JoVE Science Education

Organic Chemistry

Separazione di miscele tramite precipitazione

Separation of Mixtures via Precipitation

JoVE Science Education
Organic Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Organic Chemistry

Separation of Mixtures via Precipitation

2.1: Introduction to Catalysis

2.13: Performing 1D Thin Layer Chromatography

157,248 Views

•

08:02 min

•

April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratorio della Dott.à 0.0. Ana J. García-Sáez — Università di Tubinga

La maggior parte dei campioni di interesse sono miscele di molti componenti diversi. La preparazione del campione, una fase chiave del processo analitico, rimuove le interferenze che possono influire sull’analisi. Pertanto, lo sviluppo di tecniche di separazione è uno sforzo importante non solo nel mondo accademico, ma anche nell’industria.

Un modo per separare le miscele è utilizzare le loro proprietà di solubilità. In questo breve documento, ci occuperemo di soluzioni acquose. La solubilità di un composto di interesse dipende da (1) forza ionica della soluzione, (2) pH e (3) temperatura. Manipolando con questi tre fattori, una condizione in cui il composto è insolubile può essere utilizzata per rimuovere il composto di interesse dal resto del campione. ¹

Principles

Un certo numero di parametri può essere utilizzato per separare un campione di interesse dalle impurità riducendone la solubilità e rimuovendolo da una soluzione come solido, come mostrato nella Figura 1. In primo luogo, la modifica della forza ionica della soluzione può modificare la solubilità di una sostanza. Ciò comporta spesso l’aggiunta di sale extra (chiamato anche salatura), o l’aggiunta di un controione, che forma una specie meno solubile con il composto di interesse. ²

Figura 1. Gli equilibri di solubilità sono influenzati dalla forza ionica, dal pH e dalla temperatura. Un composto di interesse (giallo) viene separato dalle impurità (rosso) modificando la sua solubilità in un dato solvente.

La modifica del pH di una soluzione può modificare la carica netta del composto. Ad un certo pH, la carica netta diventa zero (chiamata anche punto isoelettrico) e il composto diventa meno solubile in acqua, formando infine un solido. La temperatura influisce anche sulla solubilità, poiché una temperatura più elevata aumenta la solubilità dei solidi.

Il tasso di formazione dei solidi determina la purezza relativa (Figura 2). In generale, il termine precipitazione si riferisce alla formazione di un solido ad un ritmo rapido, producendo così un campione amorfo con alcune impurità intrappolate all’interno. Questo è comune nei processi di salatura e di modifica del pH. Quando questo processo viene rallentato, le impurità non vengono intrappolate all’interno del composto e viene prodotto un solido relativamente puro. Questa tecnica è impiegata nella ricristallizzazione. In questo processo, un composto viene disciolto in un solvente sufficiente per essere solo nel punto di saturazione a una temperatura elevata. Questa soluzione satura viene quindi lasciata raffreddare lentamente. Man mano che la soluzione si raffredda, la solubilità del componente diminuisce e il composto in eccesso rispetto alla solubilità forma un solido ben ordinato (altrimenti noto come cristalli) invece di un solido amorfo. Le impurità nella soluzione non rimangono intrappolate poiché il processo lento consente la rimozione di queste impurità sulla superficie del solido prima che vengano intrappolate. ¹

Figura 2. Differenza tra precipitazioni e ricristallizzazione.

Una volta che il solido si è formato (sia come cristallo che come precipitato), dovrebbe essere separato dal resto della miscela. La filtrazione è un modo per separarli. Questo impiega un materiale poroso che inibisce selettivamente il passaggio del materiale solido ma non della soluzione.

La centrifugazione è un altro modo per separare il precipitato dal resto della miscela. La centrifugazione utilizza l’accelerazione centripeta per separare le miscele in base alle loro densità. Poiché il solido è più denso della soluzione acquosa, i sedimenti solidi sul fondo del contenitore. Il solido è anche chiamato il pellet e la soluzione acquosa, il surnatante. Il surnatante può quindi essere travasato o estratto utilizzando un pipetto o una siringa. I cristalli sono fragili e la centrifugazione spesso non viene utilizzata per separarli dalla soluzione.

Questo video coprirà diversi metodi di separazione dei composti attraverso la formazione di solidi (salatura, variazioni di pH e ricristallizzazione) e la loro successiva rimozione dalla soluzione acquosa attraverso la filtrazione o la centrifugazione.

Procedure

1. Precipitazione di CaCO₃

Preparare 5 ml di 1 M CaCl₂.
Preparare 5 mL 1 M Na₂CO₃.
In un piccolo tubo centrifugo (1,5 mL), aggiungere 750 μL di CaCl₂ e 750 μL di Na₂CO₃.
Attendere 2 minuti affinché si verifichi la reazione. La soluzione dovrebbe diventare torbia.
Centrifugare la miscela a 10.000 × g per 5 min.
Decantare il surnatante.
Aggiungere 1 mL di acqua fredda al pellet.
Risuspendare il pellet mescolando in un miscelatore a vortice per 10 s.
Centrifugare la miscela a 10.000 × g per 5 min.
Decantare il surnatante.

2. Precipitazione delle proteine del latte

Versare il latte in un becher e aggiungere una barra di agitazione.
Scaldare delicatamente il latte fino a 40 °C in una piastra calda mescolando. Non riscaldare oltre i 40 °C.
Preparare un 15% (v/v) di acido acetico mescolando 7,5 ml di acido acetico e diluendo in acqua sufficiente per raggiungere i 50 ml.
Immergere l’elettrodo di un pHmetro nel latte caldo e monitorare il pH.
Aggiungere l’acido acetico goccia al latte fino a raggiungere un pH di 4,6.
Filtrazione del latte
1. Scanalare un pezzo di carta da filtro e metterlo in un imbuto.
2. Posizionare l’imbuto in un pallone e versare la soluzione di latte acidificata nell’imbuto.
3. Quando la soluzione viene versata, la carta da filtro potrebbe intasarsi. Usando un’asta di agitazione, agitare la soluzione e la carta da filtro di tanto in tanto per sbloccare. Se non migliora il passaggio della soluzione, cambiare la carta da filtro.
4. Posizionare una nuova carta da filtro sul piano di lavoro e trasferire la maggior parte del solido bagnato nella nuova carta da filtro. Questo dovrebbe assorbire più acqua dal solido.
5. Se la nuova carta da filtro si bagna troppo, continuare a cambiarla fino a quando non c’è una quantità minima di umidità sulla carta da filtro. Premerlo leggermente per assorbire più acqua, se necessario.
6. Prendere il solido essiccato e ri-sospendere in circa il 70% di etanolo. Filtrare nuovamente il solido seguendo i passaggi da 2.6.1 a 2.6.5.
Centrifugazione del latte (in alternativa alla filtrazione)
1. Trasferire porzioni da 50 mL della miscela in tubi centrifughi da 50 mL.
2. Centrifugare a 4.500 × g per 10 min, quindi decantare il surnatante.
3. Aggiungere 50 ml di etanolo al 70% al pellet.
4. Utilizzando un’asta di agitazione, risusediare il pellet nell’etanolo.
5. Centrifugare questa sospensione seguendo il punto 2.7.2.
Risuspenare il pellet in tampone per ulteriori analisi come SDS-PAGE, altrimenti conservarlo a 4°C.

3. Ricristallizzazione di KCl

Pesare 50 g di KCl in un matraccio Erlenmeyer e aggiungere 100 ml di acqua
Riscaldare la miscela fino a quando l’acqua bolle. Assicurarsi che tutta la polvere di KCl sia sciolta. Alcune impurità potrebbero non dissolversi in acqua.
Scaldare un altro matraccio Erlenmeyer (vuoto) insieme al composto e tenerlo molto caldo.
Mettere un imbuto con carta da filtro nel pallone caldo e vuoto.
Versare la soluzione attraverso la carta da filtro per rimuovere le impurità non disciolte. Il pallone ricevente viene mantenuto caldo per assicurarsi che non si verifichino variazioni di temperatura durante la filtrazione, altrimenti si formerà un precipitato grezzo. Se ciò accade, riscaldare nuovamente la miscela fino a quando tutto il precipitato si dissolve.
Togliere il matraccio con la soluzione dal fuoco.
Tenerlo in un luogo fresco nella stanza e lasciarlo raffreddare lentamente per circa 30 minuti, o fino a quando non è più caldo al tatto.
Una volta raffreddato a temperatura ambiente, mettere il pallone in un bagno di ghiaccio per abbassare ulteriormente la temperatura. In alternativa, si può lasciare il pallone all’interno del frigorifero o in un locale a temperatura controllata a 4 °C.
I cristalli possono essere raccolti filtrando come nei passaggi 3.4-3.5 (utilizzare un pallone e un imbuto a temperatura ambiente).

La precipitazione è una tecnica utilizzata per separare una miscela in base alla solubilità dei suoi componenti. La solubilità di un composto dipende dalla forza ionica della soluzione, dal suo pH e dalla temperatura. La manipolazione di questi fattori può far sì che un composto diventi un solido insolubile e cada fuori soluzione. Questo è chiamato precipitazione.

Il solido insolubile, chiamatoprecipitato, forma inizialmente una sospensione, il che significa che è ben disperso in soluzione. Il precipitato tipicamente si agglomera e quindi viene separato dal liquido mediante sedimentazione, centrifugazione o filtrazione. Questo video introdurrà diversi metodi di separazione dei composti utilizzando la precipitazione e dimostrerà una procedura in laboratorio.

Un composto disciolto può essere precipitato fuori dalla soluzione introducendo un controione. Ad esempio, l’argento può essere precipitato fuori soluzione nella reazione tra nitrato d’argento e cloruro di sodio. Lo ione nitrato viene sostituito da un controione, il cloruro, con conseguente formazione di cloruro d’argento solido.

Aumentare la concentrazione salina di una soluzione può anche indurre precipitazioni. Questa tecnica, chiamata salatura, è comune per l’isolamento delle proteine. Ad alta concentrazione di sale, le molecole d’acqua sono più attratte dal sale disciolto, lasciando meno per stabilizzare la proteina. Di conseguenza, le molecole proteiche si aggregano e formano un solido.

Le precipitazioni possono anche essere causate da un cambiamento di pH. A pH alto e basso, la proteina viene caricata e attratta dalla soluzione polare. Ad un certo punto, la carica netta di un composto diventa zero. Questo è il punto isoelettrico, o pI. Il composto non è in grado di interagire con la soluzione polare, facendola aggregare e precipitare.

La temperatura influisce anche sulla solubilità, poiché una temperatura più elevata aumenta la solubilità dei solidi. Diminuendo la temperatura, i composti disciolti possono ri-solidificarsi. Il tasso di formazione solida determina la purezza relativa.

I seguenti esperimenti dimostreranno la precipitazione della proteina caseina dal latte utilizzando il pH e un’ulteriore separazione tramite metodi di filtrazione e centrifugazione.

Per iniziare questa procedura, aggiungere 250 ml di latte in un becher con una barra di agitazione. Scaldare delicatamente il latte a 40 °C su una piastra riscaldante. Immergere un pHmetro nel latte caldo e monitorare il pH. Aggiungere acido acetico goccia al latte fino a quando il pH raggiunge il punto isoelettrico della caseina, 4.6. Le proteine insolubili del latte, o cagliata, precipitano fuori soluzione nel punto isoelettrico. Rimuovere la cagliata dalla soluzione mediante filtrazione. Se la carta da filtro si intasa, mescolare con una spatola per aiutare la soluzione a fluire attraverso. Se questo non migliora la filtrazione, cambiare la carta da filtro. Trasferire il solido bagnato dalla carta da filtro intasata alla nuova carta da filtro. Questo dovrebbe assorbire più liquido, o siero di latte, dal solido. Continuare a cambiare la carta da filtro fino a quando non c’è un’umidità minima. Premendo leggermente sui solidi può aiutare la carta da filtro ad assorbire più siero di latte.

Sospendere di ripiendete i solidi del latte essiccati in etanolo al 70% per lavare i fosfolipidi dalla cagliata e quindi ripetere il processo di filtrazione. In alternativa alla filtrazione, i solidi proteici possono anche essere separati mediante centrifugazione. Centrifugare 50 ml di porzioni della miscela di latte e decantare il surnatante. Sospendere di 50 ml il pellet in 50 ml di etanolo al 70% per aiutare a rimuovere i fosfolipidi dalla cagliata e ripetere il processo di centrifugazione.

I solidi proteici del latte possono quindi essere conservati o ri-sospesi in un’altra soluzione per ulteriori analisi, come SDS-PAGE. Per ulteriori informazioni, guarda il nostro video su questa tecnica. L’analisi SDS-PAGE mostra che le precipitazioni hanno permesso la rimozione della maggior parte delle impurità dal siero di latte. Tutta la caseina è stata trovata nel pellet, mentre nessuna è stata trovata nel surnatante.

La precipitazione è una tecnica comunemente usata, che può essere applicata per separare una varietà di miscele o soluzioni.

I composti possono essere precipitati da una soluzione usando un controione, come in questo esempio della precipitazione del carbonato di calcio.

Il cloruro di calcio e il carbonato di sodio sono entrambi solubili nella fase acquosa.

Quando vengono miscelati, il calcio e il carbonato formano un solido insolubile, che può essere separato con la centrifugazione. Per ulteriori informazioni su questo argomento, guarda il nostro video informativo sulle regole di solubilità.

La precipitazione può essere utilizzata nella preparazione di solidi su scala nanometrica che si trovano in una vasta gamma di applicazioni nella nanotecnologia. In questo esempio, i semi su scala nanometrica sono stati utilizzati per controllare la crescita dei nanocristalli.

I precursori sono stati riscaldati, hanno reagito con trittilfosfina seleniuro e quindi si sono rapidamente raffreddati. Il metanolo è stato aggiunto alla soluzione raffreddata, al fine di precipitare i solidi. I cristalli sono stati poi recuperati mediante centrifugazione e la struttura cristallina analizzata con diffrazione a raggi X.

La precipitazione può anche essere utilizzata nella preparazione di ligandi polimerici per applicazioni di somministrazione di farmaci. In questo esempio, un ligando viene sintetizzato e coniugato al platino per l’uso come terapia antitumorale. In primo luogo, il ligando è stato sintetizzato utilizzando una reazione di accoppiamento ammide. È precipitato man mano che la reazione progrediva. È stato poi recuperato utilizzando la filtrazione.

Il solido è stato quindi purificato utilizzando la ricristallizzazione e filtrato di nuovo. Il ligando è stato quindi complessato con il composto di platino, essiccato e quindi purificato utilizzando la precipitazione frazionata dall’acqua con acetone. L’accoppiamento del platino è stato confermato utilizzando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. I composti potrebbero quindi essere studiati per la loro efficacia e gli effetti collaterali come agenti antitumorali.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla separazione delle miscele usando le precipitazioni. Ora dovresti capire i vari metodi di precipitazione e come eseguire questi esperimenti in laboratorio.

Grazie per l’attenzione!

Results

Gli equilibri di solubilità sono impiegati in molti processi di purificazione. Il calcio può essere rimosso dall’acqua usando carbonato di sodio. Il prodotto di solubilità (K_sp) di CaCO₃ è 4,8 × 10^-9. Miscelando 1 M di CaCl₂ e 1 M di Na₂CO₃ ha prodotto un precipitato CaCO_3. Il precipitato è stato separato dal resto della soluzione utilizzando la centrifugazione.

La caseina (una proteina chiave nel latte) ha un punto isoelettrico a pH 4,6 e forma cagliata insolubile a questo pH. La cagliata è stata quindi separata dal resto della soluzione (chiamata anche siero di latte) utilizzando la filtrazione o la centrifugazione (Figura 3a). La cagliata è stata lavata con etanolo per rimuovere fosfolipidi e altri composti solubili in acqua che erano anche intrappolati nella cagliata. La centrifugazione ha impedito la perdita di proteine meglio della filtrazione in quanto c’erano alcune proteine che si attaccavano alla carta da filtro. I componenti separati sono stati analizzati utilizzando SDS-PAGE (Figura 3b), mostrando che la reazione di precipitazione ha separato la maggior parte della caseina dal siero di latte. Altre proteine del latte, come le globuline, precipitano insieme alla caseina. Ulteriori misure possono essere applicate per isolare la caseina dal resto delle proteine.

La precipitazione rimuove la maggior parte delle impurità dal solido, tuttavia può anche intrappolare alcune impurità all’interno della matrice. La ricristallizzazione è spesso impiegata per purificare ulteriormente un solido (Figura 4). In questo esperimento, il solido è stato miscelato con un solvente in cui il solido non era molto solubile. La temperatura della miscela è stata quindi elevata al punto di ebollizione del solvente e viene aggiunto abbastanza solido per saturare il solvente caldo. Altre impurità insolubili potrebbero quindi essere rimosse tramite una fase di filtrazione. La soluzione calda è stata quindi gradualmente raffreddata a temperatura ambiente e ulteriormente raffreddata in frigorifero/cella frigorifera/bagno di ghiaccio. Il lento processo ha portato a cristalli invece di precipitato amorfo. Le impurità solubili non erano incorporate nel reticolo cristallino e i cristalli risultanti erano relativamente più puri del precipitato grezzo. I cristalli sono stati poi raccolti mediante filtrazione e lasciati asciugare all’aria (o sottovuoto).

Figura 3. Precipitazione delle proteine del latte. (A) Immagini delle diverse fasi dell’isolamento delle proteine del latte. (B) SDS-PAGE dei diversi campioni.

Figura 4. Ricristallizzazione di KCl.

Applications and Summary

Le reazioni di precipitazione vengono applicate a molti processi di preparazione dei campioni. Come accennato in precedenza, possono essere utilizzati per rimuovere sali o ioni specifici a seconda dei loro equilibri di solubilità. Possono anche essere usati per rimuovere proteine e altre biomolecole dalle miscele.

La ricristallizzazione viene spesso utilizzata per purificare ulteriormente i solidi. Questo processo rimuove le impurità intrappolate all’interno del solido. Tra gli altri, la ricristallizzazione può essere utilizzata per purificare sali e molecole organiche.

Le tecniche di centrifugazione e filtrazione sono applicabili alla maggior parte delle richieste di preparazione dei campioni per separare i componenti insolubili dal solvente. La filtrazione è spesso utilizzata in chimica organica per separare i composti cristallizzati puri dal suo solvente. Viene anche utilizzato dopo estrazioni solido-liquido nella chimica dei prodotti naturali o nella chimica analitica. La centrifugazione viene spesso utilizzata per separare miscele di diverse densità e, come mostrato qui, applicata alla separazione dei componenti del latte e del sale precipitato.

In biochimica, la maggior parte dei processi come l’isolamento di proteine, lipidi e DNA comporta reazioni di precipitazione, centrifugazione e metodi di filtrazione per purificare i campioni. E mentre la maggior parte di questi processi sono stati completamente standardizzati in kit commerciali, c’è ancora molto spazio per l’ottimizzazione, poiché diverse molecole biologiche richiedono condizioni diverse.

References

Kotz, J., Treichel, P., Townsend, J. Chemistry and Chemical Reactivity. 8^th ed. Brooks/Cole, Belmont, CA (2012).
Arakawa, T., Timasheff, S.N. Mechanism of Protein Salting In and Salting Out by Divalent Cation Salts: Balance between Hydration and Salt Binding. Biochemistry. 23, 5912-5923 (1984).

Transcript

Precipitation is a technique used to separate a mixture based on the solubility of its components. The solubility of a compound depends on the ionic strength of the solution, its pH, and temperature. Manipulation of these factors can cause a compound to become an insoluble solid, and fall out of solution. This is called precipitation.

The insoluble solid, called the precipitate, initially forms a suspension, meaning that it is well dispersed in solution. The precipitate typically agglomerates, and then is separated from the liquid by sedimentation, centrifugation, or filtration. This video will introduce several methods of separating compounds using precipitation, and demonstrate a procedure in the laboratory.

A dissolved compound can be precipitated out of solution by introducing a counter ion. For example, silver can be precipitated out of solution in the reaction between silver nitrate and sodium chloride. The nitrate ion is replaced by a counter-ion, chloride, resulting in the formation of solid silver chloride.

Increasing the salt concentration of a solution can also induce precipitation. This technique, called salting-out, is common for the isolation of proteins. At high salt concentration, water molecules are more attracted to the dissolved salt, leaving fewer to stabilize the protein. As a result, the protein molecules aggregate and form a solid.

Precipitation can also be caused by a change in pH. At high and low pH, the protein is charged and attracted to the polar solution. At a certain point, the net charge of a compound becomes zero. This is the isoelectric point, or pI. The compound is unable to interact with the polar solution, causing it to aggregate and precipitate.

Temperature also affects solubility, as higher temperature increases the solubility of solids. By decreasing temperature, dissolved compounds can re-solidify. The rate of solid formation determines relative purity.

The following experiments will demonstrate the precipitation of the protein casein from milk using pH, and further separation via filtration and centrifugation methods.

To begin this procedure, add 250 mL of milk into a beaker with a stir bar. Gently warm the milk to 40 °C on a stirring hot plate. Immerse a pH meter into the warm milk, and monitor the pH. Add acetic acid drop-wise to the milk until the pH reaches the casein isoelectric point, 4.6. Insoluble milk proteins, or curds, precipitate out of solution at the isoelectric point. Remove the curds from solution by filtration. If the filter paper gets clogged, mix with a spatula to help the solution flow through. If this does not improve the filtration, change the filter paper. Transfer the wet solid from the clogged filter paper to new filter paper. This should absorb more liquid, or whey, from the solid. Continue changing the filter paper until there is minimal wetness. Pressing lightly on the solids may help the filter paper to absorb more whey.

Re-suspend the dried milk solids in 70% ethanol to wash the phospholipids out of the curds and then repeat the filtration process. As an alternative to filtration, protein solids can also be separated using centrifugation. Centrifuge 50 mL portions of the milk mixture and decant the supernatant. Re-suspend the pellet in 50 mL of 70% ethanol to help remove the phospholipids from the curds, and repeat the centrifugation process.

The milk protein solids can then be stored or re-suspended in another solution for further analysis, such as SDS-PAGE. For more information, see our video on this technique. SDS-PAGE analysis shows that precipitation enabled the removal of most impurities from the whey. All of the casein was found in the pellet, while none was found in the supernatant.

Precipitation is a commonly used technique, which can be applied to separate a variety of mixtures or solutions.

Compounds can be precipitated from a solution using a counter ion, as in this example of the precipitation of calcium carbonate.

Calcium chloride and sodium carbonate are both soluble in the aqueous phase.

When they are mixed, the calcium and carbonate form an insoluble solid, which can be separated with centrifugation. For more information on this topic, see our education video on solubility rules.

Precipitation can be utilized in the preparation of nano-scale solids that are found in a wide range of applications in nanotechnology. In this example, nano-scale seeds were used to control the growth of nano-crystals.

The precursors were heated, reacted with trioctylphosphine selenide, and then rapidly cooled. Methanol was added to the cooled solution, in order to precipitate the solids. The crystals were then recovered by centrifugation, and the crystal structure analyzed with X-ray Diffraction.

Precipitation can also be used in the preparation of polymeric ligands for drug delivery applications. In this example, a ligand is synthesized and conjugated to platinum for use as an anticancer therapy. First, the ligand was synthesized using an amide coupling reaction. It precipitated as the reaction progressed. It was then recovered using filtration.

The solid was then purified using recrystallization, and filtered again. The ligand was then complexed with the platinum compound, dried, and then purified using fractional precipitation from water with acetone. Platinum coupling was confirmed using nuclear magnetic resonance spectroscopy. The compounds could then be studied for their efficacy and side effects as anticancer agents.

You have just watched JoVE’s introduction to the separation of mixtures using precipitation. You should now understand the various methods of precipitation, and how to perform these experiments in the laboratory.

Thanks for watching!

Tags

Valore vuoto Problema