Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

L'obiettivo generale di questo metodo è valutare l'integrità del DNA libero da cellule urinarie in specifiche sequenze oncogeniche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro urologico, come la diagnosi precoce non invasiva del cancro alla vescica e alla prostata. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da fare e da analizzare.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di neoplasie urologiche, perché normalmente rilasciano cellule e acidi nucleici liberi nelle urine. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui campioni urinari, può essere applicato anche ad altri sistemi come il siero o il plasma. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avrebbero difficoltà perché la concentrazione di DNA libero da cellule urinarie è spesso bassa.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di trovare un metodo semplice per la diagnosi precoce non invasiva del cancro alla vescica. Per iniziare la procedura, ottenere un campione di urina del primo mattino da 50 millilitri che è stato conservato a quattro gradi Celsius per non più di tre ore. Capovolgere il campione due volte e poi suddividere il campione in due provette da centrifuga coniche da 50 millilitri.

Centrifugare il campione a 850 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, per ogni provetta trasferire 10 millilitri della parte superiore del surnatante in due provette da cinque millilitri, lasciando almeno due millilitri di surnatante sopra il pellet. Scartare i pellet e conservare il surnatante a meno 80 gradi Celsius.

Ripetere questo processo per ulteriori campioni di urina, se necessario. Per iniziare la purificazione del DNA, per ogni campione scongelare un'aliquota di surnatante urinario. Agitare il campione scongelato e capovolgere il tubo due volte.

Mettere un millilitro di campione in una provetta da cinque millilitri e conservare il resto a meno 80 gradi Celsius. Preparare un kit di purificazione del DNA adatto per campioni di urina secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 100 microlitri di proteinasi K e un millilitro di tampone di lisi al campione e mescolare bene con una pipetta.

Incubare il campione a 56 gradi Celsius per 15 minuti. Durante l'incubazione, preparare i tamponi di lavaggio in una colonna di centrifuga. Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente, quindi aggiungere un millilitro di etanolo assoluto e mescolare bene pipettando.

Trasferire 650 microlitri di campione nella colonna. Centrifugare a 6000 volte G per un minuto. Riposizionare la provetta di raccolta e ripetere questo processo fino a quando tutto il campione non è stato caricato sulla colonna.

Quindi aggiungere 500 microlitri del primo tampone di lavaggio e centrifugare la colonna a 6000 volte G per un minuto. Sostituire la provetta di raccolta, aggiungere 500 microlitri del secondo tampone di lavaggio e centrifugare la colonna alla massima velocità per tre minuti. Posizionare la colonna in una provetta di raccolta pulita e centrifugare alla massima velocità per altri tre minuti per rimuovere il tampone di lavaggio residuo.

Trasferire la colonna in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Caricare 50 microlitri di tampone di eluizione sulla colonna e lasciare che il tampone si impregni nella colonna per sette minuti. Quindi centrifugare la colonna a 6000 volte G per un minuto.

Pipettare nuovamente l'eluato nella colonna e centrifugare la colonna alla massima velocità per un minuto per ottenere il DNA privo di cellule urinarie. Per iniziare a preparare gli standard, isolare prima il DNA da una linea cellulare appropriata utilizzando un kit di purificazione. Quantificare il DNA di ogni campione di urina purificata nella linea cellulare con uno spettrofotometro secondo le istruzioni del produttore del kit.

Diluire il DNA UCF a un nanogrammo per microlitro e conservare i campioni diluiti a meno 20 gradi Celsius fino al momento del test di integrità. Diluire il DNA della linea cellulare per creare standard di sei, 100 microlitri di diverse concentrazioni. Conservare gli standard a meno 20 gradi Celsius.

Per iniziare il test di integrità del DNA, scongelare i campioni di DNA UCF, gli standard, i primer PCR appropriati e il supermix verde su ghiaccio. Quindi impostare la piastra del disco rotore a 72 pozzetti con tubi a strisce. Posizionare due aliquote da 10 microlitri di standard e quindi ciascun campione nei pozzetti.

Preparare due pozzetti di acqua priva di RNasi da 10 microlitri come controlli negativi. Per ogni pozzetto riempito, preparare una miscela di un microlitro di ciascun primer, 12,5 microlitri di supermix verde e 6,5 microlitri di acqua priva di RNasi. Trasferire 15 microlitri di miscela in ogni pozzetto riempito, quindi trasferire i pozzetti in un disco rotore da 72 pozzetti.

Eseguire la PCR con uno strumento in tempo reale secondo le specifiche del produttore. Utilizzando il software dello strumento, verificare se alcune repliche hanno una differenza di valore di soglia ciclica di uno o più. Scartare quei campioni dall'analisi e valutare la soglia di ciclo mediana per i campioni rimanenti.

Eseguire l'analisi di fusione su ciascun campione con un valore di soglia del ciclo mediano di 36 o inferiore per valutare la specificità del prodotto PCR. Quindi utilizzare la curva standard per determinare una concentrazione in nanogrammi per microlitro per ogni applicazione. Il DNA libero da cellule urinarie è stato isolato e l'integrità del DNA è stata valutata in quattro regioni che mostrano un aumento del numero di copie del DNA nei tumori solidi.

È stata inoltre valutata una sequenza di controllo per verificare che la quantità di DNA in ciascun campione fosse sufficiente per il test di integrità. Per ciascun gene sono stati calcolati la concentrazione totale di DNA libero e i coefficienti di variazione. Questo metodo mostra una sensibilità del 73% e una specificità dell'84% per rilevare il cancro della vescica, ma solo una sensibilità del 58% e una specificità del 44% per il cancro alla prostata.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una giornata lavorativa se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR digitale o il sequenziamento di nuova generazione per rispondere a ulteriori domande come l'induttore del numero di copie dei geni di interesse. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare il DNA libero da cellule dall'urina in modo molto semplice e di come studiare l'integrità di specifiche regioni di interesse utilizzando approcci di PCR in tempo reale.