Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare strumenti di analisi digitale per effettuare rapidamente conteggi accurati delle cellule in sospensione o in migrazione in una membrana del saggio di invasione. Questo protocollo può aiutare i ricercatori a quantificare il numero di cellule necessario per le tecniche comuni e i saggi di motilità cellulare in vitro. Il vantaggio principale di questo metodo è che fornisce conteggi cellulari rapidi e accurati, includendo al contempo più filtri e strumenti di analisi.

Per iniziare, impostare l'illuminazione del microscopio al massimo. Passa all'obiettivo 4x e assicurati che i filtri di contrasto di fase siano in uso. Quindi, all'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di acquisizione delle immagini sui valori predefiniti.

Posizionare ora un emocitometro standard sul tavolino del microscopio e acquisire un'immagine per la fase di calibrazione del volume dell'immagine. Regolare il tempo di esposizione secondo necessità. In ImageJ, sotto il calcolatore della concentrazione cellulare, apri l'immagine e fai clic sul pulsante Ottieni dimensione immagine.

Questa azione riempie le caselle di testo della larghezza e dell'altezza dell'immagine con la risoluzione dell'immagine in pixel. Quindi, selezionare lo strumento linea retta e tracciare una linea retta per l'intera lunghezza del quadrato p primario dell'emocitometro facendo clic e trascinando il cursore. Quindi, premere il tasto M per visualizzare la finestra dei risultati.

Ora, digita il valore dalla colonna della lunghezza nella casella di testo della lunghezza del quadrato p nel calcolatore della concentrazione delle celle. Quindi, fai clic sul pulsante Calcola volume immagine per emettere il volume dell'immagine nella casella di testo del volume dell'immagine. Infine, fai clic sul pulsante Salva per completare la calibrazione del plug-in.

Per l'analisi del campione, caricare 10 microlitri di cellule in entrambe le camere di un vetrino per emocitometro e regolare la messa a fuoco in modo che l'interno delle cellule sia più scuro della membrana cellulare per fornire la messa a fuoco all'interno della sezione trasversale centrale della cellula e non ai poli. Quindi, regolare ulteriormente l'esposizione in modo che le celle non siano sovraesposte. Sono accettabili linee dell'emocitometro leggermente visibili.

Ora, cattura da cinque a dieci immagini non sovrapposte della regione centrale dell'emocitometro. La risoluzione e l'ingrandimento di ciascuna immagine devono essere gli stessi dell'immagine di calibrazione del volume. Successivamente, nel calcolatore della concentrazione cellulare, fare clic su Conta celle e nella finestra popup, selezionare una cartella da contare.

Successivamente, nella casella di immissione del numero di campione, immettere il numero di immagini scattate per camera e fare clic su OK. Il plug-in raccoglierà ora i dati. Si veda il testo per maggiori dettagli. Per iniziare, all'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di acquisizione delle immagini sui valori predefiniti.

Per la fase del cannocchiale da dissezione, utilizzare uno sfondo bianco solido e utilizzare una sorgente luminosa sopra la scena, preferibilmente due luci LED flessibili. A questo punto, posizionare un vetrino a membrana per il saggio di migrazione completato sullo stadio. Osservando l'immagine in tempo reale visualizzata dal software, è possibile regolare manualmente l'ingrandimento in modo che i bordi di una singola membrana si trovino all'interno del campo visivo della telecamera.

Quindi, regolare le posizioni della sorgente luminosa e i tempi di esposizione per riprodurre, il più fedelmente possibile, l'immagine ideale. Che ha un colore di sfondo minimo e una membrana illuminata in modo uniforme. L'accuratezza del conteggio delle cellule dipende dall'acquisizione di immagini di alta qualità.

È quindi importante catturare la migliore immagine ottenibile dalla fotocamera dell'utente per l'uso più efficiente dei plugin. Ora, rimuovere il vetrino e bilanciare il bianco dell'immagine nel software del microscopio per completare la calibrazione. Immediatamente prima dell'imaging, appiattire ciascuna membrana applicando pressione sul vetrino coprioggetti per rimuovere il maggior numero possibile di bolle intrappolate.

Ora, all'interno del software, imposta la posizione della cartella di acquisizione. Quindi, acquisire un'immagine per membrana, salvando i file di immagine come TIF utilizzando la convenzione di denominazione del campione 001 con aumenti incrementali del numero per ogni immagine. Questa convenzione di denominazione è necessaria affinché il plug-in trovi i file.

Se si desidera la correzione del campo piatto, per ogni diapositiva trovare un'area vuota e scattare un'immagine vuota. Salva il file come nome del campione vuoto. Successivamente, in ImageJ, apri il plug-in TC.

All'interno di TC, fare clic sul pulsante Flatfield e dalla finestra di dialogo Scegli directory selezionare la cartella in cui sono state salvate le immagini della membrana. A questo punto, aprire un'immagine della membrana del saggio di migrazione e selezionare Soglia colore. Nella finestra, imposta il metodo su Shanbhag.

Impostare il colore di soglia su bianco. Imposta lo spazio colore su RGB e deseleziona l'opzione sfondo scuro. Quindi, regola i cursori superiori su zero e i cursori inferiori su 255 per rendere l'immagine completamente bianca.

Una volta bianchi, regolate i cursori verde e rosso fino a quando non sono visibili solo i nuclei. Nel plug-in TC, copiare i valori dei cursori RGB nelle caselle di testo della soglia RGB delle impostazioni di configurazione associate. Quindi, fare clic sul pulsante Aggiungi/Modifica e sovrascrivere la configurazione.

Nel pannello delle impostazioni di configurazione, fare clic su Salva per scrivere le impostazioni sul disco rigido. Ora, per contare le immagini con il plugin TC, clicca su Count Folder e seleziona la cartella da contare. Il programma elaborerà quindi le immagini e aggiungerà automaticamente i dati alla tabella principale.

Ora, nella tabella principale, ci sarà un segno di spunta nella sezione Calibrare? La colonna se nell'immagine è contrassegnata per la calibrazione in base alla sua somiglianza con le metriche ideali. Seleziona tutti i campioni contrassegnati per la calibrazione.

Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona Riconteggio e dimensione suggerita. Questo racconterà le immagini con l'area minima delle particelle suggerita. Quindi, fai nuovamente clic con il pulsante destro del mouse e seleziona Mostra grafico.

Un'immagine ideale avrà un grafo simile a una distribuzione normale a coda destra lunga. Se necessario, regolare l'intervallo di dimensioni inferiore o le impostazioni della soglia RGB selezionando il campione, facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando Riconteggio e Impostazioni manuali. Quindi, inserisci le impostazioni desiderate e fai clic su Conteggio per ricontare l'immagine.

Per regolare manualmente i conteggi, selezionare i campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella e selezionare Apri immagine con conteggi. L'immagine originale si aprirà con segni rossi che rappresentano ogni particella contata dal plugin. Inoltre, l'opzione Mostra immagine binaria conteggiata può essere utilizzata per verificare l'efficacia della risoluzione delle singole celle in base alla soglia del colore.

Per aggiungere manualmente un conteggio, tieni premuto il tasto Ctrl e fai clic con il pulsante sinistro del mouse. Questo aggiungerà un indicatore nella posizione del cursore che viene aggiunto al conteggio totale. Per rimuovere manualmente un marcatore, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e il plug-in rimuoverà il marcatore più vicino al cursore.

Per rimuovere un gruppo di marcatori, selezionare una regione di interesse e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla regione tenendo premuto il tasto Ctrl. Il processo del calcolatore della concentrazione cellulare dipende dall'immagine di calibrazione del quadrato p e dal calcolo della lunghezza del quadrato p e dei pixel. Il p-quadrato di un emocitometro ha un volume di 100 nanolitri e, data questa costante, il volume totale dell'immagine può essere calcolato dopo aver convertito i pixel in millimetri.

Un confronto tra conteggio manuale e automatizzato di oltre 57 immagini provenienti da vari esperimenti e tipi di cellule, mostra che esiste una correlazione molto stretta tra i due metodi. Le concentrazioni comprese tra cinque milioni e 2.000 cellule per millilitro sono state contate con precisione utilizzando il processo automatizzato. La metrica Q rappresenta la nitidezza complessiva delle immagini in base alla distribuzione di particelle di dimensioni distinte.

Un Q adeguato è maggiore di 0,5. Applicando questi qualificatori a una selezione di immagini da modeste a eccellenti per quanto riguarda la luminosità e il rumore di fondo, i conteggi delle immagini calibrate erano significativamente più vicini ai conteggi manuali rispetto ai conteggi delle immagini non calibrate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come contare in modo accurato ed efficiente le cellule in sospensione e dai saggi di motilità cellulare utilizzando i plug-in CCC e TC ImageJ.

Una volta padroneggiato il plug-in TC, in cui l'acquisizione, la quantificazione e la regolazione della conta cellulare possono essere effettuate in meno di un'ora. Entrambi i plug-in si basano sulla funzione di conteggio delle particelle di ImageJ e possono essere modificati modificando le macro utilizzate da ImageJ. Ciò offre una maggiore flessibilità per l'utente per espandere l'ambito dei plug-in ad altre particelle.