Name: Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Impara a quantificare le cellule con i plugin ImageJ CCC e TC per analisi di emocitometro e saggi di migrazione. Questi strumenti open-source offrono conteggi rapidi e accurati per la biologia cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 e OR 89931). Ringraziamo Jelena Brkic per la sua idea iniziale di analisi delle particelle binarie in ImageJ.

<ol><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752(2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016).</li>
<li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coulter+principle%3A+foundation+of+an+industry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li>
<li>Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Animal+Cell+Culture%22">Animal Cell Culture</a>. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLouis%2C+KS+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).</li>
<li>Scott, W. N. Invasion and motility assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScott%2C+WN+%22Cancer+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Cell Culture: Methods and Protocols</a>. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-378a-5p+promotes+trophoblast+cell+survival%2C+migration+and+invasion+by+targeting+Nodal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal.</a> J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).</li>
<li>Adorno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutant-p53%2FSmad+Complex+Opposes+p63+to+Empower+TGFbeta-Induced+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis.</a> Cell. 137, 87-98 (2009).</li>
<li>Chung, T. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+microRNA-204+mediates+migration+and+invasion+of+endometrial+cancer+by+regulating+FOXC1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1.</a> Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%2FRev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">et al. In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+cell-counting+algorithm+for+fluorescently-stained+cells+in+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays.</a> Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Intern%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Grishagin, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cell+counting+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Automatic cell counting with ImageJ.</a> Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).</li>
<li>Thomas, C. R., Paul, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+image+analysis+in+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Applications of image analysis in cell technology.</a> Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appreciating+data%3A+warts%2C+wrinkles+and+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop%5BTitle%5D)+AND+%22Helpx.adobe.com%22%5BJournal%5D)">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html">https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html</a> (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Passaggi critici, risoluzione dei problemi e limitazioni La natura stessa di metodi computazionali automatizzati, in particolare quelle di analisi delle particelle, richiede la capacità matematiche per definire queste particelle. Di conseguenza, la precisione di entrambi Calcolo cellulare Concentrazione e contatore dosaggio migrazione majorly dipende fedeltà dell&#39;immagine, cioè quanto strettamente l&#39;immagine catturata assomiglia membrana campione cellulare o dosaggio migrazione. È quind...

Nel conteggio delle cellule in vitro è un&#39;importante tecnica di base in una vasta gamma di esperimenti di coltura tissutale. Accuratamente determinare il numero di cellule in una coltura è essenziale per la riproducibilità sperimentale e standardizzazione 1,2. Conteggio cellulare può essere eseguita manualmente utilizzando un emocitometro e utilizzando una varietà di metodi automatizzati, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi 3,4,5. La maggior parte dei metodi automatizzati per il conteggio delle cellule appartengono ad una delle due classi, quelli che utilizzano il principio Coulter o citometria a flusso. Contaglobuli sfruttano cellule resistenza elettrica per determinare il numero di cellule e le dimensioni. Sono veloci, accurati e più economico rispetto citometri a flusso. Tuttavia, essi sono raramente utilizzati solo per il conteggio delle cellule a causa del loro costo considerevole rispetto al conteggio manuale 3. Flusso citometri, d&#39;altra parte, sono costosi ma hanno molte applicazioni, come il conteggio delle cellule, analisi della forma cellule, structure e cella di misura interna marcatori 4,5. Le macchine che utilizzano uno di questi due principi sono disponibili da molti produttori. Conteggio manuale è conveniente, ma richiede tempo e soggetto a bias mentre i metodi automatici sono dotati di una frazione del tempo richiesto per il conteggio manuale, ma utilizzando macchine costose 6. Altre procedure di coltura cellulare comune ha in saggi di motilità cellulare in vitro, vale a dire, la migrazione cellulare e dell&#39;invasione 7. saggi di migrazione e invasione sono comunemente usati per studiare la motilità cellulare e invasività in risposta ad una risposta chemiotattica. Inoltre, essi sono ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale, la differenziazione, la risposta infiammatoria, e le metastasi di più tipi di cellule 7-11. Le cellule che sono migrati o invaso attraverso la membrana porosa di un saggio di migrazione possono essere quantificati in due modi diversi. In primo luogo, colorando le cellule con un colorante fluorescente, dissociazione from la membrana, e la quantificazione usando un lettore di fluorescenza 12. Una limitazione di questo metodo di quantificazione è che nessun record può essere conservato delle membrane e non vi è alcuna possibilità per ulteriori analisi 13. Il secondo metodo di quantificazione è per migrato / celle da fissi e colorati con colorante fluorescente o più comunemente, con coloranti citologici, come violetto di cristallo, toluidina colorante blu o ematossilina invaso; quindi le cellule vengono quantificati utilizzando manualmente immagini microscopiche invertite di queste membrane che è un compito molto tempo 12,13. Per superare gli inconvenienti di conteggio manuale delle cellule, sono stati sviluppati due contatori di cellule automatizzati affidabili ed accurate per concentrazione cellulare e per il dosaggio di migrazione. Questi algoritmi automatizzati contatore di cellule sono stati sviluppati per ImageJ come plugin usando il linguaggio del computer Java di Oracle. ImageJ è uno strumento di elaborazione immagine pubblica e diffuso sviluppato dal National Institute of Health (NIH) 14,15; in tal modo, scrivendo questi plugin per ImageJ facilita l&#39;integrazione nella comunità biologica. Automazione del conteggio delle cellule assicura un throughput elevato e riproducibilità rispetto al conteggio manuale. Anche se altri software e plug-in disponibili possono essere utilizzati per calcolare la concentrazione cellulare attraverso l&#39;analisi delle immagini 5,16,17, cellulare Concentrazione calcolatore di plug-in è veloce e può anche gestire diluizioni di cellule e trattamenti. Inoltre, tutti i risultati ei calcoli di questi due contatori possono essere salvati ed esportati. I due plugin descritti nel presente documento sono ottimizzate per l&#39;impiego di un microscopio a contrasto di fase per l&#39;imaging cellulare dal vivo e ampio campo di vista (cattura tutta la membrana) di imaging per membrane dosaggio migrazione attraverso l&#39;uso di un ambito dissezione. I plugin sono liberamente disponibili per il download con le istruzioni di installazione da: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>Terreni liquidi classici HyClone: RPMI 1640 - Con L-Glutammina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Terreni di coltura cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale boviano (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Integratore multimediale</td></tr><tr><td>HTR8/SVneo linea cellulare trofoblasto</td><td>Le cellule sono state ottenute dal Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canada)</td><td></td><td>Il software è progettato per funzionare con qualsiasi linea cellulare.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Preparato allo 0,20% (p/v) in 10 & micro; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari da 10 cm</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Tutte le piastre trattate per colture tissutali saranno adatte</td></tr><tr><td>Inserti in membrana in poliestere Transwell - 8.0&nbsp; &micro; m Dimensione dei pori</td><td>Costar 3422 ordinato da Fisher Scientific</td><td>7200150</td><td>Per piastre a 24 pozzetti; Dimensione dei pori: 8,0 & micro; m; diametro 6,5 mm; 0,33 cm2 area</td></tr><tr><td>di crescita Coloranti e reagenti per ematologia HARLECO, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3</td><td>EMD Millipore e ordinati da VWR</td><td>65044A, B, & C</td><td>Il set di coloranti Hemacolor è composto da tre flaconi di polietilene da 500 ml (16,9 once) e include un fissativo al metanolo (Soluzione 1), un colorante eosina o acido (Soluzione 2) e un blu di metilene o un colorante basico (Soluzione 3)Applicatore</td></tr> <tr><td>con punta in cotone</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio industriali a filo singolo</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Spessore: 0,30 mm (0,012")</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio - Prepuliti/Semplici</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Dimensioni: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses - Rettangoli n. 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Spessore: da 0,13 a 0,17 mm; Dimensioni: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscopio stereo da dissezione</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Il microsope è dotato di fotocamera per microscopio Leica Modello MC170 HD e il software della fotocamera è Leica App. Suite (LAS E2) Versione 3.1.1 [Build: 490]. Parti del microscopio:&nbsp; LED3000 Illuminazione spot Modello: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Obiettivo acromatico 1.0X, WD=90&nbsp; mm Modello: MOB306 & Acromatico obiettivo 0,32X, WD=303&nbsp; mm Modello: MOB315, obiettivo video 0,5X Modello: MTU-293</td></tr><tr><td>Assistente ematocitometro</td><td>Germania&nbsp;</td><td></td><td>0,100 mm Profondità - 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Microscopio a luce invertita Olympus</td><td>Corporation CKX41SF</td><td></td><td>Il microsope è dotato di Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS La fotocamera e il software della fotocamera sono Infinity analyze Versione 6.5.2</td></tr><tr><td>Armadio a flusso laminare 1300 Serie A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modello: 1375</td><td>Qualsiasi cappa a flusso laminare per il lavoro di coltura cellulare sarà adatta&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubatore per coltura cellulare</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modello: 370</td><td>Qualsiasi incubatore per colture cellulari sarà adatto - Le cellule sono state coltivate in ambiente umido, 5% CO2, 37 gradi; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Versione 1.50e</td><td>Versione minima richiesta</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Versione 1.8.0_66</td><td>Versione minima richiesta</td></tr></tbody></table>

automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule uso imagej plugin

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

L&#39;Istituto Nazionale di ImageJ di salute è una potente suite di software, liberamente disponibile l&#39;elaborazione delle immagini. ImageJ ha algoritmi di analisi delle particelle complete che possono essere utilizzati in modo efficace per contare varie particelle biologiche. Quando il conteggio gran numero di campioni di cellule, l&#39;emocitometro presenta un collo di bottiglia per quanto riguarda il tempo. Allo stesso modo, contando le membrane da saggi di migrazione / invasione con la ImageJ plug cellulare contatore, anche se precisa, è il lavoro eccezionalmente intenso, soggettiva, e famoso per causare dolore al polso. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato due plugin all&#39;interno ImageJ per il solo compito di emocitometro automatizzata (o volume noto) e il conteggio delle cellule migrazione / invasione. Entrambi i plugin si basano sulla capacità di acquisire micrografie di alta qualità con il minimo di sfondo. Sono facili da usare e ottimizzato per il conteggio rapido e l&#39;analisi di campioni di grandi dimensioni con strumenti di analisi integrati per aiutare la calibrazione dei conteggi. Combinando il principio di bases of Cell Contatore con un&#39;analisi automatizzata algoritmo di conteggio e post-conteggio, questo aumenta notevolmente la facilità con cui saggi di migrazione possono essere elaborati senza alcuna perdita di precisione.

Calcolatrice cellulare Concentrazione La figura 1 presenta il processo globale di calibrazione CCC e l&#39;acquisizione di immagini numerabile. Figura 1A e 1B rappresentano l&#39;immagine di calibrazione P-Square e calcolo della lunghezza del P-square in pixel. CCC determina concentrazione cellulare in un dato volume utilizzando la formula: <img alt="E...

Questo articolo descrive la quantificazione dell'emocitometro e delle micrografie di migrazione/invasione attraverso due nuovi plugin open-source di ImageJ Cell Concentration Calculator e Migration assay Counter. Inoltre, descrive i protocolli di acquisizione e calibrazione delle immagini e discute in dettaglio i requisiti di input dei plug-in.

Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare strumenti di analisi digitale per effettuare rapidamente conteggi accurati di cellule in una sospensione o su una membrana per saggi di migrazione e invasione. Questo protocollo può aiutare i ricercatori a quantificare il numero di cellule necessario per tecniche comuni e per saggi di motilità cellulare in vitro. Il vantaggio principale di questo metodo è che fornisce conteggi cellulari rapidi e precisi, includendo contemporaneamente diversi filtri e strumenti di analisi.Per iniziare, impostare l'illuminazione del microscopio al massimo. Passare all'obiettivo 4x e assicurarsi che siano utilizzati i filtri per contrasto di fase. Quindi, all'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di acquisizione dell'immagine ai valori predefiniti.Ora posizionare un emocitometro standard sul palchetto del microscopio ed acquisire un'immagine per la fase di calibrazione del volume dell'immagine. Regolare il tempo di esposizione secondo necessità. In ImageJ, all'interno del calcolatore di concentrazione cellulare, aprire l'immagine e fare clic sul pulsante Ottieni dimensione immagine.Questa azione compila le caselle di testo per la larghezza e l'altezza dell'immagine con la risoluzione dell'immagine in pixel. Successivamente, selezionare lo strumento linea retta e tracciare una linea retta lungo l'intera lunghezza del quadrato principale p dell'emocitometro, cliccando e trascinando il cursore. Quindi, premere il tasto M per visualizzare la finestra dei risultati.Ora, digitare il valore della colonna lunghezza nella casella di testo della lunghezza p-quadrato nel calcolatore della concentrazione cellulare. Successivamente, fare clic sul pulsante Calcola Volume Immagine per inserire il volume dell'immagine nella casella di testo del volume dell'immagine. Infine, fare clic sul pulsante Salva per completare la calibrazione del plugin.Per l'analisi del campione, caricare 10 microlitri di cellule in entrambe le camere di un vetrino per emocitometro e regolare la messa a fuoco in modo che l'interno delle cellule appaia più scuro rispetto alla membrana cellulare, al fine di ottenere una messa a fuoco precisa nella sezione trasversale centrale della cellula e non ai poli. Successivamente, regolare ulteriormente l'esposizione in modo che le cellule non risultino sovraesposte. È accettabile che le linee dell'emocitometro siano leggermente visibili.Ora, acquisisci da cinque a dieci immagini non sovrapposte della regione centrale dell'emocitometro. La risoluzione e l'ingrandimento di ogni immagine devono essere gli stessi utilizzati per l'immagine di calibrazione del volume. Successivamente, nel calcolatore della concentrazione cellulare, fai clic su "Count Cells" e nella finestra popup, seleziona una cartella da conteggiare.Successivamente, nella casella di inserimento del numero di campioni, inserire il numero di immagini acquisite per camera e fare clic su OK. Il plugin raccoglierà ora i dati. Per ulteriori dettagli, consultare il testo. Per iniziare, all'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di acquisizione delle immagini sui valori predefiniti.Per la fase dell'osservazione al microscopio stereoscopico, utilizzare uno sfondo bianco opaco e una sorgente luminosa posizionata sopra il piano, preferibilmente due lampade LED flessibili. Posizionare ora sul piano un vetrino completo con la membrana dell'assay di migrazione. Osservando l'immagine in tempo reale visualizzata dal software, regolare manualmente l'ingrandimento in modo che i margini di una singola membrana siano appena entro il campo visivo della telecamera.Quindi, regolare le posizioni delle sorgenti luminose e i tempi di esposizione per riprodurre, nel modo più fedele possibile, l'immagine ideale, che presenta un colore di fondo minimo e una membrana uniformemente illuminata. L'accuratezza del conteggio cellulare dipende dall'acquisizione di immagini di alta qualità.È quindi fondamentale acquisire l'immagine migliore possibile ottenibile con la fotocamera dell'utente per un utilizzo il più efficiente dei plugin. Ora, rimuovere il vetrino e bilanciare il bianco dell'immagine tramite il software del microscopio per completare la calibrazione. Immediatamente prima dell'acquisizione, appiattire ogni membrana esercitando una pressione sul coprioggetto per rimuovere il maggior numero possibile di bolle intrappolate.Ora, all'interno del software, impostare il percorso della cartella di acquisizione. Successivamente, acquisire un'immagine per ogni membrana, salvando i file delle immagini in formato TIF utilizzando la convenzione di denominazione del campione 001, con incrementi progressivi del numero per ogni immagine. Questa convenzione di denominazione è necessaria affinché il plugin possa individuare i file.Se si desidera la correzione flatfield, per ogni vetrino individuare un'area vuota ed acquisire un'immagine vuota. Salvare il file come nome_campione vuoto. Successivamente, in ImageJ, aprire il plugin TC.All'interno di TC, fare clic sul pulsante Flatfield e, dalla finestra di dialogo Scegli cartella, selezionare la cartella in cui sono state salvate le immagini della membrana. Aprire ora un'immagine della membrana per il saggio di migrazione e selezionare Soglia colore. Nella finestra, impostare il metodo su Shanbhag.Impostare il colore della soglia su bianco. Impostare lo spazio colore su RGB e deselezionare l'opzione di sfondo scuro. Successivamente, regolare i cursori superiori su zero e quelli inferiori su 255 per rendere l'immagine completamente bianca.Una volta ottenuto il bianco, regolare i cursori verde e rosso finché sono visibili solo i nuclei. Nel plugin TC, copiare i valori dei cursori RGB nei corrispondenti campi di testo della soglia RGB nelle impostazioni di configurazione. Quindi, fare clic sul pulsante Aggiungi/Modifica e sovrascrivere la configurazione.Nel pannello delle impostazioni di configurazione, fare clic su Salva per scrivere le impostazioni sul disco rigido. A questo punto, per conteggiare le immagini con il plugin TC, fare clic su Conta cartella e selezionare la cartella da conteggiare. Il programma elaborerà quindi le immagini e aggiungerà automaticamente i dati alla tabella principale.Ora, nella tabella principale, verrà visualizzato un segno di spunta nella colonna Calibrare? se l'immagine è contrassegnata per la calibrazione in base alla somiglianza con le metriche ideali. Selezionare tutti i campioni contrassegnati per la calibrazione.Quindi, fare clic con il tasto destro e selezionare Riconteggio e Dimensione Suggerita. Verranno così riconteggiate le immagini con l'area minima suggerita della particella. Successivamente, fare nuovamente clic con il tasto destro e selezionare Mostra Grafico.Un'immagine ideale presenterà un grafico simile a una distribuzione normale con coda destra lunga. Se necessario, regolare l'intervallo inferiore delle dimensioni o le soglie RGB selezionando il campione, facendo clic con il tasto destro e scegliendo Riconteggio e Impostazioni Manuali. Quindi, inserire le impostazioni desiderate e fare clic su Conta per ricontare l'immagine.Per regolare manualmente i conteggi, selezionare i campioni, fare clic con il tasto destro sulla tabella e scegliere Apri immagine con conteggi. Verrà aperta l'immagine originale con marcature rosse che rappresentano ciascuna particella conteggiata dal plugin. Inoltre, l'opzione Mostra immagine binaria conteggiata può essere utilizzata per verificare quanto bene le singole cellule vengono risolte mediante la soglia di colore.Per aggiungere manualmente un conteggio, tenere premuto il tasto control e fare clic con il pulsante sinistro del mouse. Verrà aggiunto un marcatore nella posizione del cursore, che sarà incluso nel conteggio totale. Per rimuovere manualmente un marcatore, fare clic con il pulsante destro sull'immagine e il plugin rimuoverà il marcatore più vicino al cursore.Per rimuovere un gruppo di marcatori, selezionare una regione di interesse e fare clic con il tasto destro sulla regione tenendo premuto il tasto control. Il funzionamento del calcolatore di concentrazione cellulare dipende dall'immagine di calibrazione del p-quadrato e dal calcolo della lunghezza del p-quadrato in pixel. Il p-quadrato di un emocitometro ha un volume di 100 nanolitri e, dato questo valore costante, il volume totale dell'immagine può essere calcolato dopo aver convertito i pixel in millimetri.Un confronto tra conteggi manuali e automatici su 57 immagini provenienti da diversi esperimenti e tipi cellulari mostra una correlazione molto stretta tra i due metodi. Concentrazioni comprese tra cinque milioni e 2.000 cellule per millilitro sono state conteggiate con precisione mediante il processo automatico. La metrica Q rappresenta la chiarezza complessiva delle immagini in base alla distribuzione delle dimensioni distinte delle particelle.Un Q adeguato è maggiore di 0,5. Applicando questi parametri di valutazione a una selezione di immagini da discrete a eccellenti per quanto riguarda luminosità e rumore di fondo, i conteggi ottenuti da immagini calibrate si sono rivelati significativamente più vicini ai conteggi manuali rispetto ai conteggi ottenuti da immagini non calibrate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come contare in modo accurato ed efficiente le cellule in sospensione e da saggi di mobilità cellulare utilizzando i plugin CCC e TC per ImageJ.Una volta padroneggiato il plugin TC, in cui acquisizione, quantificazione e aggiustamento dei conteggi cellulari possono essere eseguiti in meno di un'ora. Entrambi i plugin si basano sulla funzione di conteggio delle particelle di ImageJ e possono essere modificati modificando le macro utilizzate da ImageJ. Ciò offre all'utente una maggiore flessibilità per estendere l'ambito dei plugin ad altre particelle.

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Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Fonte: Dodge, R., et al. Conteggio rapido delle unità formanti colonie in formato piastra a 96 pozzetti applicato al microbioma di Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)Questo video mostra la quantificazione delle unità formanti colonie (CFU) di batteri associati all'intestino nelle mosche di Drosophila utilizzando un approccio seriale di diluizione e piastratura. I campioni di mosca omogeneizzati contenenti batteri intestinali vengono diluiti in serie, piastrati su agar e incubati per consentire la...

Quantificazione delle unità formanti colonie di batteri associati all'intestino nelle mosche Drosophila

Questo protocollo descrive la funzionalizzazione della superficie personalizzabile del sistema destiobiotina, streptavidina e APTES al fine di isolare specifici tipi di cellule di interesse. Inoltre, questo manoscritto copre le applicazioni, l'ottimizzazione e la verifica di questo processo.

Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale

L'ameba sociale Dictyostelium discoideum è stata recentemente istituita come sistema per studiare il misfolding e la proteostasi delle proteine. Qui, descriviamo una nuova metodologia basata sull'imaging per studiare l'aggregazione proteica indotta dalla temperatura e la risposta allo stress cellulare in D. discoideum.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

L'articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l'indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.

Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7

Presentiamo un metodo che utilizza un approccio di analisi delle immagini generalizzabile basato sull'area per identificare i conteggi delle cellule. L'analisi di diverse popolazioni cellulari ha sfruttato le significative differenze di altezza e struttura cellulare tra diversi tipi di cellule all'interno di un algoritmo adattivo.

Algoritmo di analisi delle immagini basato sull'area per la quantificazione delle cocolture di macrofagi-fibroblasti

Qui, viene presentato un metodo per l'analisi della cinetica di aggregazione proteica nel nematode Caenorhabditis elegans. Gli animali di una popolazione sincronizzata con l'età vengono ripresi in diversi punti temporali, seguiti dal conteggio dell'inclusione semiautomatica in CellProfiler e dall'adattamento a un modello matematico in AmyloFit.

Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans

Questo metodo quantifica l'abbondanza microbica utilizzando un formato di piastra a 96 pozzetti per le unità formanti colonie di placca (CFU) e viene applicato al microbioma di Drosophila in campioni di omogenato di mosca interi. I CFU vengono conteggiati con un software di analisi delle immagini automatizzato fornito qui.

Conteggio rapido delle unità formanti colonie in formato piastra a 96 pozzetti applicato al microbioma Drosophila

Questo articolo descrive i metodi passo dopo passo per automatizzare la quantificazione dei nuclei basata su immagini utilizzando un programma eseguibile open source convalidato in una gamma di densità cellulari. Questo programma fornisce un'alternativa che affronta le barriere relative ai costi, all'accessibilità per gli utenti con competenze tecnologiche limitate e alla convalida specifica dell'applicazione che può limitare l'utilità delle tecnologie esistenti.

Utilizzo delle librerie di visione artificiale per semplificare la quantificazione dei nuclei

Impara a quantificare le cellule con i plugin ImageJ CCC e TC per analisi di emocitometro e saggi di migrazione. Questi strumenti open-source offrono conteggi rapidi e accurati per la biologia cellulare.

Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin

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