Quantificare la morfologia di Microglia da microfotografie di Immunohistochemistry preparato tessuto usando ImageJ
June 5th, 2018
Le microglia sono cellule immunitarie del cervello che rilevare e reagiscono alla fisiologia cerebrale alterata attraverso cambiamenti morfologici che può essere valutata quantitativamente. Questo protocollo illustra un ImageJ basato su protocollo di analisi per rappresentare le microglia morfologia come dati in continuo secondo metriche come ramificazione delle cellule, la complessità e la forma.
L'obiettivo generale di questi metodi di analisi dello scheletro e dei frattali è misurare la morfologia della microglia da tessuti preparati con IHC, utilizzando metodi quantitativi che sono sia di natura ad alto rendimento che sensibili per rilevare piccole differenze nelle forme cellulari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo neuroinfiammatorio, definendo le sfumature della forma e della funzione della microglia durante la salute e la malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che quantifica la morfologia della microglia utilizzando variabili continue piuttosto che categoriali.
I metodi qui descritti non richiedono software proprietario e possono essere utilizzati per lo screening delle regioni cerebrali o per l'analisi cellula per cellula. A dimostrare la procedura sarà Kimberly Young, un tecnico del mio laboratorio. Prima di iniziare, assicurati che il plug-in AnalayzeSkeleton sia stato scaricato su ImageJ o Fiji.
Quindi aprire una pila Z da 30 micron che mostra il cervello immunocolorato Iba1. Se si utilizza una fotomicrografia a fluorescenza, assicurarsi che l'immagine sia a 8 bit e convertirla in scala di grigi per visualizzare al meglio tutte le colorazioni positive. Utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su Immagine, Tabelle di ricerca, Grigi.
Se si utilizza una fotografia DAB in campo chiaro, utilizzare prima il plug-in del filtro passa-banda FFT con le impostazioni predefinite. Fare clic su Elabora, FFT, Filtro passa-banda, quindi convertire in scala di grigi. Se l'immagine è troppo debole per visualizzare il processo della microglia, utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su Immagine, Regola, Luminosità/Contrasto.
Regolare i cursori minimo o massimo in base alle esigenze, fino ai bordi dell'istogramma, ma non oltre. La regolazione della luminosità produce la massima variabilità nell'analisi dei dati ed è quindi il passaggio più critico. Quindi, esegui un filtro Maschera di contrasto per aumentare ulteriormente il contrasto, facendo clic su Elabora, Filtri, Maschera di contrasto.
Esegui un passaggio di smacchiatura per rimuovere il rumore di sale e pepe generato dalla maschera di contrasto. Utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su Elabora, Disturbo, Smacchia. Converti l'immagine in binario selezionando Immagine, Regola, Soglia.
Quindi applica la funzione Despeckle all'immagine binaria per rimuovere qualsiasi disturbo residuo del singolo pixel. Quindi applicare la funzione Chiudi facendo clic su Elabora, Binario, Chiudi, per collegare i pixel scuri separati da un massimo di due pixel. Quindi, rimuovi i valori anomali facendo clic su Processo, Rumore, Rimuovi valori anomali.
Dopo aver salvato l'immagine come file separato per un uso futuro, scheletrare l'immagine utilizzando la barra degli strumenti, facendo clic su Elabora, Binario, Scheletratura. Selezionare l'immagine scheletrata ed eseguire il plug-in AnalyzeSkeleton facendo clic su Plugin, Skeleton, Analyze Skeleton e selezionando la casella delle informazioni sul ramo. Copiare i dati dai risultati e dalle informazioni sui rami e incollare i dati in un foglio di calcolo di Excel.
In Excel, tagliare i dati per rimuovere i frammenti di scheletro risultanti da IHC e dall'acquisizione di immagini. Determinare la lunghezza dei frammenti che verranno tagliati dal set di dati aprendo l'immagine scheletrata in ImageJ e selezionando lo strumento Linea. Misura diversi frammenti, prendendo nota della lunghezza media, e decidi un valore limite, che dovrebbe essere coerente in tutto il set di dati.
Ordina in modo personalizzato il foglio di calcolo Excel facendo clic su Ordina e filtra, Ordinamento personalizzato. Ordina per voxel endpoint dal più grande al più piccolo e, in un nuovo livello, per ramo Mx PT dal più grande al più piccolo. Rimuovere ogni riga che contiene due punti finali con una lunghezza massima del ramo inferiore al valore limite.
Sommare i dati nella colonna degli endpoint per calcolare il numero totale di endpoint raccolti dall'immagine. Ripetere l'operazione per i dati informativi del ramo dopo l'ordinamento in base alla lunghezza del ramo. Dopo che tutti i dati sono stati tagliati e sommati, dividere i dati di ciascuna immagine per il numero di somi di microglia nell'immagine corrispondente.
Inserire i dati finali del punto finale e della lunghezza della cella e del ramo per cella nel software statistico. Assicurati che il plug-in FracLac sia stato scaricato. Quindi usa lo strumento rettangolo per disegnare il ROI.
Assicurarsi che la casella sia sufficientemente grande da acquisire l'intera cella e che possa rimanere coerente in tutto il set di dati. Nella finestra Gestione ROI, selezionare Aggiorna per bloccare la ROI su una cella selezionata casualmente nel fotomicrografo. Apri l'immagine binaria contenente la cella selezionata.
Fare doppio clic sullo strumento Pennello, impostare il colore sul nero e regolare la larghezza del pennello in base alle esigenze. Utilizzando la micrografia fotografica corrispondente come riferimento, utilizzare il pennello per rimuovere i processi cellulari adiacenti, collegare i processi frammentati e isolare la cella di interesse. Una volta isolata la cella binaria, salva il file binario.
Converti la cella binaria in un contorno utilizzando la barra degli strumenti, tramite Elabora, Binario, Contorno. Nella barra degli strumenti, apri FracLac utilizzando la barra degli strumenti, facendo clic su Plugin, Analisi frattale, FracLac e seleziona BC per il conteggio delle caselle. In Progettazione griglia, impostare Num G su quattro.
In Opzioni grafiche selezionare la casella delle metriche per analizzare il guscio convesso e il cerchio di delimitazione della cella. Al termine, selezionare OK, quindi selezionare il pulsante Scansione per eseguire una scansione di conteggio delle caselle sull'immagine selezionata. Nella finestra Risultati scafo e cerchio, copiare tutti i risultati dei dati desiderati.
Quindi fai lo stesso nella finestra Riepilogo conteggio caselle. Trasferisci i dati copiati su un file Excel o su un software statistico. Questo grafico mostra i dati riepilogativi degli endpoint della microglia per cellula e della lunghezza elaborata per cellula nel tessuto corticale illeso e danneggiato.
Questo è il risultato dell'analisi con il protocollo applicato. In entrambi i casi, l'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test T di Students e sono state analizzate tre immagini. Nell'applicazione del protocollo è necessario prestare attenzione alla variabilità tra utenti.
Tali differenze sono riassunte qui, dove lo stesso set di dati è stato analizzato da due utenti indipendenti applicando un protocollo identico. Sebbene le tendenze siano simili, la variabilità tra utenti influisce sulla significatività dei dati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'obiettivo è ottenere uno scheletro o un modello di contorno che sia rappresentativo della fotomicrografia originale.
Ciò significa che i passaggi possono essere modificabili in base alle esigenze specifiche dello sperimentatore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare rapidamente la morfologia della microglia da fotomicrografie di tessuti immunoistochimici utilizzando un software per computer prontamente disponibile.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per quantificare la morfologia della microglia utilizzando ImageJ, concentrandosi sull'analisi del tessuto cerebrale preparato immunoistochimicamente. Il metodo mira a esplorare le variazioni nella forma della microglia legate alle condizioni neuroinfiammatorie, affrontando aspetti cruciali della funzione microgliale sia in salute che in malattia.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Immunologia
Sfondo
- Le microglia fungono da cellule immunitarie primarie nel cervello, rispondendo ai cambiamenti fisiologici.
- L'analisi quantitativa della morfologia della microglia può fornire informazioni sulla neuroinfiammazione.
- Questo protocollo utilizza software non proprietario, garantendo l'accessibilità per lo screening di varie regioni cerebrali.
- I metodi ad alto rendimento facilitano il rilevamento di sottili differenze morfologiche.
Obiettivo dello studio
- Consentire un'analisi dettagliata della morfologia della microglia in stati cerebrali sani rispetto a quelli malati.
- Utilizzare metriche di dati continui (ad esempio, ramificazione cellulare) per valutazioni più precise.
- Affrontare questioni chiave sulla neuroinfiammazione riguardanti la forma e la funzione della microglia.
Metodi utilizzati
- L'analisi viene eseguita su tessuto cerebrale preparato immunoistochimicamente utilizzando ImageJ.
- Vengono impiegate tecniche come lo scheletrizzazione e l'analisi frattale per quantificare la morfologia microgliale.
- I passaggi includono l'adattamento della luminosità/contrasto, la conversione binaria e l'applicazione di vari filtri.
- L'analisi statistica e il taglio dei dati sono dettagliati per garantire risultati robusti.
- Sono incluse raccomandazioni per l'isolamento delle cellule e l'analisi di specifiche regioni di interesse (ROI).
Principali risultati
- I risultati quantitativi includono endpoint e misure della lunghezza dei rami per cella in diverse condizioni.
- I risultati iniziali mostrano tendenze nella morfologia microgliale che possono variare in base allo stato di lesione.
- L'analisi evidenzia l'importanza della variabilità morfologica nella funzione microgliale durante l'infiammazione.
- La variabilità tra utenti influisce sulla significatività dei dati ma rimane coerente nella direzione delle tendenze.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un protocollo dettagliato e riproducibile per valutare quantitativamente la morfologia della microglia.
- Migliora la comprensione della dinamica microgliale in salute e malattia, offrendo implicazioni per la ricerca sulla neuroinfiammazione.
- I metodi delineati favoriscono l'adattabilità nelle analisi su misura per esigenze di ricerca specifiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative microglia morphology analysis using ImageJ enables objective, high-throughput assessment of neuroinflammatory states in preclinical models. This approach supports early discovery teams by providing sensitive, reproducible metrics for cellular phenotyping and mechanistic de-risking. The protocol's accessibility and scalability facilitate portfolio-wide evaluation of neuroimmune targets and disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of microglial activation and morphological phenotypes in brain tissue.
- Supports functional target validation by linking cell shape metrics to neuroinflammatory status.
- Facilitates mechanistic de-risking through objective, continuous variable outputs.
- Improves predictive confidence for neuroimmune target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated image analysis workflows for downstream compound screening.
- Standardizes morphological quantification across multiple brain regions and conditions.
- Generates reproducible, quantitative outputs for assay benchmarking and optimization.
- Enables scalable, high-throughput screening of microglial responses to perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological endpoints with disease-relevant neuroinflammatory biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative cellular readouts.
- Enhances translational confidence by enabling cross-study comparability of microglial phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized, quantitative analysis of microglia in immunohistochemistry-prepared tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in neuroinflammation research.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible image analysis for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as endpoints, branch lengths, and complexity metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects morphological data to disease-relevant biomarkers and preclinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a non-proprietary, adaptable workflow for broad application across neuroimmune research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in image-based phenotyping.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuroinflammatory programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and neuroanatomy for accurate ROI selection and data interpretation.
- Needs access to immunohistochemistry-prepared tissue and open-source ImageJ plugins (AnalyzeSkeleton, FracLac).
- Demands cross-user standardization to minimize inter-operator variability in data outputs.
- Adaptable to various brain regions and experimental models with protocol modifications as needed.
- Careful thresholding and image preprocessing are critical to ensure data quality and comparability.
