Protocollo di controllo dell'orologio per l'analisi delle immagini: plugin ImageJ

L'obiettivo generale di questi protocolli di scansione circolare è consentire la rapida caratterizzazione dell'intensità media dei pixel all'interno, lungo il bordo e/o all'esterno di regioni di interesse selezionate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali e a formare analisti di immagini sull'intensità media dei pixel all'interno di specifiche regioni di interesse. I principali vantaggi della tecnica di scansione circolare consistono nella possibilità di utilizzarla per caratterizzare rapidamente l'intensità media dei pixel in orbita, in una o più regioni di interesse.

Per l'analisi standard della scansione dell'orologio, nel menu File, nel programma ImageJ appropriato, selezionare Apri per aprire un file di immagine di interesse. Ad esempio, qui verrà analizzata una sezione di tessuto con neuroni marcata per una proteina di interesse. Selezionare uno strumento di disegno appropriato e delimitare la regione di interesse.

Selezionare Plugin e Clock Scan dal menu File per aprire la finestra delle opzioni popup del protocollo standard di scansione oraria. Si aprirà anche la finestra del gestore dell'area di interesse, con il contorno aggiunto automaticamente. Nella finestra delle opzioni del plugin, utilizzare le barre di scorrimento per modificare le coordinate x e y al centro dell'area di interesse, secondo necessità.

A seconda della quantità di area di fondo al di fuori dell'oggetto che deve essere coperta dalla scansione, utilizzare la barra di scorrimento del limite di scansione per regolare i limiti. Selezionare le caselle di controllo del raggio reale, sottrazione dello sfondo, trasformata polare e/o grafico con deviazione standard in base alle esigenze sperimentali. Quindi, fare clic su OK per eseguire il plugin.

Al termine dell'analisi, utilizzare il comando list per accedere ai dati numerici da sottoporre ad ulteriore analisi. Per l'analisi di scansione dell'orologio di più regioni, aprire un file di immagine contenente più regioni di interesse. Ad esempio, qui verrà analizzato un pannello di fotogrammi acquisiti all'interno della stessa sezione di tessuto, come appena dimostrato.

Fare clic su Analizza, quindi su Strumenti, quindi su Gestione area di interesse e utilizzare lo strumento di disegno appropriato per delimitare ciascuna area di interesse. Lo strumento di linea segmentata è utile per selezionare aree di interesse asimmetriche e per escludere l'etichettatura di fondo. Fare clic su Aggiungi nella finestra del Gestore aree di interesse per aggiungere ciascuna area di interesse al gestore non appena viene selezionata.

Nel menu Plugin, selezionare Multi Clock Scan per aprire la finestra popup delle opzioni del protocollo e reimpostare il limite di scansione, se necessario. Verificare il grafico con la deviazione standard e/o sottrarre le caselle dello sfondo, a seconda delle esigenze sperimentali. Quindi, fare clic su OK per eseguire il protocollo, che genererà due finestre di output per i grafici.

Per l'analisi di scansione temporale di una serie di immagini, aprire una serie di immagini di interesse. In questo caso, verrà analizzata una serie di immagini di un ganglio della radice dorsale isolato, marcato con un fluorocromo sensibile al calcio e acquisito prima e dopo la stimolazione mediante elettrodo intracellulare. Delimitare la regione di interesse all'interno della serie di immagini.

Aggiungere la serie di immagini selezionata al gestore delle aree di interesse, come appena dimostrato, e selezionare Scansione Multipla per aprire la finestra popup delle opzioni del protocollo. Ripristinare il limite di scansione se necessario e selezionare il grafico con deviazione standard e/o sottrarre le aree di sfondo, in base alle esigenze sperimentali. Quindi, fare clic su OK per eseguire il protocollo, generando due finestre di output grafico.

In questo esempio rappresentativo di analisi di una sezione di tessuto contenente neuroni marcati con fluorescenza, è stata tracciata una regione di interesse attraverso il segnale intenso della proteina di interesse, ed è stata eseguita un'analisi standard di scansione radiale per raccogliere i profili di intensità dei pixel in senso radiale dal centro della regione di interesse fino al limite di scansione definito. Le scansioni radiali sono state normalizzate rispetto al raggio della regione di interesse nella direzione della scansione. È stata calcolata una media, ottenendo un profilo integrale di intensità dei pixel in senso radiale, che ha rivelato come la maggior parte della proteina di interesse fosse localizzata sulla membrana plasmatica della cellula.

Dato che per questa analisi è stato selezionato il grafico con deviazione standard, le linee verticali di deviazione standard indicavano la variabilità tra le intensità dei pixel dei singoli profili di scansione radiale a una determinata distanza dall'origine della scansione. In questa analisi, più regioni di interesse all'interno del campione di tessuto neuronale sono state scansionate, come appena dimostrato, generando un profilo di intensità integrale dei pixel per ciascun oggetto scansionato, nell'ordine in cui è stato aggiunto al gestore delle regioni di interesse, e un profilo medio di intensità dei pixel per ciascuna regione di interesse selezionata.

Queste barre di deviazione standard rappresentano quindi la variabilità tra scansioni integrali di oggetti singoli, piuttosto che tra scansioni radiali individuali. In questo caso, è stata eseguita un'analisi mediante stack di immagini di un neurone isolato del ganglio della radice dorsale, acquisite in diversi momenti, prima e dopo la stimolazione, tramite elettrodo intracellulare. Al termine dell'analisi, sono stati visualizzati un profilo di intensità integrale dei pixel delle singole istanze dell'oggetto di interesse su diverse immagini all'interno dello stack e un profilo medio di intensità dei pixel per tutte le istanze dell'oggetto.

Inoltre, l'analisi della deviazione standard di un'immagine a stack eseguita con la scansione orologio dimostra la variabilità dei dati tra le scansioni integrali lungo l'intero stack di immagini. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come misurare le intensità dei pixel utilizzando plugin per la scansione orologio. Il nostro scopo nello sviluppare questi plugin era quello di rendere gratuitamente disponibili a ogni ricercatore questo tipo di analisi delle immagini.

Riteniamo che il protocollo di scansione oraria sarà utilizzato in molti settori di ricerca, inclusi ma non limitati a, applicazioni di imaging biologico, chimico e fisico. Mentre continuiamo a sviluppare e gestire questi plugin di scansione oraria, apprezzeremo qualsiasi feedback e suggerimento da parte di soggetti interessati su come migliorare questi strumenti.