Quantificare la morfologia di Microglia da microfotografie di Immunohistochemistry preparato tessuto usando ImageJ

L'obiettivo generale di questi metodi di analisi dello scheletro e dei frattali è misurare la morfologia della microglia da tessuti preparati con IHC, utilizzando metodi quantitativi che sono sia di natura ad alto rendimento che sensibili per rilevare piccole differenze nelle forme cellulari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo neuroinfiammatorio, definendo le sfumature della forma e della funzione della microglia durante la salute e la malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che quantifica la morfologia della microglia utilizzando variabili continue piuttosto che categoriali.

I metodi qui descritti non richiedono software proprietario e possono essere utilizzati per lo screening delle regioni cerebrali o per l'analisi cellula per cellula. A dimostrare la procedura sarà Kimberly Young, un tecnico del mio laboratorio. Prima di iniziare, assicurati che il plug-in AnalayzeSkeleton sia stato scaricato su ImageJ o Fiji.

Quindi aprire una pila Z da 30 micron che mostra il cervello immunocolorato Iba1. Se si utilizza una fotomicrografia a fluorescenza, assicurarsi che l'immagine sia a 8 bit e convertirla in scala di grigi per visualizzare al meglio tutte le colorazioni positive. Utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su Immagine, Tabelle di ricerca, Grigi.

Se si utilizza una fotografia DAB in campo chiaro, utilizzare prima il plug-in del filtro passa-banda FFT con le impostazioni predefinite. Fare clic su Elabora, FFT, Filtro passa-banda, quindi convertire in scala di grigi. Se l'immagine è troppo debole per visualizzare il processo della microglia, utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su Immagine, Regola, Luminosità/Contrasto.

Regolare i cursori minimo o massimo in base alle esigenze, fino ai bordi dell'istogramma, ma non oltre. La regolazione della luminosità produce la massima variabilità nell'analisi dei dati ed è quindi il passaggio più critico. Quindi, esegui un filtro Maschera di contrasto per aumentare ulteriormente il contrasto, facendo clic su Elabora, Filtri, Maschera di contrasto.

Esegui un passaggio di smacchiatura per rimuovere il rumore di sale e pepe generato dalla maschera di contrasto. Utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su Elabora, Disturbo, Smacchia. Converti l'immagine in binario selezionando Immagine, Regola, Soglia.

Quindi applica la funzione Despeckle all'immagine binaria per rimuovere qualsiasi disturbo residuo del singolo pixel. Quindi applicare la funzione Chiudi facendo clic su Elabora, Binario, Chiudi, per collegare i pixel scuri separati da un massimo di due pixel. Quindi, rimuovi i valori anomali facendo clic su Processo, Rumore, Rimuovi valori anomali.

Dopo aver salvato l'immagine come file separato per un uso futuro, scheletrare l'immagine utilizzando la barra degli strumenti, facendo clic su Elabora, Binario, Scheletratura. Selezionare l'immagine scheletrata ed eseguire il plug-in AnalyzeSkeleton facendo clic su Plugin, Skeleton, Analyze Skeleton e selezionando la casella delle informazioni sul ramo. Copiare i dati dai risultati e dalle informazioni sui rami e incollare i dati in un foglio di calcolo di Excel.

In Excel, tagliare i dati per rimuovere i frammenti di scheletro risultanti da IHC e dall'acquisizione di immagini. Determinare la lunghezza dei frammenti che verranno tagliati dal set di dati aprendo l'immagine scheletrata in ImageJ e selezionando lo strumento Linea. Misura diversi frammenti, prendendo nota della lunghezza media, e decidi un valore limite, che dovrebbe essere coerente in tutto il set di dati.

Ordina in modo personalizzato il foglio di calcolo Excel facendo clic su Ordina e filtra, Ordinamento personalizzato. Ordina per voxel endpoint dal più grande al più piccolo e, in un nuovo livello, per ramo Mx PT dal più grande al più piccolo. Rimuovere ogni riga che contiene due punti finali con una lunghezza massima del ramo inferiore al valore limite.

Sommare i dati nella colonna degli endpoint per calcolare il numero totale di endpoint raccolti dall'immagine. Ripetere l'operazione per i dati informativi del ramo dopo l'ordinamento in base alla lunghezza del ramo. Dopo che tutti i dati sono stati tagliati e sommati, dividere i dati di ciascuna immagine per il numero di somi di microglia nell'immagine corrispondente.

Inserire i dati finali del punto finale e della lunghezza della cella e del ramo per cella nel software statistico. Assicurati che il plug-in FracLac sia stato scaricato. Quindi usa lo strumento rettangolo per disegnare il ROI.

Assicurarsi che la casella sia sufficientemente grande da acquisire l'intera cella e che possa rimanere coerente in tutto il set di dati. Nella finestra Gestione ROI, selezionare Aggiorna per bloccare la ROI su una cella selezionata casualmente nel fotomicrografo. Apri l'immagine binaria contenente la cella selezionata.

Fare doppio clic sullo strumento Pennello, impostare il colore sul nero e regolare la larghezza del pennello in base alle esigenze. Utilizzando la micrografia fotografica corrispondente come riferimento, utilizzare il pennello per rimuovere i processi cellulari adiacenti, collegare i processi frammentati e isolare la cella di interesse. Una volta isolata la cella binaria, salva il file binario.

Converti la cella binaria in un contorno utilizzando la barra degli strumenti, tramite Elabora, Binario, Contorno. Nella barra degli strumenti, apri FracLac utilizzando la barra degli strumenti, facendo clic su Plugin, Analisi frattale, FracLac e seleziona BC per il conteggio delle caselle. In Progettazione griglia, impostare Num G su quattro.

In Opzioni grafiche selezionare la casella delle metriche per analizzare il guscio convesso e il cerchio di delimitazione della cella. Al termine, selezionare OK, quindi selezionare il pulsante Scansione per eseguire una scansione di conteggio delle caselle sull'immagine selezionata. Nella finestra Risultati scafo e cerchio, copiare tutti i risultati dei dati desiderati.

Quindi fai lo stesso nella finestra Riepilogo conteggio caselle. Trasferisci i dati copiati su un file Excel o su un software statistico. Questo grafico mostra i dati riepilogativi degli endpoint della microglia per cellula e della lunghezza elaborata per cellula nel tessuto corticale illeso e danneggiato.

Questo è il risultato dell'analisi con il protocollo applicato. In entrambi i casi, l'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test T di Students e sono state analizzate tre immagini. Nell'applicazione del protocollo è necessario prestare attenzione alla variabilità tra utenti.

Tali differenze sono riassunte qui, dove lo stesso set di dati è stato analizzato da due utenti indipendenti applicando un protocollo identico. Sebbene le tendenze siano simili, la variabilità tra utenti influisce sulla significatività dei dati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'obiettivo è ottenere uno scheletro o un modello di contorno che sia rappresentativo della fotomicrografia originale.

Ciò significa che i passaggi possono essere modificabili in base alle esigenze specifiche dello sperimentatore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare rapidamente la morfologia della microglia da fotomicrografie di tessuti immunoistochimici utilizzando un software per computer prontamente disponibile.