Protocollo di controllo dell'orologio per l'analisi delle immagini: plugin ImageJ

L'obiettivo generale di questi protocolli di scansione dell'orologio è quello di consentire la rapida caratterizzazione dell'intensità media dei pixel all'interno, lungo il bordo e/o all'esterno delle regioni selezionate di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave e insegnare agli analisti di immagini l'intensità media dei pixel all'interno di specifiche regioni di interesse. I principali vantaggi della tecnica di scansione dell'orologio qui sono che può essere utilizzata per caratterizzare rapidamente l'intensità media dei pixel dall'orbita in una o più regioni di interesse.

Per l'analisi standard della scansione dell'orologio, nel menu File, nel programma ImageJ appropriato, selezionare Apri per aprire un file di immagine di interesse. Ad esempio, qui, verrà analizzata una sezione di tessuto con neuroni marcati per una proteina di interesse. Selezionate uno strumento di disegno appropriato e delineate l'area di interesse.

Seleziona Plug-in e scansione orologio dal menu File per aprire il protocollo di scansione dell'orologio standard, finestra delle opzioni popup. Si aprirà anche la finestra del gestore della regione di interesse, con la struttura aggiunta automaticamente. Nella finestra delle opzioni Plugin, utilizzare le barre di scorrimento per modificare le coordinate x e y al centro della regione di interesse, a seconda dei casi.

A seconda della parte della regione di sfondo al di fuori dell'oggetto che deve essere coperta dalla scansione, utilizzare la barra di scorrimento del limite di scansione per regolare i limiti di scansione. Selezionare le caselle di controllo del raggio reale, sottrarre lo sfondo, trasformare polare e/o tracciare con la deviazione standard in base alle esigenze sperimentali. Quindi, fai clic su OK per eseguire il plug-in.

Una volta completata l'analisi, utilizzare il comando list per accedere ai dati numerici per ulteriori analisi. Per l'analisi della scansione dell'orologio di più regioni, aprire un file immagine contenente più regioni di interesse. Ad esempio, qui, verrà analizzato un pannello di fotogrammi catturati all'interno della stessa sezione di tessuto, come appena dimostrato.

Fare clic su Analizza, quindi su Strumenti, quindi su Gestione regione di interesse e utilizzare lo strumento di disegno appropriato per delineare ciascuna regione di interesse. Lo strumento linea segmentata è utile per selezionare le regioni asimmetriche di interesse e per escludere l'etichettatura di sfondo. Fare clic su Aggiungi nella finestra Gestione regione di interesse per aggiungere ogni regione di interesse al gestore man mano che viene selezionata.

nel menu Plugin, selezionare Scansione multi-orologio per aprire la finestra popup delle opzioni del protocollo e reimpostare il limite di scansione, se necessario. Controllare il grafico con la deviazione standard e/o sottrarre le caselle di sfondo, a seconda delle esigenze sperimentali. Quindi, fare clic su OK per eseguire il protocollo, che genererà due finestre di tracciato di output.

Per l'analisi della scansione dell'orologio di una pila di immagini, aprire una pila di immagini di interesse. Qui, verrà analizzata una pila di immagini di un ganglio della radice dorsale isolato, marcato con una fluorescenza sensibile al calcio che è stata ripresa prima e dopo la stimolazione intracellulare dell'elettrodo. Delinea l'area di interesse all'interno della pila di immagini.

Aggiungere la pila di immagini selezionata al gestore della regione di interesse, come appena dimostrato, e selezionare Scansione multi-orologio per aprire la finestra popup delle opzioni del protocollo. Reimpostare il limite di scansione se necessario e controllare il grafico con la deviazione standard e/o sottrarre le caselle di sfondo, come sperimentalmente appropriato. Quindi, fare clic su OK per eseguire il protocollo, generando due finestre di tracciato di output.

In questa analisi rappresentativa di una sezione di tessuto di neuroni marcati in fluorescenza, è stata disegnata una regione di interesse attraverso il segnale luminoso per la proteina di interesse ed è stata eseguita un'analisi standard di scansione dell'orologio per raccogliere scansioni di intensità di pixel radiali dal centro della regione di interesse al limite di scansione delineato. Le scansioni radiali sono state normalizzate al raggio della regione di interesse nella direzione della scansione. Una media, per produrre un profilo integrale di intensità dei pixel radio, rivela che la maggior parte della proteina di interesse è stata misurata sulla membrana plasmatica della cellula.

Poiché per questa analisi è stato selezionato il grafico con deviazione standard, le linee verticali di deviazione standard indicavano l'intensità dei pixel dei singoli profili di scansione radiale a una data distanza dall'origine della scansione. In questa analisi, sono state scansionate più regioni di interesse all'interno del campione di tessuto neuronale, come appena dimostrato, generando un profilo di intensità dei pixel integrale per ogni oggetto scansionato nella sequenza in cui sono stati aggiunti al gestore della regione di interesse. Inoltre, un profilo di intensità media dei pixel per ogni regione di interesse selezionata.

Queste barre di deviazione standard, quindi, rappresentano la variabilità tra le scansioni integrali di singoli oggetti, piuttosto che le singole scansioni radiali. Qui, è stata eseguita un'analisi della pila di immagini di un neurone gangliare della radice dorsale isolato catturato in momenti diversi, prima e dopo la stimolazione, tramite elettrodo intracellulare. Al termine dell'analisi, sono stati visualizzati un profilo di intensità dei pixel integrale delle singole istanze dell'oggetto di interesse su diverse immagini all'interno dello stack e un profilo di intensità dei pixel medi per tutte le istanze dell'oggetto.

Inoltre, l'analisi della deviazione standard di una pila di immagini scansionate con orologio dimostra la variabilità dei dati tra le scansioni integrali in tutta la pila di immagini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'intensità dei pixel utilizzando i plug-in di scansione dell'orologio. Il nostro scopo nello sviluppo di questi plugin era quello di rendere questi tipi di analisi delle immagini disponibili gratuitamente per ogni ricercatore.

Riteniamo che il protocollo di scansione dell'orologio verrà utilizzato per le numerose aree di ricerca, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'applicazione di imaging biologico, chimico e fisico. Mentre continuiamo a sviluppare e utilizzare questi plug-in per la scansione dell'orologio, apprezzeremo qualsiasi feedback e suggerimento da parte delle parti interessate su come migliorare questi strumenti.