Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare strumenti di analisi digitale per effettuare rapidamente conteggi accurati di cellule in una sospensione o su una membrana per saggi di migrazione e invasione. Questo protocollo può aiutare i ricercatori a quantificare il numero di cellule necessario per tecniche comuni e per saggi di motilità cellulare in vitro. Il vantaggio principale di questo metodo è che fornisce conteggi cellulari rapidi e precisi, includendo contemporaneamente diversi filtri e strumenti di analisi.

Per iniziare, impostare l'illuminazione del microscopio al massimo. Passare all'obiettivo 4x e assicurarsi che siano utilizzati i filtri per contrasto di fase. Quindi, all'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di acquisizione dell'immagine ai valori predefiniti.

Ora posizionare un emocitometro standard sul palchetto del microscopio ed acquisire un'immagine per la fase di calibrazione del volume dell'immagine. Regolare il tempo di esposizione secondo necessità. In ImageJ, all'interno del calcolatore di concentrazione cellulare, aprire l'immagine e fare clic sul pulsante Ottieni dimensione immagine.

Questa azione compila le caselle di testo per la larghezza e l'altezza dell'immagine con la risoluzione dell'immagine in pixel. Successivamente, selezionare lo strumento linea retta e tracciare una linea retta lungo l'intera lunghezza del quadrato principale p dell'emocitometro, cliccando e trascinando il cursore. Quindi, premere il tasto M per visualizzare la finestra dei risultati.

Ora, digitare il valore della colonna lunghezza nella casella di testo della lunghezza p-quadrato nel calcolatore della concentrazione cellulare. Successivamente, fare clic sul pulsante Calcola Volume Immagine per inserire il volume dell'immagine nella casella di testo del volume dell'immagine. Infine, fare clic sul pulsante Salva per completare la calibrazione del plugin.

Per l'analisi del campione, caricare 10 microlitri di cellule in entrambe le camere di un vetrino per emocitometro e regolare la messa a fuoco in modo che l'interno delle cellule appaia più scuro rispetto alla membrana cellulare, al fine di ottenere una messa a fuoco precisa nella sezione trasversale centrale della cellula e non ai poli. Successivamente, regolare ulteriormente l'esposizione in modo che le cellule non risultino sovraesposte. È accettabile che le linee dell'emocitometro siano leggermente visibili.

Ora, acquisisci da cinque a dieci immagini non sovrapposte della regione centrale dell'emocitometro. La risoluzione e l'ingrandimento di ogni immagine devono essere gli stessi utilizzati per l'immagine di calibrazione del volume. Successivamente, nel calcolatore della concentrazione cellulare, fai clic su "Count Cells" e nella finestra popup, seleziona una cartella da conteggiare.

Successivamente, nella casella di inserimento del numero di campioni, inserire il numero di immagini acquisite per camera e fare clic su OK. Il plugin raccoglierà ora i dati. Per ulteriori dettagli, consultare il testo. Per iniziare, all'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di acquisizione delle immagini sui valori predefiniti.

Per la fase dell'osservazione al microscopio stereoscopico, utilizzare uno sfondo bianco opaco e una sorgente luminosa posizionata sopra il piano, preferibilmente due lampade LED flessibili. Posizionare ora sul piano un vetrino completo con la membrana dell'assay di migrazione. Osservando l'immagine in tempo reale visualizzata dal software, regolare manualmente l'ingrandimento in modo che i margini di una singola membrana siano appena entro il campo visivo della telecamera.

Quindi, regolare le posizioni delle sorgenti luminose e i tempi di esposizione per riprodurre, nel modo più fedele possibile, l'immagine ideale, che presenta un colore di fondo minimo e una membrana uniformemente illuminata. L'accuratezza del conteggio cellulare dipende dall'acquisizione di immagini di alta qualità.

È quindi fondamentale acquisire l'immagine migliore possibile ottenibile con la fotocamera dell'utente per un utilizzo il più efficiente dei plugin. Ora, rimuovere il vetrino e bilanciare il bianco dell'immagine tramite il software del microscopio per completare la calibrazione. Immediatamente prima dell'acquisizione, appiattire ogni membrana esercitando una pressione sul coprioggetto per rimuovere il maggior numero possibile di bolle intrappolate.

Ora, all'interno del software, impostare il percorso della cartella di acquisizione. Successivamente, acquisire un'immagine per ogni membrana, salvando i file delle immagini in formato TIF utilizzando la convenzione di denominazione del campione 001, con incrementi progressivi del numero per ogni immagine. Questa convenzione di denominazione è necessaria affinché il plugin possa individuare i file.

Se si desidera la correzione flatfield, per ogni vetrino individuare un'area vuota ed acquisire un'immagine vuota. Salvare il file come nome_campione vuoto. Successivamente, in ImageJ, aprire il plugin TC.

All'interno di TC, fare clic sul pulsante Flatfield e, dalla finestra di dialogo Scegli cartella, selezionare la cartella in cui sono state salvate le immagini della membrana. Aprire ora un'immagine della membrana per il saggio di migrazione e selezionare Soglia colore. Nella finestra, impostare il metodo su Shanbhag.

Impostare il colore della soglia su bianco. Impostare lo spazio colore su RGB e deselezionare l'opzione di sfondo scuro. Successivamente, regolare i cursori superiori su zero e quelli inferiori su 255 per rendere l'immagine completamente bianca.

Una volta ottenuto il bianco, regolare i cursori verde e rosso finché sono visibili solo i nuclei. Nel plugin TC, copiare i valori dei cursori RGB nei corrispondenti campi di testo della soglia RGB nelle impostazioni di configurazione. Quindi, fare clic sul pulsante Aggiungi/Modifica e sovrascrivere la configurazione.

Nel pannello delle impostazioni di configurazione, fare clic su Salva per scrivere le impostazioni sul disco rigido. A questo punto, per conteggiare le immagini con il plugin TC, fare clic su Conta cartella e selezionare la cartella da conteggiare. Il programma elaborerà quindi le immagini e aggiungerà automaticamente i dati alla tabella principale.

Ora, nella tabella principale, verrà visualizzato un segno di spunta nella colonna Calibrare? se l'immagine è contrassegnata per la calibrazione in base alla somiglianza con le metriche ideali. Selezionare tutti i campioni contrassegnati per la calibrazione.

Quindi, fare clic con il tasto destro e selezionare Riconteggio e Dimensione Suggerita. Verranno così riconteggiate le immagini con l'area minima suggerita della particella. Successivamente, fare nuovamente clic con il tasto destro e selezionare Mostra Grafico.

Un'immagine ideale presenterà un grafico simile a una distribuzione normale con coda destra lunga. Se necessario, regolare l'intervallo inferiore delle dimensioni o le soglie RGB selezionando il campione, facendo clic con il tasto destro e scegliendo Riconteggio e Impostazioni Manuali. Quindi, inserire le impostazioni desiderate e fare clic su Conta per ricontare l'immagine.

Per regolare manualmente i conteggi, selezionare i campioni, fare clic con il tasto destro sulla tabella e scegliere Apri immagine con conteggi. Verrà aperta l'immagine originale con marcature rosse che rappresentano ciascuna particella conteggiata dal plugin. Inoltre, l'opzione Mostra immagine binaria conteggiata può essere utilizzata per verificare quanto bene le singole cellule vengono risolte mediante la soglia di colore.

Per aggiungere manualmente un conteggio, tenere premuto il tasto control e fare clic con il pulsante sinistro del mouse. Verrà aggiunto un marcatore nella posizione del cursore, che sarà incluso nel conteggio totale. Per rimuovere manualmente un marcatore, fare clic con il pulsante destro sull'immagine e il plugin rimuoverà il marcatore più vicino al cursore.

Per rimuovere un gruppo di marcatori, selezionare una regione di interesse e fare clic con il tasto destro sulla regione tenendo premuto il tasto control. Il funzionamento del calcolatore di concentrazione cellulare dipende dall'immagine di calibrazione del p-quadrato e dal calcolo della lunghezza del p-quadrato in pixel. Il p-quadrato di un emocitometro ha un volume di 100 nanolitri e, dato questo valore costante, il volume totale dell'immagine può essere calcolato dopo aver convertito i pixel in millimetri.

Un confronto tra conteggi manuali e automatici su 57 immagini provenienti da diversi esperimenti e tipi cellulari mostra una correlazione molto stretta tra i due metodi. Concentrazioni comprese tra cinque milioni e 2.000 cellule per millilitro sono state conteggiate con precisione mediante il processo automatico. La metrica Q rappresenta la chiarezza complessiva delle immagini in base alla distribuzione delle dimensioni distinte delle particelle.

Un Q adeguato è maggiore di 0,5. Applicando questi parametri di valutazione a una selezione di immagini da discrete a eccellenti per quanto riguarda luminosità e rumore di fondo, i conteggi ottenuti da immagini calibrate si sono rivelati significativamente più vicini ai conteggi manuali rispetto ai conteggi ottenuti da immagini non calibrate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come contare in modo accurato ed efficiente le cellule in sospensione e da saggi di mobilità cellulare utilizzando i plugin CCC e TC per ImageJ.

Una volta padroneggiato il plugin TC, in cui acquisizione, quantificazione e aggiustamento dei conteggi cellulari possono essere eseguiti in meno di un'ora. Entrambi i plugin si basano sulla funzione di conteggio delle particelle di ImageJ e possono essere modificati modificando le macro utilizzate da ImageJ. Ciò offre all'utente una maggiore flessibilità per estendere l'ambito dei plugin ad altre particelle.