Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo

L'obiettivo generale di questo modello chirurgico e del metodo di analisi dell'immagine è osservare l'effetto del trattamento su un modello preclinico di frattura da compressione vertebrale correlata all'osteoporosi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in questo campo della medicina rigenerativa gliale, come ad esempio quale potrebbe essere un trattamento efficace per le fratture da compressione vertebrale correlate all'osteoporosi e in che modo un tale trattamento potrebbe favorire la rigenerazione ossea. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza ratti nudi, consentendo di testare trattamenti innovativi in vivo senza preoccupazioni legate al rigetto immunitario.

Inoltre, la rigenerazione ossea alla base di questo metodo qui presentato è semiautomatica, risultando quindi più accurata e meno dipendente dall'operatore rispetto ai metodi pubblicati in precedenza. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Wafa Tawackoli, scienziata ricercatrice del nostro laboratorio. Indurre prima l'anestesia in un ratto osteoporotico utilizzando isoflurano al 5% in ossigeno al 100%, quindi trasferire a un cono nasale con isoflurano al 2-3% per il mantenimento.

Rasare la zona addominale utilizzando un rasoio elettrico. Pulire con un antisettico a base di iodio contenente clorhexidina gluconato allo 0,5%, seguito da etanolo al 70%. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.

Applicare uno stimolo di pizzicamento alle dita dei piedi per verificare un adeguato livello di anestesia. Se non si osserva alcuna risposta, iniziare la procedura. Posizionare il ratto anestetizzato in decubito dorsale su un tappetino riscaldante impostato a 37 gradi Celsius e distendere gli arti utilizzando un sistema di retrazione con fissatore magnetico.

Somministrare al ratto una iniezione sottocutanea di carprofene prima di iniziare la procedura chirurgica. Dopo aver praticato un'incisione di cinque a otto centimetri a livello della cute, a partire da un centimetro al di sotto del processo xifode e lungo la linea mediana, utilizzare le forbici chirurgiche per incisionare l'aponeurosi attraverso la linea alba al fine di accedere alla cavità addominale. Esporre la cavità addominale utilizzando dei retrattori.

Devia le intestini verso destra nel ratto per esporre l'aorta addominale e il rene sinistro. Per evitare la disidratazione, utilizza garze sterili inumidite per avvolgere gli organi interni. Usa ulteriori retrattori secondo necessità per esporre l'aorta.

Palpare la colonna lombare, quindi procedere a esporla. Utilizzare la termocauterizzazione per esporre l'aspetto anteriore dei corpi vertebrali lombari da L4 a L5 e isolarli dal tessuto connettivo e dai muscoli circostanti. Utilizzare un bastoncino di cotone per rimuovere sangue e tessuto residuo dalla vertebra L4.

Successivamente, utilizzare un trapano sterile con punta da due centimetri di diametro per creare un difetto osseo profondo cinque millimetri al centro della faccia anteriore esposta del corpo vertebrale. Applicare una pressione minima per trapanare soltanto la corticale ventrale e l'osso trabecolare sottostante. Evitare di trapanare attraverso la corticale dorsale.

Quindi praticare il trapanamento delle vertebre L5 nello stesso modo, creando due difetti per ratto. Al termine del trapanamento, riposizionare l'intestino nella cavità addominale e rimuovere i retrattori. Successivamente, utilizzare un punto di sutura chirurgico sintetico riassorbibile in vicryl in un modello continuo per suturare l'aponeurosi.

Chiudere la cute utilizzando un punto singolo interrotto con filo di nylon monofilamento non riassorbibile 4-0. Applicare quindi 100 microlitri di adesivo topico per la cute sopra e tra i punti di sutura per garantire la chiusura completa della cute. Dopo aver iniettato nel ratto soluzione di Ringer lattato a 37 gradi Celsius per prevenire l'ipotermia e la disidratazione e buprenorfina per il sollievo dal dolore post-operatorio, lasciare l'animale riprendere dallo stato di anestesia su un tappetino riscaldante.

Il giorno successivo all'intervento chirurgico, indurre l'anestesia con isoflurano come in precedenza. Scansionare il ratto utilizzando un microscopio a tomografia computerizzata in vivo. Dopo la scansione e il risveglio dall'anestesia, restituire il ratto alla gabbia di alloggio.

Per separare i dati delle vertebre per l'analisi, fare clic sul programma di valutazione micro-TC e selezionare il campione dal menu. Quindi utilizzare il mouse per delineare singole vertebre su una sezione. Utilizzare la barra Z per passare alla sezione successiva e delineare le singole vertebre nello stesso modo.

Salvare la vertebra delineata come file separato facendo clic su file, salvare GOBJ ogni paio di sezioni. Successivamente, dopo aver impostato la vertebra di riferimento, importarla in un ambiente micro-CT. Applicare il VOI definito per la vertebra di riferimento alla vertebra target registrata facendo clic sul programma di valutazione micro-CT, file, caricare GOBJ e selezionando il file GOBJ precedentemente creato.

Infine, inviare il VOI per la valutazione utilizzando un programma di valutazione micro-TC. Questa immagine 3D frontale mostra un'immagine rappresentativa di un difetto vertebrale un giorno dopo la creazione del difetto. La formazione ossea nel vuoto è indicata in rosso.

Questa è un'immagine 2D sagittale della stessa area e, infine, un'immagine 2D assiale. Come si osserva qui, la formazione ossea avviene nel tempo ed è rilevata mediante imaging longitudinale. La densità del volume osseo e la densità apparente sono state calcolate e confrontate utilizzando un'ANOVA a due vie con misure ripetute e correzione di Bonferroni per confronti multipli.

Come mostrato qui, la densità del volume osseo e la densità apparente aumentano significativamente a partire da due settimane dopo la creazione del difetto vertebrale. A seguito di questa procedura, altri metodi come l'istologia e l'immunohistochimica possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali cellule sono presenti e quali proteine vengono espresse nel difetto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare multipli difetti vertebrali in ratti nudi e analizzare la rigenerazione ossea nel tempo all'interno di questi difetti.