ripetere le fasi 3.5 e 3.6 finché lo strato organico è incolori (tipicamente 1-2 più volte). </li><li> Concentrare gli estratti organici riuniti su un evaporatore rotante per isolare i lipidi neutri come verdastro solido (mp ≈ 60 -. 70 ° C). </li><li> Acidificare fase acquosa con HCl (6 M, fino a pH ~ 2 come indicato dalla carta pH). </li><li> Estrarre il acidi grassi liberi (FFA) dalla fase acquosa acidificata con esani (Equivolume alla fase acquosa) utilizzando un 1 L separatore imbuto come descritto ai punti 3.5 e 3.6. </li><li> Rimuovere le esani su un evaporatore rotante per ottenere le FFAs come verde residuo scuro quasi nero oleoso (liquido a temperature&gt; 30 ° C). </li></ol> 4.Acido-catalizzata esterificazione degli acidi grassi liberi e produzione di una Biodiesel verde <ol><li> Trasferire i FFAs utilizzando metanolo: cloroformio (1: 1, 6 x volume di olio algale) per sciogliere prima i FFAs e poi versando in un pallone di reazione ad alta pressione a parete spessa dotata di un ancoretta. </li><li> Aggiungere H 2 SO 4 concentrato (20% w / w olio algale), sigillare il pallone e scaldare la miscela a 90 ° C sotto agitazione per 1 ora. </li><li> Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, trasferire il composto versando in un imbuto separatore. </li><li> Aggiungere H 2 O (2 x volume di olio algale), agitare l&#39;imbuto separatore, e permettono separare le fasi. </li><li> Drain lo strato inferiore in un pallone a fondo tondo pre-pesato e concentrarsi su un evaporatore rotante. Registrare la massa del biodiesel risultante. </li><li> Analizzare il profilo degli acidi grassi mediante gascromatografia con rilevatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID) 28 (gascromatografo dotato di DB-88 [(88% cyanopropyl) methylarylpolysiloxane] colonna (30 mx spessore 0,25 mm di diametro x 0.20 micron film). Nota: grassi comune esteri metilici degli acidi sono verificate in confronto tempo di ritenzione con i campioni autentici ottenuti in commercio. Inoltre, il gas spettrometria cromatografia di massa (GC-MS; gascromatografo accoppiato ad un rivelatore selettivo di massa) viene effettuata in condizioni identiche di programma di temperatura e di colonna per analizzare componenti quali C18: 4 per le quali non standard autentici sono disponibili con i risultati applicati di GC quantificazione. </li></ol> 5. Biodiesel decolorazione <ol><li> Riscaldare il biodiesel di colore verde scuro a 60 ° C in un pallone a fondo tondo dotato di un ancoretta. </li><li> Aggiungere montmorillonite in polvere K 10 (MK10) (10-20% w / w del biodiesel) e mescolare per 1 ora. </li><li> Rimuovere il fondo rotondo dal fuoco e lasciare che la soluzione per raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare un apparato di filtrazione consistente in un pallone a fondo tondo e divertente filtronel contenente un filtro di carta di cellulosa (Ash 0,007%). </li><li> Versare il biodiesel decolorato raffreddato attraverso l&#39;imbuto filtro con una quantità minima di esani per lavare il pallone a fondo tondo. </li><li> Scollegare l&#39;imbuto filtrante dal pallone a fondo tondo (questo contiene ora una soluzione esano del biodiesel decolorato) e rimuovere le esano con un evaporatore rotante per permettersi un arancio / rosso biodiesel. </li><li> Conservare i campioni a 4 ° C durante la quale alcuni assestamento di materiale insolubile (~ 10% w / w) si verificherà. </li><li> Rimuovere il materiale insolubile per decantazione o filtrazione come descritto al punto 5.4 e 5.5 per produrre un biodiesel omogenea chiara per l&#39;analisi. </li></ol> 6. Isolamento e purificazione di Alkenones dai lipidi neutri <ol><li> Sciogliere i lipidi neutri (dal punto 3.8) in una quantità minima di diclorometano (circa 50 ml per 10 g di lipidi neutri) e aggiungere la soluzione con una pipetta alla sommità di una colonna cromatografica (O.D 60 mm, ID 55 mm, lunghezza 18 &quot;) contenente gel di silice (230-400 mesh, 100 g). </li><li> Eluire la soluzione attraverso la silice con pressione (~ 5 psi) diclorometano (circa 150 ml) come solvente e raccogliere l&#39;eluente in un pallone da 250 ml a fondo tondo. </li><li> Rimuovere il diclorometano con un evaporatore rotante per dare un solido di colore arancione. </li><li> Ricristallizzare pieno con esano aggiungendo circa 100 ml di esano bollente seguiti da importi supplementari incrementali di esano bollente fino a che la soluzione risulti omogenea (volume totale ~ 150 ml). Poi, lentamente raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per promuovere la cristallizzazione. </li><li> Raccogliere le alkenones cristallizzato utilizzando un apparato di filtrazione come descritto nel passaggio 5,4 utilizzando una piccola quantità di freddo (0 ° C) esani per risciacquare il matraccio. </li></ol>

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<li>Valenzuela-Espinoza, E., Millán-Núñez, R., Protein Núñez-Cebrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein%2C+carbohydrate%2C+lipid+and+chlorophyll+a+content+in+Isochrysis+aff.+galbana+%28clone+T-Iso%29+cultured+with+a+low+cost+alternative+to+the+f%2F2+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Eng%22%5BJournal%5D)">Protein, carbohydrate, lipid and chlorophyll a content in Isochrysis aff. galbana (clone T-Iso) cultured with a low cost alternative to the f/2 medium.</a> Aquacult. Eng. 25, 207-216 (2002).</li>
<li>Kulkarni, M. G., Dalai, A. K., Bakshi, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+green+seed+canola+oil+for+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Utilization of green seed canola oil for biodiesel production.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 81, 1886-1893 (2006).</li>
</ol>

La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha il solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica una raccomandazione o un'approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. L'USDA è un fornitore e datore di lavoro per le pari opportunità.

Isochrysis è uno di soltanto un ristretto numero di specie di alghe allevamento industriale, raccolte come componente primaria di mangimi crostacei, e quindi rappresentativo della scala necessaria per la produzione di biocarburanti. La disponibilità delle alghe utilizzate e metodi standard utilizzati in questo studio, rendono il protocollo presentato ampiamente accessibili ad altri gruppi per ulteriori indagini. Passaggi critici includono aria asciugare le alghe (al contrario di liofilizzazione di 33), estrazioni di solventi, di saponificazione, e esterificazione. Attraverso queste operazioni si può esaminare rese di lipidi e altri coprodotti dalla varie Isochrysis disponibili 30. Si prevede che questi possono differire a causa delle diverse tensioni e metodi di coltivazione, 31 e possono anche essere influenzato dalla natura del prodotto e ogni ulteriore trasformazione (ad esempio, essiccazione o congelamento) utilizzato dal fornitore. Come abbiamo dimostrato qui, il protocollo di sviluppareed può essere efficacemente applicato a diversi tipi di Isochrysis prodotti, che vanno da un impasto umido per una polvere macinata secca. I rendimenti di biodiesel erano comunque inferiore dalla biomassa polvere (7% w / w secco vs biomassa 12% w / w dalla pasta secca), che corrisponde con minori quantità di olio algale (h-AO) estratto. Questo può suggerire che un&#39;alternativa protocollo di estrazione 32 diverso da un apparecchio Soxhlet può essere più adatto per prodotti secchi Isochrysis polvere. La polvere Isochrysis utilizzato in questo studio è pubblicizzato come contenente 23-25% di lipidi, che simile a quello che abbiamo ottenuto sperimentalmente dalla pasta secca Isochrysis. 33,34,26 Nonostante i diversi colori della biomassa a partire secca, la pasta Iso-Hao e Iso -powder-hao erano essenzialmente indistinguibili, sia di colore verde scuro / vicino solidi neri con punti di circa 50 ° C di fusione. È interessante notare che il rapporto di FFAs al labbro neutraids all&#39;interno dei due estratti in esano era diverso. Dopo la saponificazione e separazione dei lipidi neutri, abbiamo ottenuto 60% (w / w) FFAs e 40% (w / w) lipidi neutri dal Iso -paste-hao. La Iso-polvere-hao ha prodotto in media il 46% (w / w) FFAs e il 54% (w / w) lipidi neutri. I risultati suggeriscono che oi partire biomassa polvere possono contenere una maggiore quantità di lipidi neutri relativi a derivati ​​FA rispetto alla pasta Isochrysis, o che Soxhlet estrazione di polvere Isochrysis è alquanto selettivo per lipidi neutri. Non solo le rese di prodotti ottenuti dai due Isochrysis commerciale biomasse diversa, ma anche i profili degli acidi grassi del biodiesel risultante. Questo è importante, in quanto le proprietà del carburante di un biodiesel sono direttamente dipendenti dalla natura e il contenuto dei singoli FAMEs. 35 per essere commercializzato, tutto il biodiesel deve essere conforme agli standard descritti nei documenti ASTMD6751 o EN 14214 rispettivamente negli Stati Uniti o in Europa. Le specifiche includono intervalli per lubrificante e viscosità cinematica, e valori minimi per numero di cetano e stabilità ossidativa. Altre importanti raccomandazioni sono legati alla proprietà di scorrimento a freddo sotto forma di una nuvola di punti (CP) o un filtro Punto di intorbidimento (CFPP). Abbiamo precedentemente riportato i risultati della sperimentazione di carburante completo di biodiesel preparata dalla pasta di Iso. 36 Dato che il profilo fama di biodiesel prodotto dalla -powder Iso in questo studio è simile a quelli precedentemente testato, possiamo prevedere alcune proprietà del carburante essere simili per entrambi i carburanti biodiesel. Per esempio, gli acidi grassi polinsaturi (PuFAMEs, più di due doppi legami) rappresentano circa il 40% di entrambe le miscele FAME (35,2% e 39,9%, Tabella 2). Ciò comporta una scarsa stabilità ossidativa e favorevole freddo flusso. 35 Vi sono, tuttavia, lievi differenze nei profili FAME dei due biodiecombustibili Sel. Biodiesel prodotto dalla polvere Isochrysis conteneva quantità maggiori di 14: 0 (19,4 mg / g vs 16,4 mg / g), 18: 3 (13,5 mg / g vs. 8,5 mg / g), e 22: 6 (11,0 mg / g vs. 6,9 mg / g) FAMEs, ancora minori quantità di 18: 4 (10,4 mg / g vs 19,8 mg / g). La portata dell&#39;impatto di queste differenze sulle varie proprietà del carburante contenute nelle norme ASTM resta ancora da esplorare. Il biodiesel iniziale ottenuto da entrambi commerciale Isochrysis alghe erano allo stesso modo di colore verde scuro, che può essere spiegato con la presenza di clorofilla. 36 clorofilla ei suoi derivati ​​sono stati segnalati per avere un effetto negativo sulla stabilità degli oli vegetali e dei loro carburanti biodiesel corrispondenti. 36,29 sulla base del metodo di Issariyakul e Dalai per decolorante olio di canola greenseed in connessione con la produzione di biodiesel, 29 mescolando il biodiesel verde oltre il 10% (w / w) MK10 a 60 ° C per 1 ora determinato un drammaticoriduzione del contenuto di pigmento mediante ispezione visiva (rif. figura 2). recuperi di massa dal processo di decolorazione sono stati in media del 90%. I rendimenti di alkenones purificati da Iso-pasta-hao e isobutano lipidi neutri polvere-hao erano paragonabili al 40% e il 46% w / w rispettivamente (Tabella 1). Dal momento che i lipidi neutri rappresentano una proporzione maggiore di materiale contenuto nel Iso-polveri-hao (54% w / w contro il 40% w / w), alkenone resa dalla Iso-polvere-hao supera la Iso-rendimento alkenone pasta-hao di circa il 10% (25% w / w vs. 16% w / w). Tuttavia, considerando che i rendimenti del Iso-polvere-hao si erano inferiori Iso-pasta-hao (15% vs. 20% w / w), i rendimenti complessivi di alkenones da entrambe le biomasse Isochrysis secchi sono più simili (0,2 x 0,4 x 0,4 = 3,2% w / w dalla pasta Isochrysis essiccati e 0,15 x 0,54 x 0,46 = 3,7% da Isochrysis polvere).

C&#39;è stata recentemente una grande rinascita di interesse per biocarburanti da alghe, in particolare per la produzione di combustibili liquidi come il biodiesel 1 e altri oli derivati ​​da biomassa. 2 vantaggi proposte comprendono la prevenzione di alcuni alimenti rispetto a controversie di carburante 3 e produttività riferito superiori e le capacità di CO 2 di mitigazione di colture agricole tradizionali. 4 Questo segue i quasi 20 anni United States Department of Aquatic Specie Programma di Energia (ASP) ha iniziato nel 1978 con lo scopo di indagare carburante per il trasporto dalle alghe. Come indicato nella relazione di Sheehan, 5 il programma si è concluso nel 1996, soprattutto a causa dei costi prospettati non erano competitivi con il petrolio greggio in quel momento ($ 18,46 al barile (159 L)). Mentre il costo del petrolio è aumentato drammaticamente da allora (87,39 $ al barile nel 2014) 6, che è collegato alla rinascita nella ricerca di biocarburanti algali, alcuni have sostenuto che comunque biocarburanti algali si rivelerà troppo costoso. 7 Come una strategia per compensare i costi di produzione di biocarburanti, la nozione di coprodotti a valore aggiunto è emerso sia tra i critici 7,8 e 9,10 proponenti e funzioni come una delle ragioni principali per perseguire biocarburanti algali del Dipartimento dell&#39;energia degli Stati Uniti (DOE) &quot;National algali biocarburanti Technology Roadmap&quot;. 11 Qui si descrive un metodo per la coproduzione di due flussi di combustibile separati da microalghe commerciale Isochrysis. Ci siamo concentrati su Isochrysis in parte perché è già prodotto industrialmente, raccolti per scopi di maricoltura, e anche perché Isochrysis è uno dei pochi specie di alghe che oltre ai lipidi tradizionali (ad esempio, acidi grassi) biosynthesize una classe unica di composti noto come polinsaturi alkenones catena lunga. 12 strutture Alkenone sono caratterizzati da l<html> catene idrocarburiche ong (36-40 atomi di carbonio), da due a quattro non-metilene legami interrotti -double trans, e un metile o etile chetone (Figura 1). Alkenone insaturazione è sensibile alla temperatura crescente alghe, 13,14 tale che la proporzione del biinsaturo alkenone metil C37 (il cosiddetto &quot;indice di insaturazione&quot;) può essere utilizzato come proxy temperature superficiali ultimi 15 -. 20 Alkenones sono pensato di risiedere in corpi lipidici citoplasmatici e può essere più abbondante di trigliceridi (TAG). 21,22 sotto azoto o la limitazione di fosforo, fino al 10-20% di carbonio delle cellule in fase stazionaria è accumulato come alkenones. 23,24 Dal punto di vista evolutivo, alkenones potrebbe essere stata favorita rispetto TAG perché la loro geometria trans legame -double fornisce una forma più stabile di immagazzinamento di energia. 21 189fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Strutture di polinsaturi alkenones a catena lunga alkenone Comune metile. 37: 3 isolati da Isochrysis esemplificando lunghezze di catena lunga di idrocarburi (36 - 40 atomi di carbonio), trans non metilene interrotti doppi legami, e che termina in un metile o etil chetone. Nomenclatura è simile agli acidi grassi dove #: # si riferisce a numero di atomi di carbonio:. Numero di doppi legami <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig1large.jpg" target="_blank">prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Noi sosteniamo che alkenones rappresentano una promettente materie prime rinnovabili di carbonio da un&#39;alga comune con una storia di coltivazione industriale. 25 biodiesel prodotto direttamente dall&#39;estratto lipidico totale di Isochrysis contiene una quantità significativa (10-15% w / w) di alkenones e contaminazione da questi composti ad alta fusione si traduce in scarse proprietà del combustibile di flusso freddo. Tuttavia, utilizzando tegli tecniche saponificazione / estrazione qui descritte, alkenones può essere rimosso e recuperato migliorando così la qualità biodiesel mentre produce una corrente di prodotto secondario. Recentemente abbiamo dimostrato la conversione di alkenones ad un combustibile liquido mediante cross-metatesi con 2-butene (butenolysis). 26 La reazione butenolysis impiega un rutenio commerciale di metatesi-iniziatore, avviene rapidamente a bassa temperatura, e pulito fornisce una miscela prevedibile di carburante idrocarburi gamma. Questa reazione viene effettuata in parallelo con la sintesi di biodiesel da acidi grassi, che rappresentano i primi passi verso un approccio di &quot;bioraffineria&quot; 27 per la produzione di biocarburanti Isochrysis commercialmente valido.

<table><tbody><tr><td>Isochrysis</td><td>Reed Mariculture</td><td>Iso, grezzo, non trasformato, 20% dw</td><td>Pasta di coltura viva, 20% p/p biomassa</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Necton, S.A</td><td>AADISS004</td><td>PhytoBloom Prof Isochrysis (liofilizzato)</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Chemical</td><td>H291-4</td><td>ACS Certificato</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-4</td><td>HPLC Grado</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Chemical</td><td>D37-4</td><td>Certificato/Stabilizzato</td></tr><tr><td>Soxhlet Apparatus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64826</td><td></td></tr><tr><td>Estrazione</td><td>Ditale Sigma Aldrich</td><td>64842</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chner Funnel</td><td>Chemglass</td><td>CG-1406-25</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente di reazione ad alta pressione</td><td>Chemglass</td><td>CG-1880-12</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Carta da filtro</td><td>GE Life Sciences</td><td>1442-042</td><td>Grado 42, Ceneri 0,007%, cerchio, 42,5 mm</td></tr><tr><td>Biodiesel (B100)</td><td>Bellingham Shell</td><td></td><td>Il biodiesel (B100) in Figura 3 è stato acquistato presso una stazione di rifornimento locale: Bellingham Shell, Bellingham, WA 98226</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Aquacave</td><td></td><td>Oltre a Reed e Necton, Isochrysis può essere acquistato anche da Aquacave (Gurnee, IL) all'indirizzo: www.aquacave.com (consultato il 30 settembre 2015).</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Isochrysis può essere acquistato anche da Brine Shrimp Direct (Ogden, UT) all'indirizzo: www.brineshrimpdirect.com (consultato il 30 settembre 2015).</td></tr></tbody></table>

protocollo sperimentale per produzione di biodiesel con isolamento di alkenones come coprodotti da commercial<em&gt; isochrysis</em&gt; biomassa algale

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

La necessità di sostituire i combustibili derivati ​​dal petrolio con alternative da fonti rinnovabili ecosostenibili e più è di crescente importanza. biocarburanti derivati ​​da biomassa hanno guadagnato una notevole attenzione a questo proposito, tuttavia biocarburanti di prima generazione da colture commestibili come l&#39;etanolo di mais o di soia biodiesel sono in genere caduto in disgrazia. Vi è quindi grande interesse per lo sviluppo di metodi per la produzione di combustibili liquidi da fonti non commestibili domestici e superiori. Qui si descrive una procedura dettagliata per la produzione di un biodiesel purificato dalla microalga Isochrysis marino. Inoltre, una suite unica di lipidi polinsaturi conosciuti come alkenones a catena lunga sono isolati in parallelo, come coprodotti potenzialmente preziose per compensare i costi di produzione di biodiesel. Quantità Multi-chilogrammo di Isochrysis vengono acquistati da due fonti commerciali, uno come pasta umida (80% di acqua) che viene prima essiccati prima della lavorazione, e il otlei una polvere macinata secca (95% secco). I lipidi sono estratti con esano in un Soxhlet per produrre un olio algale ( &quot;olio esano algale&quot;) contenente sia i grassi tradizionali (cioè, trigliceridi, 46-60% w / w) e alkenones (16-25% w / w). Saponificazione dei trigliceridi nel olio algale permette la separazione delle risultanti acidi grassi liberi (FFA) da lipidi neutri alkenone contenenti. FFAs vengono poi convertiti in biodiesel (ad esempio, acidi grassi esteri metilici, fames) per esterificazione l&#39;acido-catalizzata mentre alkenones sono isolate e purificate dai lipidi neutri di cristallizzazione. Abbiamo dimostrato che il biodiesel da entrambe le biomasse commerciali Isochrysis hanno profili FAME simili ma non identici, caratterizzato da elevati contenuti di acidi grassi polinsaturi (circa il 40% w / w). I rendimenti di biodiesel sono stati costantemente più elevato quando a partire dalla pasta umida Isochrysis (12% w / w contro 7% w / w), che possono essere ricondotti a minori quantità di esano alghe oil ottenuto dal prodotto Isochrysis polvere.

<html> Prima della lavorazione, la pasta Isochrysis (pasta Iso) è stato essiccato. Questo è comodamente effettuata su scala ingrandita aggiungendo il -paste Iso ad un grande piatto solido e permettendo al materiale di aria secca a temperatura ambiente. Durante l&#39;essiccazione, alcune forme acqua aggregati (generalmente di colore rossastro) che può essere rimosso per decantazione o pipettamento per accelerare il processo di essiccazione. Dopo circa 48 - 96 ore, la Isochrysis ormai secco può essere raschiato del piatto cristallizzare e ottenuto come / materiale friabile verde nero con un odore alghe simile (Figura 2). I rendimenti di biomassa secca erano generalmente del 20% w / w della pasta come pubblicizzato. Al contrario, il prodotto in polvere Isochrysis (polvere Iso) era un giallo-marrone, finemente macinato, polvere secca (95% secco) che è stato utilizzato direttamente senza ulteriore trattamento (Figura 2). figura 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54189 / 54189fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Confronto di pasta Isochrysis. Isochrysis commerciale (80% wet) si sviluppa lungo la parte inferiore di un piatto di cristallizzazione e lasciato asciugare a temperatura ambiente per 48-96 ore prima della lavorazione. Il Isochrysis essiccato risultante viene ottenuto come un materiale friabile di colore scuro (a destra) che è diverso in apparenza rispetto alla polvere secca commerciale Isochrysis (a sinistra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Estrazione sia del Iso polvere -paste o Iso essiccato mediante Soxhlet con esano ha dato, dopo la rimozione dei esani, oli algali (H-AO) che erano simili in apparenza come verde scuro / vicino-nero solidi (mp. ~ 50 -60 ° C). I rendimenti di h-AO, quando a partire dalla pasta ( &quot;Iso-pasta-hao&quot;) Erano in genere il 20% w / w della biomassa Isochrysis secca, in linea con i nostri risultati precedenti, 26 mentre i rendimenti di h-AO per estrazione Soxhlet della polvere Isochrysis commerciale (&quot; Iso-polvere-hao &quot;) erano il 15% w / w (Tabella 1). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Prodotto (g) </td><td> Iso -paste </td><td> Iso -powder-1 </td><td> Iso -powder-2 </td></tr><tr><td> biomassa secca </td><td> 30 </td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Esano algale Oil </td><td> 5.86 </td><td> 2.87 </td><td> 3.11 </td></tr><tr><td> FFAs </td><td> 3.52 </td><td> 1.34 </td><td> 1.38 </td></tr><tr><td> lipidi neutri </td><td> 2.34 </td><td> 1.38 </td><td> 1.61 </td></tr><tr><td> Alkenones </td><td> 0.94 </td><td> 0.63 </td><td> 0.74 </td></tr><tr><td colspan="4"> Note: Iso-polvere-1 e Iso-polvere-2 rappresentano i risultati di due campioni di polvere Isochrysis che sono state elaborate in parallelo. Per altri rapporti con i rendimenti di questi prodotti da ISO-incolla vedere i riferimenti 26, 32, e 33. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Rese di prodotto a partire dalla biomassa Isochrysis commerciale. Acilgliceroli in h-AO sono stati convertiti in sali carbossilati idrosolubile corrispondenti (cioè, saponi) dopo l&#39;aggiunta di KOH acquoso in metanolo / CH 2 Cl 2. lipidi neutri tra cui alkenones sono stati poi estratti da questa miscela acquosa con il partizionamento selettiva con esano. Dopo la rimozione dei lipidi neutri, reacidification dei saponi poi prodotto corrispondenti acidi grassi liberi (FFA) che potrebbero essere simile estratti dal aqfase ueous con esano. I recuperi di massa complessivi per FFAs combinati e lipidi neutri sia da Iso-pasta-hao o Iso -powder-hao erano costantemente nei pressi quantitativa. Tuttavia, il rapporto dei prodotti (cioè, lipidi neutri + FFA) era diverso. Dal Iso-pasta-hao abbiamo ottenuto il 60% (w / w) FFAs e il 40% (w / w) lipidi neutri (Tabella 1). Al contrario, Iso-polvere-hao dimostrato arricchito in lipidi neutri (media = 54% di lipidi neutri + 46% FFA) come indicato nella tabella 1. L&#39;esterificazione degli FFAs con H 2 SO 4 e metanolo poi prodotto esteri metilici di acidi grassi (FAME, cioè biodiesel) come verde scuro vicino liquido oleoso nero in più del 90% di resa (Figura 3). Decolorazione riscaldando oltre montmorillonite K10 29 (MK10) argilla poi ha dato un prodotto di colore giallo / arancio, di aspetto simile ad altri bi commercialecombustibili odiesel (vedi elenco dei materiali) (Figura 3). I risultati dell&#39;analisi FAME di biodiesel Isochrysis decolorata sono riportati nella Tabella 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54189/54189fig3.jpg" /> Figura 3. Confronto di Isochrysis e soia carburanti biodiesel. Verde Isochrysis biodiesel (al centro) è prodotto da esterificazione degli acidi grassi liberi estratto e purificato. Decolorazione produce un prodotto (a destra) con proprietà simili a biodiesel commerciale (a sinistra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> FAME A </td><td> Iso -paste </td><td> Iso -powder </td></tr><tr><td> 14:00 </td><td> 16,4 </td&gt; <td> 19.4 </td></tr><tr><td> 14:01 </td><td> - </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> 15:00 </td><td> traccia </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> 16:00 </td><td> 10.1 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> 16: 1 Δ9 </td><td> 7.6 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> 16:02 </td><td> ND </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> 16:03 </td><td> ND </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 18:00 </td><td> Traccia </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 18: 1 B </td><td> 12.1 </td><td> 14.3 </td></tr><tr><td> 18:02 </td><td> 8.1 </td><td> 7.1 </td></tr><tr><td> 18: 3 C </td><td> 8.5 </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td> 18:04 </td><td> 19.8 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> 18:05 </td><td> ND </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 20:05 </td><td> ND </td><td> - </td></tr><tr><td> 22:05 </td><td> ND </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 22:06 </td><td> 6.9 </td&gt; <td> 11 </td></tr><tr><td> Σ D </td><td> 89.8 </td><td> 96,2 </td></tr><tr><td colspan="3"> Note: Un nomenclatura acido grasso è #carbons:. # Cis obbligazioni -double B Combinato 18: 1 Δ9 + 18:.. 1 Δ11 C combinata Δ6,9,12 e Δ9,12,15 isomeri D Il restante materiale è circa il 50 : 50 altre FAMEs e componenti non-FAME (Total ~ 95% FAME). ND = non rilevato. </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Composizione FAME di biodiesel prodotto da -Past commerciale Iso e Iso -powder Isochrysis biomassa. Lipidi neutri sono stati ottenuti da una miscela solida verdastro al 40% w / w dalla Iso -paste-Hao e il 54% (avg.) Dalla Iso-polvere-hao (Tabella 1). Filtraggio dei lipidi neutri disciolti attraverso silice usandoDCM dato dopo la rimozione del solvente, un rossiccio / arancione solido che può essere ricristallizzato con esani permettersi alkenones analiticamente puro come solido bianco. Questa procedura ha portato al 16% (w / w) resa isolata di alkenones da Iso-pasta-hao e la resa del 25% da Iso -powder-hao (Tabella 1).

Metodi dettagliati sono presentati per la produzione di biodiesel con il co-isolamento alkenones come coprodotti preziosi microalghe commerciale Isochrysis.

Protocollo sperimentale per produzione di biodiesel con isolamento di Alkenones come coprodotti da Commercial<em&gt; Isochrysis</em&gt; Biomassa algale

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre biodiesel a partire da Isochyrsis Algal disponibile sul mercato, consentendo al contempo l'isolamento concomitante di alchenoni a catena lunga come co-prodotto di valore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'energia rinnovabile, ad esempio se i biocarburanti derivati da alghe rappresentino alternative valide ai combustibili di origine petrolifera.Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'alga che utilizziamo viene già coltivata a livello industriale e può essere acquistata in quantità di diversi chilogrammi da diversi fornitori commerciali. Inoltre, queste particolari alghe biosintetizzano un gruppo unico di lipidi noti come alchenoni a catena lunga, che possono essere isolati come prodotto secondario. La procedura sarà dimostrata da John Williams, uno studente laureato del mio laboratorio.Per preparare la pasta commerciale umida di isocri, praticare un piccolo foro in un pacchetto da un chilogrammo ed estrarre circa 300 grammi su una capsula di cristallizzazione di dimensioni 150 per 75 millimetri. La pasta contiene circa l'80% di acqua, è di colore verde scuro, quasi nero, e ha un odore pungente. Far asciugare la pasta all'aria per creare uno strato spesso circa 20 millimetri.Scrapare la biomassa secca nel bicchierino di estrazione della cellulosa di massa nota. Quindi registrare il peso della biomassa di isocriasi. Trasferire circa 50-60 grammi di isocriasi secca in un apparecchio di estrazione Soxhlet.Quindi, riempire il pallone di estrazione Soxhlet con 400 millilitri di esani. Accendere l'acqua del condensatore e la sorgente di calore e lasciare ciclare il Soxhlet per uno o due giorni. Quando il colore del solvente sarà passato dal verde scuro a un giallo tenue, l'estrazione sarà completa.Raffreddare a temperatura ambiente e utilizzare un evaporatore rotante per rimuovere gli esa ni. Infine, pesare l'olio algale in esani. Iniziare sciogliendo l'olio algale in esani nel suo matraccio con 10 volumi di una miscela di metanolo e diclorometano in rapporto due a uno.Aggiungere quindi una barretta di agitazione e due parti e due terzi di acqua rispetto al volume dell'olio, e aggiungere una massa di idrossido di potassio pari alla metà del peso dell'olio. A questo punto, collegare il pallone a un condensatore a riflusso lungo 500 millimetri. Riscaldare la miscela sotto agitazione a 60 gradi Celsius per tre ore in una cappa da laboratorio.Dopo aver raffreddato la reazione, rimuovere i solventi organici con un evaporatore rotante. Successivamente, versare la miscela acquosa rimanente in un imbuto separatore da un litro e aggiungere un volume uguale di esa ni. Risciacquare il pallone con gli esa ni per assicurarsi che tutto il materiale venga trasferito nell'imbuto.Agitare il imbuto e lasciare separare gli strati. Successivamente, scaricare lo strato acquoso inferiore in un matraccio e versare lo strato organico superiore in un secondo matraccio. Conservare entrambi gli strati.Ripetere l'estrazione con esano fino a quando lo strato organico non diventa un giallo-verde tenue. Quindi combinare gli estratti organici raccolti ed evaporarli con un evaporatore rotante per isolare i lipidi neutri. Questi lipidi appaiono come un solido verdastro e hanno un punto di fusione compreso tra 60 e 70 gradi Celsius.Successivamente, acidificare la fase acquosa fino a un pH di due utilizzando acido cloridrico 6 M. Quindi, estrarre gli acidi grassi liberi dalla fase acquosa acidificata usando esani e un imbuto separatore come in precedenza. Infine, rimuovere gli esani dai estratti organici combinati mediante un evaporatore rotante per ottenere acidi grassi liberi purificati.Un residuo oleoso scuro verde, quasi nero, che fonde appena sopra i 30 gradi Celsius. Sciogliere gli acidi grassi utilizzando sei volumi di metanolo cloroformio, quindi versare la soluzione in un robusto flacone per reazioni ad alta pressione con un'ampia camera e una barretta agitatrice, risciacquando per assicurare il trasferimento completo degli acidi grassi nel flacone di reazione. Successivamente, sotto cappa, aggiungere acido solforico concentrato.Sigillare il pallone e riscaldare la miscela a 90 gradi Celsius sotto agitazione per un'ora. Dopo aver raffreddato la reazione a temperatura ambiente, versarla in un imbuto separatore e aggiungere due volumi di acqua. Agitare ora l'imbuto separatore, lasciare separare le fasi e scaricare lo strato inferiore in un pallone a fondo rotondo pre-pesato.Quindi, concentrare la soluzione utilizzando un evaporatore rotante e registrare la massa del biodiesel ottenuto; la sostanza può ora essere analizzata mediante cromatografia gassosa. I lipidi neutri possono essere raschiati dal fondo rotondo, pesati e trasferiti in un matraccio per la purificazione. Iniziare sciogliendo i lipidi neutri in una quantità minima di diclorometano.Successivamente, applicare la soluzione su una colonna cromatografica contenente 100 grammi di gel di silice. Poi, utilizzare una leggera pressione per eluire la soluzione attraverso la silice con circa 150 millilitri di diclorometano. Uno strato sottile di sabbia viene aggiunto sulla sommità della colonna per evitare che la silice venga perturbata durante il riempimento con il solvente.Raccogliere l'estratto in un pallone rotondo da 250 millilitri. Quindi rimuovere il diclorometano mediante evaporazione rotativa. Il risultato dovrebbe essere un solido di colore arancione.Ricristallizzare i solidi in esani bollenti. Aggiungere prima 100 millilitri iniziali e quindi continuare ad aggiungere esani bollenti fino a quando la soluzione diventa omogenea. Successivamente, raffreddare lentamente la soluzione a temperatura ambiente per favorire la cristallizzazione e raccogliere gli alchenoni cristallizzati mediante un apparato di filtrazione.Utilizzare un piccolo volume di esani ghiacciati per risciacquare il pallone. Prima dell'elaborazione, la pasta di isocri si è prima essiccata per ottenere un materiale nero, verde e friabile con un odore simile a quello delle alghe. Al contrario, l'isocri in polvere era una polvere secca giallo-marrone finemente macinata, utilizzata senza ulteriore elaborazione.L'estrazione da entrambi i materiali mediante Soxhlet con esani ha prodotto oli algali con rese notevolmente più elevate a partire dalla pasta rispetto alla polvere. Gli acilgliceroli presenti nell'olio algale sono stati convertiti in carbossilati solubili in acqua, dai quali lipidi neutri e acidi grassi liberi sono stati estratti in volume quasi quantitativo da entrambi i materiali di partenza. Tuttavia, il rapporto tra i prodotti era diverso.L'esterificazione ha prodotto esteri metilici degli acidi grassi. Conosciuti anche come biodiesel, un liquido oleoso verde scuro, quasi nero. La resa ha superato il 90%. Il prodotto è stato decolorato come descritto nel protocollo del testo.L'analisi FAME dei combustibili biodiesel purificati ha mostrato profili simili ma non identici provenienti dai due materiali di partenza. Filtrando i lipidi neutri disciolti attraverso la silice utilizzando DCM, si ottiene un solido arancio rossastro che è stato ricristallizzato con esani fino a ottenere alchenoni puri dal punto di vista analitico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come processare l'isochrisi disponibile in commercio in biodiesel, isolando alchenoni puri come prodotto secondario.Una volta padroneggiata, questa tecnica può produrre in modo costante notevoli quantità di biodiesel algale e alchenoni per ulteriori studi. Con il suo sviluppo, questa tecnica ci ha permesso di esaminare in modo critico le proprietà del combustibile del biodiesel algale, fornendo quantità sufficienti per eseguire i vari test sul combustibile, piuttosto che basarci su previsioni o simulazioni. Non dimenticare che lavorare con acidi o basi forti e riscaldare i contenuti all'interno di un recipiente sigillato può essere estremamente pericoloso.Assicurarsi di indossare idonei dispositivi di protezione personale e di lavorare in una cappa aspirante durante l'esecuzione di questi passaggi.

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Fonte: Ginies, C., et al. Identificazione degli acidi grassi nel Bacillus cereus. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra il processo di preparazione degli esteri metilici degli acidi grassi (FAME) da campioni batterici trattando la biomassa con una soluzione alcalina, seguita dalla separazione di fase e dall'evaporazione del solvente per l'analisi a valle.

Preparazione di esteri metilici degli acidi grassi (FAME) da biomassa batterica

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