Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare con precisione la vitalità cellulare in una coltura di neuroni di granuli cerebellari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze e della neurofarmacologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo distinguere le cellule gliali indesiderate dai neuroni nelle colture cellulari MISTA.

A dimostrare le procedure saranno Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin, tre studenti universitari del mio laboratorio. Inizia a sezionare le teste dei cuccioli di ratto di otto giorni inserendo prima le forbici nel forame magno e tagliando i due lati del cranio dalle orecchie agli occhi. Quindi, usa una pinza per sollevare il cranio.

Usa una pinza per isolare il cervelletto e mettilo in un piatto da 35 millimetri contenente una soluzione di dissezione. Trasferire la piastra sul tavolino del microscopio da dissezione e utilizzare due paia di pinze per rimuovere le meningi e i vasi sanguigni. Utilizzare una lama per tritare i tessuti, quindi trasferire il tessuto in una provetta da centrifuga contenente 30 millilitri di soluzione di dissezione.

Centrifugare per cinque minuti a temperatura ambiente a 1,500 x g. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e conservare il pellet. Successivamente, aggiungere la soluzione di tripsina al pellet e risospendere agitando delicatamente.

Quindi posizionare il tubo in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, aggiungere una soluzione di DNasi Uno, inibitore della tripsina di soia e solfato di magnesio e agitare. Quindi centrifugare per cinque minuti a temperatura ambiente a 1,500 x g.

Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet in una soluzione meno diluita di DNasi One, inibitore della tripsina di soia e solfato di magnesio. Quindi, prepara due tubi da 15 millilitri. Posizionare metà delle cellule in ciascuna provetta e pipettare sia su che giù da 60 a 70 volte utilizzando una pipetta Pasteur con tappo di cotone per omogeneizzare le cellule.

Dopo l'omogeneizzazione, aggiungere tre millilitri di solfato di magnesio e soluzione di cloruro di calcio a ciascuna provetta da 15 millilitri. Lasciare riposare i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti. Trascorso il tempo, rimuovere con cura il surnatante con una pipetta Pasteur con tappo di cotone e trasferirlo in nuove provette da 15 millilitri.

Centrifugare per cinque minuti a temperatura ambiente e 1.500 x g. Aggiungere il terreno di coltura al pellet per diluirlo a una densità cellulare di circa 1,5 x 10 per la sesta cellula per millilitro. Pipettare le cellule in una piastra a 6 pozzetti e la coltura nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo 24 ore, aggiungere la soluzione madre di AraC a una concentrazione finale di un millimolare per inibire la crescita delle cellule gliali prima di rimettere le piastre nell'incubatore. Quindi, il settimo giorno, aggiungere 50 microlitri alla soluzione madre di D-glucosio fino a una concentrazione finale di un millimolare. Iniziare la colorazione mescolando il diacetato di fluoresceina a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e lo ioduro di propidio a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro e 10 millilitri di PBS.

Mescolare la soluzione FDA/PI a vortice e metterla su ghiaccio. Metti la piastra di coltura sul ghiaccio. Aspirare con cura il terreno di coltura senza toccare le cellule con la punta della pipetta, quindi aggiungere lentamente il PBS freddo.

Aspirare il PBS, quindi aggiungere la soluzione di lavoro FDA/PI fredda o FDA/PI Hoechst. Metti il piatto sul ghiaccio per cinque minuti. Successivamente, dopo aver aspirato la soluzione di lavoro FDA/PI o FDA/PI/Hoechst, aggiungere PBS freddo a ciascun pozzetto.

Assicurarsi che il microscopio a fluorescenza sia impostato correttamente. Rileva le emissioni fluorescenti per FDA, PI e Hoechst rispettivamente a 520, 620 e 460 nanometri, utilizzando un tempo di esposizione compreso tra 100 e 300 millisecondi e un guadagno analogico di 2,8 x. Dopo aver raccolto le immagini a fluorescenza, scattare un'immagine in condizioni di luce normale utilizzando la modalità di contrasto di fase.

Per la doppia colorazione FDA/PI, sovrapporre le immagini delle cellule trascinando lo strato positivo FDA sopra lo strato positivo PI nel software di editing grafico. Regolate l'opacità del livello positivo FDA inserendo 50% nel campo Opacità del pannello Livelli. Unisci due livelli aprendo il menu Livello e facendo clic sul pulsante Unisci visibile.

Impostare il contrasto delle immagini sovrapposte inserendo 50 nel campo Contrasto in Immagine, Regolazioni, Luminosità/Contrasto. Verificare che non siano presenti celle doppie positive FDA e PI nelle immagini in sovrimpressione. Per la tripla colorazione FDA/PI/Hoechst, sovrapporre le immagini delle cellule trascinando nuovamente lo strato positivo FDA sullo strato positivo PI, regolando l'opacità dello strato positivo FDA e unendo le immagini come prima.

Quindi trascinare il livello positivo Hoechst sul livello unito. Regola l'opacità del livello positivo di Hoechst inserendo 50% nel campo Opacità del pannello Livelli, e unisci i due livelli aprendo il menu Livello e facendo clic sul pulsante Unisci visibile. Distinguere visivamente le cellule gliali grandi e irregolari dai neuroni granulari cerebellari confrontando le immagini scattate in modalità fluorescente con quelle scattate in modalità contrasto di fase.

Le immagini seguenti mostrano che nella coltura CGN sono presenti sia piccoli neuroni che grandi cellule gliali irregolari. Questa immagine mostra la colorazione amminica GAP-43 di una coltura CGN a otto giorni in vitro. Le frecce blu indicano i neuroni.

Qui viene mostrata la colorazione amminica GFAP delle cellule gliali. La freccia bianca indica una cellula gliale. Questa immagine a contrasto di fase mostra la morfologia delle cellule.

La colorazione con uncino FDA/PI, in grado di distinguere le cellule gliali dai neuroni, è vantaggiosa per la valutazione accurata della vitalità neuronale in coltura CGN. Questa è un'immagine unita di cellule tripla colorate cresciute in un normale mezzo di crescita. La freccia mostra una tipica cellula gliale.

Qui, una coltura simile è stata trattata con un terreno contenente basso potassio e la freccia indica ancora una volta una tipica cellula gliale. Inoltre, si noti l'aspetto della colorazione con ioduro di propidio rosso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.

Una strategia simile può essere applicata ad altre colture cellulari miste, come le colture corticali primarie e le colture ippocampali primarie per analizzare accuratamente la vitalità neuronale.