Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo

L'obiettivo generale di questo modello chirurgico e di questo metodo di analisi delle immagini è osservare l'effetto del trattamento su un modello preclinico di frattura da compressione vertebrale correlata all'osteoporosi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in questo campo della medicina rigenerativa gliale, come ad esempio quale potrebbe essere un trattamento efficace per le fratture vertebrali da compressione legate all'osteoporosi e in che modo un tale trattamento aiuterebbe nella rigenerazione ossea? Il vantaggio principale di questa tecnica è che coinvolge ratti nudi, quindi i nuovi trattamenti possono essere testati in vivo senza problemi di rigetto immunitario.

Inoltre, la rigenerazione ossea è alla base di questo metodo, qui presentato, è semiautomatizzata, quindi è più accurata e meno dipendente dall'utente rispetto a quanto precedentemente pubblicato. A dimostrare la procedura sarà il dottor Wafa Tawackoli, un ricercatore del nostro laboratorio. In primo luogo, indurre l'anestesia in un ratto osteoporotico utilizzando isoflurano al 5% in ossigeno al 100%, quindi trasferire in un cono nasale a una dose di isoflurano dal 2 al 3% per il mantenimento.

Radere la zona addominale utilizzando un rasoio elettrico. Tampone con antisettico a base di iodio in clorexidina gluconato allo 0,5% seguito da etanolo al 70%. Usa un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.

Applicare uno stimolo di pizzicamento delle dita dei piedi per garantire un adeguato piano di anestesia. Se non viene rilevata alcuna risposta, avviare la procedura. Posizionare il ratto anestetizzato in decubito dorsale su un termoforo impostato a 37 gradi Celsius e allungare gli arti utilizzando un sistema di retrazione con fissatore magnetico.

Iniettare nel ratto per via sottocutanea il carprofene prima di iniziare la procedura chirurgica. Dopo aver praticato un'incisione da cinque a otto centimetri nella pelle a partire da un centimetro sotto il processo xifoideo e attraverso la linea mediana, utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione dell'aponeurosi attraverso la linea alba per accedere alla cavità addominale. Esporre la cavità addominale utilizzando i divaricatori.

Deviare l'intestino a destra del ratto per esporre l'aorta addominale e il rene sinistro. Per evitare la disidratazione, utilizzare garze sterili imbevute per avvolgere gli organi interni. Utilizzare divaricatori aggiuntivi, se necessario, per esporre l'aorta.

Palpare la colonna lombare, quindi procedere all'esposizione. Utilizzare la termocauterizzazione per esporre l'aspetto anteriore dei corpi vertebrali lombari L da quattro a cinque e isolarli dal tessuto connettivo e dai muscoli circostanti. Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere il sangue e il tessuto residuo dalle quattro vertebre L.

Quindi utilizzare una punta da trapano sterile di due centimetri di diametro per perforare un difetto osseo profondo cinque millimetri al centro dell'aspetto anteriore esposto del corpo vertebrale. Applicare una pressione minima per perforare solo la corteccia ventrale e l'osso trabecolare sottostante. Evitare di perforare la corteccia dorsale.

Quindi perforare le L cinque vertebre allo stesso modo per creare due difetti per ratto. Al termine della perforazione, riportare l'intestino nella cavità addominale e rimuovere i divaricatori. Successivamente, utilizzare la sutura chirurgica riassorbibile sintetica vicryl in uno schema continuo per suturare l'aponeurosi.

Chiudere la pelle utilizzando una sutura monofilamento di nylon non assorbibile 4-0 in un semplice schema interrotto. Quindi applicare 100 microlitri di adesivo topico per la pelle sopra e tra le suture cutanee per garantire la completa chiusura della pelle. Dopo aver iniettato nel ratto una soluzione di ringer lattato a 37 gradi Celsius per prevenire l'ipotermia e la disidratazione e buprenorfina per alleviare il dolore post-operatorio, consentire all'animale di riprendersi dall'anestesia sul termoforo.

Il giorno successivo all'intervento chirurgico indurre l'anestesia con isoflurano come prima. Scansiona il ratto utilizzando uno scanner micro-CT in vivo. Dopo la scansione e il recupero dall'anestesia, riportare il ratto nella gabbia di casa.

Per separare i dati delle vertebre per l'analisi, fare clic sul programma di valutazione micro-CT e selezionare il campione dal menu. Quindi usa il mouse per contornare le singole vertebre su una fetta. Usa la barra Z per passare alla fetta successiva e contornare le singole vertebre allo stesso modo.

Salva la vertebra sagomata come file separato facendo clic su file, salva GOBJ ogni paio di fette. Quindi, dopo aver impostato la vertebra di riferimento, importarla in un ambiente micro-CT. Applicare il VOI definito per la vertebra di riferimento alla vertebra target registrata facendo clic su programma di valutazione micro-CT, file, carica GOBJ e selezionando il GOBJ precedentemente creato.

Infine, inviare il VOI per la valutazione utilizzando un programma di valutazione micro-CT. Questa immagine 3D frontale mostra un'immagine rappresentativa del difetto vertebrale un giorno dopo la generazione del difetto. La formazione ossea nel vuoto è indicata in rosso.

Si tratta di un'immagine 2D sagittale della stessa area e infine di un'immagine 2D assiale. Come si vede qui, la formazione ossea avviene nel tempo e viene rilevata con l'imaging longitudinale. La densità del volume osseo e la densità apparente sono state calcolate e confrontate utilizzando un'ANOVA a due vie a misure ripetute con correzione di Bonferroni per confronti multipli.

Come si vede qui, la densità del volume osseo e la densità apparente aumentano significativamente a partire da due settimane dopo la creazione del difetto vertebrale. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'istologia e l'immunoistochimica, al fine di rispondere a ulteriori domande, come quali cellule sono presenti e quali proteine sono espresse nel difetto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare più difetti vertebrali nei ratti nudi e analizzare la rigenerazione ossea nel tempo in questi difetti.