Name: Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri l'analisi dell'integrità del DNA cell-free urinario per la diagnosi precoce non invasiva del cancro della vescica. Questo metodo semplice offre accuratezza nella rilevazione di malignità urologiche.

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Gli autori ringraziano Gráinne Tierney e Silvia Bellissimo per la loro assistenza editoriale.

Il protocollo segue le linee guida del Comitato Etico umana ricerca IRST. NOTA: In questo protocollo, abbiamo isolato il DNA da campioni di urina per eseguire un&#39;analisi di integrità UCF DNA. LNCaP e cellule MRC linee sono stati utilizzati per costruire gli standard. Tecniche come l&#39;estrazione del DNA, la quantificazione del DNA (spettrofotometro e real-time PCR per il gene di controllo, STOX1), e real-time PCR per oncogeni specifici sono stati eseguiti (Figura 1). 1. urina raccolta e lavorazione <ol><li> Ottenere un clean-cattura di prima mattina campione di urina in un bicchiere pulito, asciutto, di plastica. Raccogliere almeno 50 ml del campione di urina. </li><li> Mantenere l&#39;urina a 4 ° C per un massimo di 3 h ed inviarlo al laboratorio alla stessa temperatura. </li><li> Mescolare ogni campione invertendo due volte immediatamente dopo l&#39;arrivo in laboratorio e il trasferimento in due tubi di polipropilene a fondo conico da 50 ml. </li><li> Centrifugare le provettea 850 xg per 10 min a 4 ° C oa temperatura ambiente. </li><li> Trasferire accuratamente 10 mL della parte superiore del surnatante urine in due provette da 5 mL, lasciando almeno 2 mL del supernatante sopra il pellet di cellule. NOTA: Trasferire la parte superiore del surnatante riduce il rischio di contaminazione da cellule o detriti cellulari. Non c&#39;è una chiara demarcazione tra la parte superiore e quella inferiore. </li><li> Eliminare il pellet e congelare immediatamente il surnatante a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Isolamento del DNA dal surnatante delle urine e linee cellulari NOTA: Isolare il DNA da una linea cellulare (ad es, LNCaP per cancro alla prostata o MRC per il cancro della vescica) utilizzando un kit commerciale e seguendo le istruzioni del produttore. Isolamento del DNA dal surnatante urine deve essere eseguita utilizzando il protocollo commerciale, modificato come segue: <ol><li> Scongelare un&#39;aliquota del surnatante urine a temperatura ambiente. &lt;/ Li&gt; <li> Vortex e mescolare il campione di urina e trasferire 1 ml di surnatante urina in un chiaro tubo da 5 mL. Congelare l&#39;urina residua a -80 ° C. </li><li> Aggiungere 100 ml di proteinasi k direttamente al campione. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone AL al campione e mescolare bene pipettando. </li><li> Chiudere le provette e incubare i campioni a 56 ° C per 15 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, preparare una colonna per ogni campione e preparare i tamponi di lavaggio, AW1 e AW2, come da istruzioni del produttore (aggiungere l&#39;importo indicato di 100% di etanolo). </li><li> Portare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 1 ml di etanolo assoluto. Mescolare completamente pipettando. </li><li> Aggiungere 650 microlitri della miscela ottenuta nello stadio 2.7 alla colonna e centrifugare a 6000 xg per 1 min. </li><li> Eliminare il tubo contenente il flow-through e posizionare la colonna su un nuovo, tubo di raccolta pulito. Ripetere i punti 2.8 e 2.9 fino a quando tutta la miscela campione è stato utilizzato (5 volte). </li><li> Aggiungere 500 &amp;# 181; L di tampone AW1 senza bagnare il bordo della colonna. Centrifugare a 6000 xg per 1 min. </li><li> Eliminare il tubo contenente il flusso continuo e sostituirla con una nuova, tubo di raccolta pulita. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di tampone AW2 senza bagnare il bordo della colonna. Centrifugare alla massima velocità (20.000 xg) per 3 min. </li><li> Eliminare il tubo contenente il flusso continuo e sostituirla con una nuova, tubo di raccolta pulita. </li><li> Ripetere il passaggio 2.12 per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio. </li><li> Porre la colonna in una provetta pulita da 1,5 ml. Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione AE e attendere 7 minuti per garantire che le bagna tampone colonna. </li><li> Centrifugare a 8000 xg per 1 min. </li><li> Pipettare il eluente dal punto 2.15 nel mini-colonna e centrifugare alla massima velocità per 1 min per garantire il massimo recupero di DNA. </li></ol> 3. DNA Quantificazione e diluizione <ol><li> Utilizzando uno spettrofotometro, eseguire la quantificazione di DNA da both la linea cellulare ei campioni di urina supernatante. Utilizzare 2 ml di campione su uno spettrometro da banco, come da istruzioni del produttore. </li><li> Diluire i campioni UCF DNA per ottenere una concentrazione di 1 ng / ml e conservare il DNA a -20 ° C fino all&#39;analisi integrità del DNA. NOTA: Se la quantità di DNA non è sufficiente procedere con PCR in tempo reale (almeno 100 ng), eseguire un nuovo processo di isolamento del DNA. </li><li> Diluire il DNA da campioni di linee cellulari di ottenere sei standard con differenti concentrazioni: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 e 2 ng / ml, ciascuno con un volume di 100 microlitri (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, e ST6). Conservare le norme DNA linea cellulare a -20 ° C fino all&#39;analisi integrità del DNA. </li></ol> 4. DNA Integrity Test - PCR <ol><li> Scongelare i primer (la concentrazione dipende dal tipo di test), Supermix verde, standard nel DNA delle cellule-line, e campioni di DNA UCF diluito su ghiaccio. </li><li> Preparare le provette strip nella piastra Fo il disco di rotore 72 pozzetti. Aliquota 10 ml in duplicato per ciascuno standard e campione diluito e 10 ml di acqua RNase-free per il controllo negativo. </li><li> Preparare una miscela di 1 ml di ciascun primer (le concentrazioni sono riportati in Tabella 1), 12,5 ml di Supermix verde, e 6,5 ml di acqua priva di RNasi per ogni campione. Nel preparare la miscela, utilizzare il seguente numero di campioni: 6 standard per 2 repliche, numero di campioni per 2 repliche, controllo negativo per 2 repliche, e 2 campioni in più. </li><li> Aliquota 15 ml della miscela in ciascun pozzetto. Non pipetta o girare i tubi. </li><li> Avviare il protocollo con le condizioni di PCR indicati nella tabella 1. NOTA: Per il valore UCF DNA, 29 campioni di DNA sono stati trattati per ciascun esperimento in tempo reale utilizzando il disco rotore 72-bene: 29 x 2 campioni + 6 x 2 + standard negativo di controllo x 2 = 72 (valore UCF DNA). NOTA: Il protocollo per l&#39;analisi di integrità UCF DNA può anche essereeseguita utilizzando un altro strumento real-time PCR (quando si utilizza un altro dispositivo, colorante ROX potrebbe essere necessario aggiungere). </li></ol> 5. DNA Integrity Test - Analisi dei dati e interpretazione NOTA: Il valore UCF DNA per ciascun campione è stata ottenuta con un sistema software strumento di rilevamento in tempo reale utilizzando una costruzione curva standard per ogni singola valutazione gene PCR e mediante interpolazione curva standard, come descritto in precedenza 7-9 (Figura 2). <ol><li> Valutare le repliche; campione replica con una differenza ≥1 Ct deve essere scartata e ri-valutato in un secondo esperimento. </li><li> Calcolare la mediana Ct per ogni campione e prendere in considerazione campioni con un valore Ct ≤ 36. </li><li> Valutare la specificità dei prodotti di PCR utilizzando l&#39;analisi di fusione. </li><li> Valutare la concentrazione di ogni amplicone per interpolazione con la curva standard; ottenere un valore di concentrazione (ng / mL) per ogni amplicone.</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
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<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
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<li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li>
<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

UCF analisi dell&#39;integrità del DNA è un nuovo metodo, non invasivo per valutare l&#39;integrità del DNA nelle urine. E &#39;stato recentemente proposto per la diagnosi precoce della vescica e della prostata 9 7,8. Un certo numero di vantaggi e svantaggi del test di integrità del DNA UCF sono discussi qui, insieme con le prospettive future. Il principale vantaggio del metodo è che offre un metodo non invasivo e poco costoso un semplice protocollo per studiare l&#39;u...

-Free Cell DNA può essere rilevato nel sangue e nelle urine causa di morte cellulare da meccanismi apoptotici o necrotiche. DNA libero-Cell nel sangue è stata ampiamente studiata per scopi diagnostici e prognostici in varie malattie, in particolare il cancro 1. Tuttavia, meno si sa circa il ruolo del DNA urinario cell-free (UCF). UCF DNA può provenire da passaggio di sangue attraverso il sistema di filtrazione glomerulare o da cellule che entrano direttamente in contatto con questo corpo fluido 2 (ad esempio, cellule uroteliali o cellule prostatiche). L&#39;uso di UCF DNA come fonte di biomarker è stato principalmente studiato per la diagnosi precoce di renale, della vescica, della prostata e cancro a causa dell&#39;elevata percentuale di UCF DNA proveniente direttamente dalle cellule del tratto urinario 3,4. Poco si sa circa UCF DNA ed i migliori metodi per isolare e caratterizzare esso. Dato l&#39;ipotesi che le cellule tumorali rilasciano frammenti di DNA più lunghi rispetto alle cellule normali, la valutazionedell&#39;integrità DNA cell-free è stato studiato in un tentativo di chiarire l&#39;origine del DNA nella circolazione sanguigna 5. Alcuni studi hanno dimostrato che cell-free integrità del DNA nel sangue rappresenta un buon test diagnostico per molti tipi di cancro 6, e la stessa ipotesi è stata proposta in relazione agli urine 7-9. Questo documento descrive un nuovo metodo per UCF DNA analisi di integrità di una potenziale applicazione per il rilevamento del cancro della vescica e della prostata. In particolare, l&#39;integrità del DNA UCF frammenti più di 250 bp è stato testato in 4 regioni note per avere un maggior numero di copie di DNA nei tumori solidi, tra cui la prostata e tumore della vescica: c-Myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), e AR (Xq12) 10-14. oncogeni specifici, piuttosto che sequenze casuali, sono stati scelti per aumentare la probabilità di trovarle frazione priva di cellule di pazienti affetti da cancro. Uno dei principali vantaggi diquesto metodo è che è flessibile e che altre regioni può essere selezionato sulla base del tipo di tumore e caratteristiche.

<table><tbody><tr><td>Kit Mini DNA QIAamp &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Supermix verde, 100 x 50 & micro; L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>Purificazione HPLC, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spettrofotometro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Altri metodi spettrofotometrici potrebbero essere utilizzati anche per quantificare il DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Un altro strumento di PCR in tempo reale potrebbe essere utilizzato anche</td></tr><tr><td>microcentrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>una centrifuga per provette</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>da 50 mL<td>incubatrice-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C congelatore-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C congelatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &#956; L pipetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; L pipetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &#956; L pipetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; Puntali per pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L (10; 20; 200; 1.000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette</td><td></td><td></td><td></td>da 1,5 mL</tr><tr><td>Provette da 50 mL Provette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>da<td>15 mL</td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0,1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Provette di raccolta (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Tampone AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-libero dna analisi di integrità nei campioni di urina

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Anche se la presenza di circolante DNA libero-cellule nel plasma o nel siero è stato ampiamente dimostrato di essere una fonte adeguata di biomarcatori per molti tipi di cancro, alcuni studi si sono concentrati sul potenziale utilizzo del DNA dell&#39;urina cell-free (UCF). A partire dalle ipotesi che le normali cellule apoptotiche producono DNA molto frammentato e che le cellule tumorali rilasciare più il DNA, il ruolo potenziale di integrità del DNA UCF è stata valutata come un marker diagnostico precoce in grado di distinguere tra i pazienti con prostata o il cancro della vescica e individui sani. Un&#39;analisi integrità UCF DNA viene proposta sulla base di quattro PCR quantitativa in tempo reale su quattro sequenze più lunghe di 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, e AR. Sequenze che hanno spesso un aumento del numero di copie di DNA nei tumori della vescica e della prostata sono stati scelti per l&#39;analisi, ma il metodo è flessibile, e questi geni potrebbero essere sostituiti con altri geni di interiposo. Il potenziale utilità di UCF DNA come fonte di biomarcatori è già stata dimostrata per neoplasie urologiche, aprendo così la strada a ulteriori studi sulla caratterizzazione UCF DNA. Il test di integrità del DNA UCF ha il vantaggio di essere non invasiva, rapida e facile da eseguire, con pochi millilitri di urina necessari per effettuare l&#39;analisi.

La concentrazione totale di DNA libero era quantificabile mediante spettrometria per tutti i campioni analizzati, che mostra un intervallo compreso tra 1,51 e 138 ng / ml. Cinque campioni di controllo sono stati utilizzati per la riproducibilità dei dati: due esperimenti in tempo reale indipendenti sono stati eseguiti per c-myc, HER2, BCAS1, AR, e STOX1. I coefficienti di variazione (CV) sono stati poi calcolati per ciascun gene (Tabel...

Viene proposto un metodo per analizzare l'integrità del DNA nella frazione di surnatante privo di cellule dei campioni di urina. Il metodo è adatto per la diagnosi precoce delle neoplasie urologiche e si è dimostrato accurato per la diagnosi precoce del cancro della vescica.

Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

L'obiettivo generale di questo metodo è valutare l'integrità del DNA libero da cellule urinarie in specifiche sequenze oncogeniche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro urologico, come la diagnosi precoce non invasiva del cancro alla vescica e alla prostata. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da fare e da analizzare.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di neoplasie urologiche, perché normalmente rilasciano cellule e acidi nucleici liberi nelle urine. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui campioni urinari, può essere applicato anche ad altri sistemi come il siero o il plasma. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avrebbero difficoltà perché la concentrazione di DNA libero da cellule urinarie è spesso bassa.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di trovare un metodo semplice per la diagnosi precoce non invasiva del cancro alla vescica. Per iniziare la procedura, ottenere un campione di urina del primo mattino da 50 millilitri che è stato conservato a quattro gradi Celsius per non più di tre ore. Capovolgere il campione due volte e poi suddividere il campione in due provette da centrifuga coniche da 50 millilitri.Centrifugare il campione a 850 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, per ogni provetta trasferire 10 millilitri della parte superiore del surnatante in due provette da cinque millilitri, lasciando almeno due millilitri di surnatante sopra il pellet. Scartare i pellet e conservare il surnatante a meno 80 gradi Celsius.Ripetere questo processo per ulteriori campioni di urina, se necessario. Per iniziare la purificazione del DNA, per ogni campione scongelare un'aliquota di surnatante urinario. Agitare il campione scongelato e capovolgere il tubo due volte.Mettere un millilitro di campione in una provetta da cinque millilitri e conservare il resto a meno 80 gradi Celsius. Preparare un kit di purificazione del DNA adatto per campioni di urina secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 100 microlitri di proteinasi K e un millilitro di tampone di lisi al campione e mescolare bene con una pipetta.Incubare il campione a 56 gradi Celsius per 15 minuti. Durante l'incubazione, preparare i tamponi di lavaggio in una colonna di centrifuga. Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente, quindi aggiungere un millilitro di etanolo assoluto e mescolare bene pipettando.Trasferire 650 microlitri di campione nella colonna. Centrifugare a 6000 volte G per un minuto. Riposizionare la provetta di raccolta e ripetere questo processo fino a quando tutto il campione non è stato caricato sulla colonna.Quindi aggiungere 500 microlitri del primo tampone di lavaggio e centrifugare la colonna a 6000 volte G per un minuto. Sostituire la provetta di raccolta, aggiungere 500 microlitri del secondo tampone di lavaggio e centrifugare la colonna alla massima velocità per tre minuti. Posizionare la colonna in una provetta di raccolta pulita e centrifugare alla massima velocità per altri tre minuti per rimuovere il tampone di lavaggio residuo.Trasferire la colonna in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Caricare 50 microlitri di tampone di eluizione sulla colonna e lasciare che il tampone si impregni nella colonna per sette minuti. Quindi centrifugare la colonna a 6000 volte G per un minuto.Pipettare nuovamente l'eluato nella colonna e centrifugare la colonna alla massima velocità per un minuto per ottenere il DNA privo di cellule urinarie. Per iniziare a preparare gli standard, isolare prima il DNA da una linea cellulare appropriata utilizzando un kit di purificazione. Quantificare il DNA di ogni campione di urina purificata nella linea cellulare con uno spettrofotometro secondo le istruzioni del produttore del kit.Diluire il DNA UCF a un nanogrammo per microlitro e conservare i campioni diluiti a meno 20 gradi Celsius fino al momento del test di integrità. Diluire il DNA della linea cellulare per creare standard di sei, 100 microlitri di diverse concentrazioni. Conservare gli standard a meno 20 gradi Celsius.Per iniziare il test di integrità del DNA, scongelare i campioni di DNA UCF, gli standard, i primer PCR appropriati e il supermix verde su ghiaccio. Quindi impostare la piastra del disco rotore a 72 pozzetti con tubi a strisce. Posizionare due aliquote da 10 microlitri di standard e quindi ciascun campione nei pozzetti.Preparare due pozzetti di acqua priva di RNasi da 10 microlitri come controlli negativi. Per ogni pozzetto riempito, preparare una miscela di un microlitro di ciascun primer, 12,5 microlitri di supermix verde e 6,5 microlitri di acqua priva di RNasi. Trasferire 15 microlitri di miscela in ogni pozzetto riempito, quindi trasferire i pozzetti in un disco rotore da 72 pozzetti.Eseguire la PCR con uno strumento in tempo reale secondo le specifiche del produttore. Utilizzando il software dello strumento, verificare se alcune repliche hanno una differenza di valore di soglia ciclica di uno o più. Scartare quei campioni dall'analisi e valutare la soglia di ciclo mediana per i campioni rimanenti.Eseguire l'analisi di fusione su ciascun campione con un valore di soglia del ciclo mediano di 36 o inferiore per valutare la specificità del prodotto PCR. Quindi utilizzare la curva standard per determinare una concentrazione in nanogrammi per microlitro per ogni applicazione. Il DNA libero da cellule urinarie è stato isolato e l'integrità del DNA è stata valutata in quattro regioni che mostrano un aumento del numero di copie del DNA nei tumori solidi.È stata inoltre valutata una sequenza di controllo per verificare che la quantità di DNA in ciascun campione fosse sufficiente per il test di integrità. Per ciascun gene sono stati calcolati la concentrazione totale di DNA libero e i coefficienti di variazione. Questo metodo mostra una sensibilità del 73% e una specificità dell'84% per rilevare il cancro della vescica, ma solo una sensibilità del 58% e una specificità del 44% per il cancro alla prostata.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una giornata lavorativa se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR digitale o il sequenziamento di nuova generazione per rispondere a ulteriori domande come l'induttore del numero di copie dei geni di interesse. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare il DNA libero da cellule dall'urina in modo molto semplice e di come studiare l'integrità di specifiche regioni di interesse utilizzando approcci di PCR in tempo reale.

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Questo manoscritto descrive una tecnica per la rilevazione di mutazioni di bassa frequenza in ctDNA, ER-segg. Questo metodo si differenzia per il suo uso unico di correzione degli errori di bi-direzionale, un fondo speciale filtro ed efficiente acquisizione molecolare.

Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le alterazioni genetiche multiple di una regione di destinazione in una singola reazione usando drop-off ddPCR e un paio di idrolisi sonde uniche.

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Il kit di diagnostica FL-DNA è un metodo che consente di risparmiare tempo e di utilizzare per determinare la probabilità affidabile della presenza di lesioni del cancro colorettale.

Valutazione del rischio di cancro colorettale e della prevalenza da parte del rilevamento dell'integrità del DNA delle feci

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Descriviamo qui metodi per la quantificazione sensibile e accurata delle lesioni 8-oxo-7, 8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deossiadenosina (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2a '-deossiguanosina (1,N2-DGUO) nel DNA. I metodi sono stati applicati alla valutazione degli effetti del particolato fine ambientale (PM2,5) nei tessuti (polmone, fegato e rene) dei topi a/J esposti.

Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale

In questo articolo presentiamo un protocollo dettagliato per la tecnica della biopsia liquida non invasiva, tra cui la raccolta del sangue, la separazione del mantello plasmatico e buffy, l'estrazione del DNA cfDNA e germinale, la quantificazione del DNA cfDNA o germinale e l'analisi dell'arricchimento dei frammenti cfDNA.

Rilevamento di DNA privo di cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici

Un metodo non marcato, non radio-isotopico per analizzare l'attività della glicosilasi uracil-DNA, è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF per l'analisi diretta del prodotto contenente sito apurinico/aprimidinico. Il test si è rivelato abbastanza semplice, specifico, rapido e facile da usare per la misurazione della glicosilasi del DNA.

Saggio di glicosilasi uracil-DNA mediante desorbimento laser assistito da matrice/analisi spettrometria di massa a tempo di volo

Il saggio della cometa è un mezzo popolare per rilevare danni al DNA. Questo studio descrive un approccio per eseguire diapositive in varianti rappresentative del saggio della cometa. Questo approccio ha aumentato significativamente il numero di campioni diminuendo il tempo di esecuzione del test, il numero di manipolazioni dei vetrini e il rischio di danni ai gel.

Un approccio di analisi delle comete ad alto rendimento per la valutazione del danno al DNA cellulare

La biopsia liquida ha rivoluzionato il nostro approccio agli studi traslazionali oncologici, con la raccolta, la qualità e lo stoccaggio dei campioni come passaggi cruciali per la sua applicazione clinica di successo. Qui descriviamo un protocollo standardizzato e convalidato per applicazioni di DNA senza circolazione a valle che può essere applicato nella maggior parte dei laboratori di ricerca traslazionale.

Un protocollo preanalitico standardizzato per biopsia liquida per applicazioni di DNA libero da circolazione a valle

Questo protocollo descrive un test di biomarcatori urinari sintetici multianalita mediato da CRISPR-Cas che consente la diagnostica del cancro point-of-care attraverso l'analisi ex vivo delle attività della proteasi associata al tumore.

Test dei biomarcatori sintetici delle urine multianalitiche mediato da CRISPR-Cas per la diagnostica portatile

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di sequenziamento di nuova generazione automatizzato e accreditato ISO15189 per rilevare alterazioni genomiche mirabili in tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina per carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).

Rilevamento di alterazioni mirabili nel carcinoma polmonare non a piccole cellule utilizzando il sequenziamento di nuova generazione

Scopri l'analisi dell'integrità del DNA cell-free urinario per la diagnosi precoce non invasiva del cancro della vescica. Questo metodo semplice offre accuratezza nella rilevazione di malignità urologiche.

Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

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