Name: Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con losteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri un metodo semiautomatizzato di micro-tomografia computerizzata per analizzare fratture vertebrali da osteoporosi nel ratto nudo. Questa tecnica permette di valutare in vivo la rigenerazione ossea e testare nuovi trattamenti.

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La ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione al California Institute per la medicina rigenerativa (CIRM) (TR2-01780).

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati nell'ambito di un protocollo approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) del Cedars-Sinai Medical Center (protocollo n. 3609). L'anestesia è stata amministrata per tutte le procedure chirurgiche e di imaging. Tutti gli animali sono stati alloggiati secondo protocolli approvati IACUC.
 Nota: il disegno sperimentale del presente protocollo è illustrato nella Figura 1. L'acquisto di sei-settimana-vecchi ratti con loro ovaie chirurgicamente rimosso e dar loro da mangiare un LCD composto da fosfato di calcio e 0,77% 0.01%. Dopo un periodo di 4 mesi di un LCD, forare un difetto vertebrale dimensione critica i quarto e il quinto corpi vertebrali lombari (L4-L5). A seguito della chirurgia, della battuta i ratti il giorno 1 e settimane 2, 4, 8 e 12 dopo l'istituzione del difetto. Individuare difetti marginali sull'esplorazione del giorno 1, riorientare a una posizione standard e definire un volume cilindrico di interesse (VOI). Registrare automaticamente le scansioni successive µCT (cioè, per settimane 2, 4, 8 e 12) di ogni ratto alla posizione standard definita per la scansione di giorno 1 corrispondente. Applicare il giorno 1 predefiniti VOI le scansioni registrati. Valutare la densità di volume dell'osso e la densità apparente del VOIs.
 1. induzione di osteoporosi <ol><li>messo sei-settimana-vecchio athymic ovariectomizzati ratti in 4 mesi di un LCD composto da fosfato di calcio e 0,77% 0.01%.</li>
	<li>Interruttore torna a una dieta normale. 
	Nota: Questi ratti saranno essere definiti come &#34; osteoporotic ratti &#34; seguito.</li>
</ol> 2. Vertebrale difetto modello Nota: la sincronizzazione è 40-50 min per animale.
<ol><li>Autoclave tutti chirurgica degli strumenti prima della chirurgia.</li>
	<li>Nel caso di interventi chirurgici multipli, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici.
	<ol><li>Lavare gli strumenti e metterli in una vasca da bagno sonicatore per 5 min metterli in un set di sterilizzatore tallone caldo a 250 ° C per 20 s. Consenti gli strumenti per raffreddare per 5 min.</li>
	</ol></li> <li>Indurre anestesia.
	<ol><li>Posto il ratto osteoporotico nella camera di induzione attaccato ad una macchina di anestesia con un sistema centrale di scavenging. Indurre l'anestesia con isoflurano 5% in ossigeno 100% e mantenere via cono di naso a 2-3% isoflurane. Usare pomata veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.</li>
		<li>Applicare uno stimolo di punta-pizzico per assicurare adeguato piano di anestesia. Se nessuna risposta è notata, avvia la procedura.</li>
	</ol></li> <li>Posto ratto anestetizzato in decubito dorsale su un rilievo di riscaldamento (37 ° C) e allungare gli arti utilizzando un sistema di retrazione del fixator magnetico ( Figura 2A). 
	Nota: La temperatura del riscaldamento pad è importante per la prevenzione dell'ipotermia, poiché un ratto anestetizzato è in grado di regolare la sua temperatura corporea.</li>
	<li>Radere la zona addominale utilizzando un rasoio elettrico. Tampone con base di iodio antisettico e clorexidina gluconato 0,5% seguito da etanolo al 70%.</li>
	<li>Iniettare il ratto con carprofen (5 mg/kg di peso corporeo (BW), sottocutaneo (SQ)) prima di iniziare la procedura chirurgica.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi sterile per tagliare la pelle. Iniziare l'incisione 1 cm sotto il processo xifoideo e tagliare attraverso la linea mediana (~ 5-8 cm) ( Figura 2B).</li>
	<li>Utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione del aponeurosis attraverso la linea alba per accedere alla cavità addominale ( Figura 2).</li>
	<li>Esporre nella cavità addominale utilizzando divaricatori ( Figura 2D).</li>
	<li>Deviare l'intestino a destra del ratto per esporre l'aorta addominale ed il rene di sinistra ( Figura 2E). Palpare il rachide lombare prima di procedere per esporla. Per evitare la disidratazione, utilizzare garze sterili imbevute con soluzione salina sterile per avvolgere gli organi interni.</li>
	<li>Thermocautery uso per esporre a strati l'aspetto anteriore dei corpi vertebrali lombari L4-5 e isolarli dal tessuto connettivo e muscoli circostanti ( Figura 2F -G). 
	Nota: Thermocautery deve essere utilizzato per controllare l'emorragia durante la dissezione.</li>
	<li>Utilizzare un tampone di cotone sterile imbevuto di soluzione fisiologica sterile per rimuovere il tessuto sangue e residui da vertebre L4. Utilizzare una sterile Trephine trapano fresa (~ 2 mm di diametro) per forare un difetto di 5 mm di profondità dell'osso nel centro della funzione esposta anteriore del corpo vertebrale (Figura 2 H-I). 
	Nota: Esercitare una pressione minima di drill-through solo la corteccia ventrale e osso trabecular sottostante; evitare di forare attraverso la corteccia dorsale. Si noti che le vertebre dei ratti osteoporotiche sono molto fragili. Utilizzare un tampone di cotone per pulire il difetto ed applicare pressione per fermare l'emorragia, se presente.</li>
	<li>Ripetere il punto 2.11 sulla vertebra L5 per creare un totale di 2 difetti per ratto ( Figura 2J).</li>
	<li>Restituire l'intestino nella cavità addominale.</li>
	<li>Utilizzare una sutura chirurgica riassorbibile sintetica vicryl (3-0 vicryl undyed 27 &#34; SH cono) in un modello continuo per suturare l'aponeurosi ( Figura 2 K).</li>
	<li>Chiudere la pelle con una sutura non assorbibile di monofilo in nylon 4-0 in un semplice schema interrotto ( Figura 2 L).</li>
	<li>Applicare 100 µ l di adesivo topico della pelle sopra le suture di pelle e tra loro per assicurare la chiusura completa della pelle.</li>
	<li>Iniettare il ratto con ringer lattato tiepida (37 ° C) &#39; soluzione di s (1CC/100 g P.C., SQ) per prevenire la disidratazione e ipotermia.</li>
	<li>Iniettare il ratto con buprenorfina (0,5 mg/kg BW, SQ) prima della chirurgia e ogni 8-12 h per alleviare il dolore post-operatorio come necessario.</li>
	<li>Non lasciare incustodito l'animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Inoltre, non restituiscono un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.</li>
	<li>Dopo l'animale ha recuperato il termocuscino, restituirlo alla sua gabbia. 
	Nota: Casa ratti individualmente (cioè, in gabbie separate) per impedire la mutilazione di ratto a ratto delle suture e ferita.</li>
	<li>Posto chow imbevuto in acqua in una capsula Petri al piano di gabbia per postoperatorio pochi giorni aiutare i topi a raggiungere il cibo.</li>
	<li>Amministrare carprofen (5 mg/kg BW, SQ) post-operatorio di 24h per alleviare il dolore ogni 24 ore, se necessario.</li>
	<li>Rimuovere i punti di sutura della pelle mentre l'animale è inferiore al 2% isoflurane anestesia 10-14 giorni dopo l'intervento.</li>
</ol> 3. MicroCT scansione Nota: la sincronizzazione è 30-40 min per animale.
<ol><li>Il giorno successivo la procedura chirurgica, porre il ratto osteoporotico nella camera induzione collegata a una macchina di anestesia con un sistema centrale di scavenging. Indurre l'anestesia con isoflurano 5% in ossigeno 100% e mantenere via cono di naso a 2-3% isoflurane.</li>
	<li>Scan ratto utilizzando uno scanner µCT in vivo. Ripetere la scansione per l'analisi longitudinale di rigenerazione dell'osso. 
	Nota: Assicurarsi che tutti gli animali sono analizzati utilizzando le stesse impostazioni (cioè, energia a raggi x, scansione medio, l'intensità, voxel dimensioni e risoluzione dell'immagine) e in un similaorientamento di r. Ad esempio: energia dei raggi x, kVP 55; corrente, 145 µA; dimensione del voxel, 35 µm; incrementi, 115 µm; e tempo di integrazione, 200 ms; con gli esempi in PBS. Fare riferimento a Bouxtein et al. 34 per ulteriori spiegazioni e considerazioni coinvolti nel roditore µCT scansione per una valutazione della microstruttura dell'osso. Idealmente, la massima risoluzione di scansione disponibile sarebbe stata usata per tutte le scansioni; Tuttavia, scansioni ad alta risoluzione richiedono tempi più lunghi di acquisizione, generano grandi insiemi di dati ed espongono gli animali a più radiazione ionizzante. Quest'ultimo può introdurre effetti indesiderati, tra cui la guarigione della frattura in diminuzione. Pertanto, deve essere considerato attentamente il compromesso tra dati aggiuntivi e scansione tempo.</li>
</ol> 4. Vertebrale separazione Nota: la tempistica è 20-30 min per esempio.
<ol><li>Contorno della vertebra di interesse, come dimostrato in Figura 3A-I. Assicurati di includere tutte le parti della vertebra escludendo parti che appartengono a vertebre adiacenti.
	<ol><li>Fare clic su &#34; programma di valutazione µCT &#34; e selezionare il campione dal menu.</li>
		<li>Contorno ogni fetta con il mouse.</li>
		<li>Uso il &#34; Z &#34; barra per passare alla prossima sezione.</li>
	</ol></li> <li>Salvare la vertebra sagomata come un file separato ( Figura 3J -K) facendo clic sul &#34; File &#34; &#8594; &#34; salvare GOBJ &#34; ogni paio di fette.</li></ol>
 5. definizione dei VOI per valutazione quantitativa longitudinale Nota: I seguenti passaggi dipendono se la scansione è dal 1 ° giorno dopo la chirurgia (vertebra di riferimento) o dal momento successivo punti ( vertebre di destinazione).
<ol><li>Vertebra riferimento. 
	Nota: La sincronizzazione è 20-30 min per campione.
	<ol><li>Per Z-rotazione, misurare l'angolo dei margini utilizzando una XY-fetta al centro del difetto ( Figura 4A -B).
		<ol><li>Sul Z-aereo, andare nella zona della vertebra dove il difetto è più chiaro e schermo cattura la vertebra.</li>
			<li>In un software di presentazione, preparare un oggetto a forma di rettangolo che si adatta nel difetto.</li>
			<li>Ruotare l'immagine della vertebra, tale che il difetto sia rivolta verso l'alto e i margini del difetto sono paralleli ai lati del rettangolo.</li>
			<li>Misurare l'angolo di rotazione (tasto destro del mouse sull'immagine &#8594; &#34; formato immagine &#34; &#8594; &#34; Dimensione &#34;).</li>
			<li>Utilizzare l'angolo misurato per ruotare la vertebra ( Figura 4).
			<ol><li>Aprire una nuova finestra di DECterm (&#34; Session manager &#34; &#8594; &#34; applicazioni &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;).</li>
				<li>Eseguire &#34; ipl &#34;:</li>
				<li>Ipl &#62; turn3d</li>
				<li>-ingresso [in] &#62;</li>
				<li>-uscita [out] &#62;</li>
				<li>-turnaxis_angles [0.000 90,000 90.000] &#62; 90 90 0</li>
				<li>-turnangle [0.000] &#62; angolo misurato</li>
				<li>-img_interpol_option [1] &#62;</li></ol>
			</li></ol></li> <li>Per X-rotazione, misurare l'angolo dei margini utilizzando una YZ-fetta al centro del difetto ( Figura 4 -E). Utilizzare l'angolo misurato per ruotare la vertebra ( Figura 4F).
		<ol><li>Fare clic su &#34; YZ &#34; in &#34; programma di valutazione uCT &#34; e ripetere i passaggi 5.1.1.1-5.1.1.5.2.</li>
			<li>Ipl &#62; isq</li>
			<li>-aim_name [in] &#62;</li>
			<li>-isq_filename [default_file_name] &#62; inserire la directory del file ISQ (ad es., &#34; DK0: [MICROCT. DATI. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ &#34;)</li> <li>-pos [0 0 0] &#62;</li> <li>-dim [-1 -1-1] &#62;</li></ol></li> <li>Flip la vertebra ruotata modificando il piano XY al piano ZX.
		<ol><li>Aprire una nuova finestra di DECterm (&#34; Session manager &#34; &#8594; &#34; applicazioni &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;).</li>
			<li>Eseguire &#34; ipl &#34;:</li>
			<li>Ipl &#62; flip</li>
			<li>-ingresso [in] &#62; fuori</li>
			<li>-ingresso [out] &#62; out2</li>
			<li>-new_xydir [yz] &#62; zx</li></ol>
		</li> <li>Definire il VOI.
		<ol><li>Draw una circolare contorno del difetto utilizzando una fetta al centro del difetto selezionando l'icona contorno circolare in &#34; programma di valutazione uCT &#34; ( Figura 6A). Copia di contorno e incollarlo su tutte le fette nel difetto ( Figura 6B). 
			Nota: Dal momento che tutti i difetti sono stati creati utilizzando la stessa procedura, analizzare lo stesso numero di fette e, successivamente, il volume totale (TV) per tutti i campioni.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Vertebra target. 
	Nota: La sincronizzazione è 10-20 min per campione.
	<ol><li>Carico il DICOM file di destinazione e le vertebre di riferimento alla finestra principale del software di analisi immagine. 
		Nota: Per evitare modifiche del valore in scala di grigi, definire lo stesso output tipo di dati come i file DICOM originali nel menu carico.</li>
		<li>Registro al riferimento della vertebra.
		<ol><li>Lancio il &#34; 3D Voxel registrazione &#34; modulo e ingresso della vertebra di riferimento come il &#34; Base Volume &#34; e la vertebra di destinazione come il &#34; partita Volume. &#34; scegliere &#34; registro &#34; per registrare le vertebre ( Figura 5).</li>
		</ol></li> <li>Salvare i file registrati utilizzando gli stessi dati digitare e importarlo in un ambiente di µCT.</li>
		<li>Applicare il VOI.
		<ol><li>Applica la VOI definite per la vertebra di riferimento alla vertebra destinazione registrati cliccando &#34; programma di valutazione uCT &#34; &#8594; &#34; File &#34; &#8594; &#34; carico GOBJ &#34; e selezionando i GOBJ creato in precedenza. Verifica che i VOI e difetto sono concentrici.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 6. MicroCT analisi Nota: la tempistica è 10-20 min per esempio.
<ol><li>Invia il VOI per valutazione utilizzando un programma di valutazione µCT ( Figura 6). 
	Nota: Assicurarsi di utilizzare gli stessi parametri quando si analizzano tutte le VOIs. Assicurarsi che la soglia è impostata abbastanza alta per omettere il rumore di fondo con una perdita minima di osso. Se viene utilizzato un biomateriale radiopaco, un certo numero di strategie potrebbe essere utilizzato per analizzare la formazione dell'osso. Se c'è una differenza di densità fra il tessuto dell'osso e biomateriali, il biomateriale poteva essere segmentato fuori 35 , 36. In caso contrario, gli investigatori qualitativamente potrebbero valutare le differenze nella formazione dell'osso fra gruppi sperimentali.</li>
</ol> 7. L'eutanasia <ol><li>PPlace ratto osteoporotico nella camera di induzione attaccato ad una macchina di anestesia. Inducono anestesia con isoflurano 5% in ossigeno 100%.</li>
	<li>Mantenere l'anestesia tramite cono di naso ed eseguire l'eutanasia di pungere la cavità toracica per produrre un pneumotorace bilaterale 37.</li>
</ol>

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</ol>

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione al California Institute per la medicina rigenerativa (CIRM) (TR2-01780).

L'osteoporosi è la causa più prevalente delle fratture vertebrali da compressione causata da un aumento del carico sulla colonna vertebrale e che provocano il collasso del corpo vertebrale. Tuttavia, è praticamente impossibile generare una ferita in un roditore che autenticamente replica un simile crollo vertebrale. Invece, i ricercatori creano un vuoto cilindrico al centro del corpo vertebrale per imitare OVCFs16,17,18,</s...

Più di 200 milioni di persone nel mondo soffrono di osteoporosi1. Il sottostante patologica diminuzione nella densità minerale ossea (BMD) e microarchitettura ossea alterata aumentare la fragilità ossea e, di conseguenza, il rischio relativo di frattura2. L'osteoporosi è così prevalente e dannosa per la salute che l'OMS ha definito un problema importante di sanità pubblica. Inoltre, come la popolazione mondiale è previsto per età, l'osteoporosi è destinato a diventare ancora più comune.
Le fratture vertebrali osteoporotiche da compressione sono le più comuni fratture di fragilità, stimate a più di 750.000 all'anno negli Stati Uniti. Essi sono associati con la morbosità significativa e tanto come una mortalità più alta nove volte tasso3. Negli studi clinici, attualmente disponibili interventi chirurgici, come la vertebroplastica e Cifoplastica, sono stati trovati per non essere di più efficace di un finto trattamento4,5, lasciando solo gestione del dolore disponibile per questi pazienti. Poiché i trattamenti OVCF correnti sono limitati, è imperativo per sviluppare un modello animale che può replicare il disordine6,7,8. Tali modelli animali potrebbero facilitare sia l'indagine sui metodi di trattamento attuali e lo sviluppo di nuove terapie che si tradurranno in pratica clinica. L'osteoporosi è stata indotta e sostenuta in modelli animali attraverso la somministrazione di una dieta basso-calcio (LCD) in combinazione con l'ovariectomia1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. per modellare ulteriormente la perdita ossea associata OVCFs, difetti ossei vertebrali sono stati stabiliti in ratti immunocompetent osteoporotiche 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. In questo lavoro, viene presentato un modello di difetto vertebrale dei ratti immunocompromessi con osteoporosi modellato. Questo nuovo modello consente di valutare le terapie basate sulle cellule che coinvolge le cellule staminali derivate da varie fonti e specie per la riparazione delle fratture difficili, ad esempio OVCFs.
Formazione immagine dell'osso è una parte cruciale della valutazione delle fratture e malattie delle ossa. Metodi di imaging avanzati sono stati sviluppati per la valutazione accurata dei cambiamenti strutturali dell'osso e rigenerazione strategie25. Fra loro, formazione immagine di µCT è emerso come un metodo non invasivo, facile da usare e poco costoso che fornisce immagini 3D ad alta risoluzione. Formazione immagine µCT presenta parecchi vantaggi sopra altre modalità nella valutazione di pazienti con osteoporosi, in quanto offre 3D ad alta risoluzione dell'osso microarchitettura26 che possono poi essere analizzati quantitativamente. Quest'ultimo può quindi essere utilizzato per confrontare gli effetti terapeutici dei trattamenti proposti. In vivo imaging µCT infatti un gold standard per la rigenerazione di difetti vertebrali monitoraggio1,16,27. Tuttavia, alcune pubblicazioni28,29,30,31 sono impiegati strumenti di registrazione automatizzati per ridurre al minimo l'utente-dipendenza, bias di interpolazione ed errore di precisione di µCT analisi basata su formazione immagine. Recentemente, siamo stati i primi ad utilizzare una procedura di registrazione per migliorare l'analisi della rigenerazione ossea in un osso standardizzato sub, come spiegato in questo protocollo32 .
Il metodo qui descritto può essere utilizzato per studiare l'effetto delle terapie di cellula romanzo per OVCFs, unhindered dall'host di risposte a cellula T che potrebbero rifiutare le cellule allogeniche o xenogeniche. L'osteoporosi è indotto in ratti giovani attraverso l'ovariectomia (OVX) e 4 mesi di un LCD. La giovane età dei ratti OVX, combinato con il display LCD, ci ha permesso di raggiungere un basso picco di massa ossea, che imita l'osteoporosi postmenopausale conducendo alla perdita irreversibile dell'osso. Ciò può essere spiegato in parte dal fatto che, durante il display LCD e a circa 3 mesi di età, la transizione di ratti dall'osso modellazione al rimodellamento fase presso le vertebre lombari33, aumentando così la probabilità di mantenere l'osteoporosi nel tempo. Utilizzando animali giovani rende questo modello più conveniente, che costano meno. Tuttavia, è limitata intrinsecamente non tenendo conto i cambiamenti biologici all'animale di invecchiamento.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>BetadineSolution</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>4677</td><td></td></tr><tr><td>Clorexidina Gluconato 2% scrub</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>510083</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico 70%-quart</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>501044</td><td></td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>26357</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/mL</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>56163</td><td></td></tr><tr><td>Ratti nudi atimici atimatici ovariectomizzati</td><td>Harlan Laboratories, Indianapolis, IN</td><td>Hsd:RH-Foxn1 rnu</td><td></td></tr><tr><td>Cibo a basso contenuto di calcio</td><td>Newco Distributors, Inc., CA</td><td>1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies Corporation</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>Dermabond</td><td>J AND J ETHICON</td><td>DHVM12</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia</td><td>Patterson Scientific</td><td>TEC 3EX</td><td></td></tr><tr><td>Slide Top Induction Chambers</td><td>Patterson Scientific</td><td>78917833</td><td></td></tr><tr><td>ProStation Postazione di lavoro riscaldata</td><td>Patterson Scientific</td><td>78914731</td><td></td></tr><tr><td>Telo chirurgico</td><td>HALYARD HEALTH INC</td><td>89101</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di retrazione del fissatore magnetico</td><td>Fine Science Tools, Inc., CA</td><td>18200-50</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, 10 cm, curve, SS</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride, 11,5 cm, 45 gradi Strumenti di precisione ad angolo, seghettati, affilati/affilati</td><td>, pinze FL</td><td>503225</td><td></td></tr><tr><td>, n. 5</td><td>strumenti di precisione mondiali, FL</td><td>555048FT</td><td></td></tr><tr><td>Pinze emostatiche per zanzare micro</td><td>strumenti di precisione mondiali, FL</td><td>503360</td><td></td></tr><tr><td>Garza di cotone sterile</td><td>Medtronic, MINNEAPOLIS, MN</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>lance di assorbimento - montate/sterili</td><td>Fine Science Strumenti, CA</td><td>18105-01</td><td></td></tr><tr><td>Siringa, 1 ml Ago</td><td>TERUMO TERUMO MED</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>, 25 gauge</td><td>BD MED SYS INJECTION SYS</td><td></td><td></td></tr> 305127 <tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Baker</td><td>SterilGARD e3-Class II Tipo A2 Cabina</td><td></td>di</tr><tr><td>biosicurezza Unità di cauterizzazione termica</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>501292</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Drill OmniDrill115/230V</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Trephines per Micro Drill, diametro 2 mm</td><td>Fine Science Tools, CA</td><td>18004-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl non tinto 27" SH</td><td>cono J E J ETHICON</td><td>1663G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethilon nero 18" PC3 taglio convenzionale</td><td>J AND J ETHICON</td><td>1954G</td><td></td></tr><tr><td>Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40)</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>SCANCO Medical suite di sistemi microCT</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi</td><td>Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN</td><td>Analizza 12</td><td>Software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Unguento</td> <td>per gli occhi Veterenery</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

semiautomatica longitudinale basati su microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Fratture di compressione vertebrali correlate all'osteoporosi (OVCFs) sono un bisogno comune e clinicamente insoddisfatto con l'aumento di prevalenza come l'invecchiamento della popolazione mondiale. Modelli animali OVCF sono essenziali per lo sviluppo preclinico di strategie di ingegneria del tessuto traslazionale. Mentre attualmente esiste un numero di modelli, questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per indurre difetti vertebrali altamente riproducibili multipli in un singolo ratto nudo. Una tomografia microtomografia semiautomatica longitudinale romanzo (µCT)-analisi strutturale quantitativa basata dei difetti vertebrali è anche dettagliato. Brevemente, i ratti erano imaged presso più tempo punti post-op. La scansione di giorno 1 è stata riorientata per una posizione standard, e un volume standard di interesse è stato definito. Scansioni successive µCT di ogni ratto sono stati registrati automaticamente alla scansione giorno 1 quindi lo stesso volume di interesse è stata poi analizzato per valutare per la formazione di nuovo osso. Questo approccio versatile può essere adattato ad una varietà di altri modelli dove analisi basate su formazione immagine longitudinale potrebbero beneficiare di preciso allineamento 3D semiautomatica. Presi insieme, questo protocollo descrive un sistema facilmente quantificabile e facilmente riproducibile per osteoporosi e ricerca. Il protocollo suggerito dura 4 mesi per indurre osteoporosi in ratti ovariectomizzati nudi e tra 2,7 e 4 h di generare, immagine e analizzare due difetti vertebrali, a seconda della dimensione del tessuto e attrezzature.

Usando questo protocollo, è possibile immagine e quantificare la rigenerazione di n = 8 difetti vertebrali osteoporotici modellati attraverso diversi momenti. La corrispondenza anatomica ottenuta mediante la procedura di registrazione permette l'analisi dei VOI stessi tutti gli intervalli di tempo. Questo provoca un'analisi istomorfometriche 3D longitudinale altamente accurato, anche quando i margini del difetto originale non sono più riconoscibili. Abbiamo usato i cinque punti di tempo (...

L'obiettivo del presente protocollo è quello di generare un modello di frattura di compressione vertebrale correlate all'osteoporosi del ratto nudo che possa essere valutati longitudinalmente in vivo utilizzando una semiautomatica microtomografia basati su tomografia quantitativa analisi strutturale.

Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

L'obiettivo generale di questo modello chirurgico e del metodo di analisi dell'immagine è osservare l'effetto del trattamento su un modello preclinico di frattura da compressione vertebrale correlata all'osteoporosi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in questo campo della medicina rigenerativa gliale, come ad esempio quale potrebbe essere un trattamento efficace per le fratture da compressione vertebrale correlate all'osteoporosi e in che modo un tale trattamento potrebbe favorire la rigenerazione ossea. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza ratti nudi, consentendo di testare trattamenti innovativi in vivo senza preoccupazioni legate al rigetto immunitario.Inoltre, la rigenerazione ossea alla base di questo metodo qui presentato è semiautomatica, risultando quindi più accurata e meno dipendente dall'operatore rispetto ai metodi pubblicati in precedenza. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Wafa Tawackoli, scienziata ricercatrice del nostro laboratorio. Indurre prima l'anestesia in un ratto osteoporotico utilizzando isoflurano al 5% in ossigeno al 100%, quindi trasferire a un cono nasale con isoflurano al 2-3% per il mantenimento.Rasare la zona addominale utilizzando un rasoio elettrico. Pulire con un antisettico a base di iodio contenente clorhexidina gluconato allo 0,5%, seguito da etanolo al 70%. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.Applicare uno stimolo di pizzicamento alle dita dei piedi per verificare un adeguato livello di anestesia. Se non si osserva alcuna risposta, iniziare la procedura. Posizionare il ratto anestetizzato in decubito dorsale su un tappetino riscaldante impostato a 37 gradi Celsius e distendere gli arti utilizzando un sistema di retrazione con fissatore magnetico.Somministrare al ratto una iniezione sottocutanea di carprofene prima di iniziare la procedura chirurgica. Dopo aver praticato un'incisione di cinque a otto centimetri a livello della cute, a partire da un centimetro al di sotto del processo xifode e lungo la linea mediana, utilizzare le forbici chirurgiche per incisionare l'aponeurosi attraverso la linea alba al fine di accedere alla cavità addominale. Esporre la cavità addominale utilizzando dei retrattori.Devia le intestini verso destra nel ratto per esporre l'aorta addominale e il rene sinistro. Per evitare la disidratazione, utilizza garze sterili inumidite per avvolgere gli organi interni. Usa ulteriori retrattori secondo necessità per esporre l'aorta.Palpare la colonna lombare, quindi procedere a esporla. Utilizzare la termocauterizzazione per esporre l'aspetto anteriore dei corpi vertebrali lombari da L4 a L5 e isolarli dal tessuto connettivo e dai muscoli circostanti. Utilizzare un bastoncino di cotone per rimuovere sangue e tessuto residuo dalla vertebra L4.Successivamente, utilizzare un trapano sterile con punta da due centimetri di diametro per creare un difetto osseo profondo cinque millimetri al centro della faccia anteriore esposta del corpo vertebrale. Applicare una pressione minima per trapanare soltanto la corticale ventrale e l'osso trabecolare sottostante. Evitare di trapanare attraverso la corticale dorsale.Quindi praticare il trapanamento delle vertebre L5 nello stesso modo, creando due difetti per ratto. Al termine del trapanamento, riposizionare l'intestino nella cavità addominale e rimuovere i retrattori. Successivamente, utilizzare un punto di sutura chirurgico sintetico riassorbibile in vicryl in un modello continuo per suturare l'aponeurosi.Chiudere la cute utilizzando un punto singolo interrotto con filo di nylon monofilamento non riassorbibile 4-0. Applicare quindi 100 microlitri di adesivo topico per la cute sopra e tra i punti di sutura per garantire la chiusura completa della cute. Dopo aver iniettato nel ratto soluzione di Ringer lattato a 37 gradi Celsius per prevenire l'ipotermia e la disidratazione e buprenorfina per il sollievo dal dolore post-operatorio, lasciare l'animale riprendere dallo stato di anestesia su un tappetino riscaldante.Il giorno successivo all'intervento chirurgico, indurre l'anestesia con isoflurano come in precedenza. Scansionare il ratto utilizzando un microscopio a tomografia computerizzata in vivo. Dopo la scansione e il risveglio dall'anestesia, restituire il ratto alla gabbia di alloggio.Per separare i dati delle vertebre per l'analisi, fare clic sul programma di valutazione micro-TC e selezionare il campione dal menu. Quindi utilizzare il mouse per delineare singole vertebre su una sezione. Utilizzare la barra Z per passare alla sezione successiva e delineare le singole vertebre nello stesso modo.Salvare la vertebra delineata come file separato facendo clic su file, salvare GOBJ ogni paio di sezioni. Successivamente, dopo aver impostato la vertebra di riferimento, importarla in un ambiente micro-CT. Applicare il VOI definito per la vertebra di riferimento alla vertebra target registrata facendo clic sul programma di valutazione micro-CT, file, caricare GOBJ e selezionando il file GOBJ precedentemente creato.Infine, inviare il VOI per la valutazione utilizzando un programma di valutazione micro-TC. Questa immagine 3D frontale mostra un'immagine rappresentativa di un difetto vertebrale un giorno dopo la creazione del difetto. La formazione ossea nel vuoto è indicata in rosso.Questa è un'immagine 2D sagittale della stessa area e, infine, un'immagine 2D assiale. Come si osserva qui, la formazione ossea avviene nel tempo ed è rilevata mediante imaging longitudinale. La densità del volume osseo e la densità apparente sono state calcolate e confrontate utilizzando un'ANOVA a due vie con misure ripetute e correzione di Bonferroni per confronti multipli.Come mostrato qui, la densità del volume osseo e la densità apparente aumentano significativamente a partire da due settimane dopo la creazione del difetto vertebrale. A seguito di questa procedura, altri metodi come l'istologia e l'immunohistochimica possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali cellule sono presenti e quali proteine vengono espresse nel difetto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare multipli difetti vertebrali in ratti nudi e analizzare la rigenerazione ossea nel tempo all'interno di questi difetti.

semiautomated-longitudinal-microcomputed-tomography-based

Research

Ricerca

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Bioengineering

Bioingegneria

Un esame longitudinale di perdita ossea nel femore e la tibia di topi adulti è stata eseguita dopo un trauma al midollo spinale con sequenziale a basso dosaggio di raggi X scansioni. Perdita di massa ossea della tibia è stato rilevato nel corso dello studio, mentre la perdita ossea nel femore non è stata rilevata fino a 40 messaggi lesioni giorni.

La valutazione longitudinale di perdita dell&#39;arto posteriore ossea del mouse dopo la lesione del midollo spinale tramite Novel, In vivo, Metodologia

Questa carta indica agli utenti di in vivo scanner micro-tomografia (µCT) come anestetizzare, posizionare correttamente e trattenere l'arto posteriore di un topo per un movimento minimo durante imaging ad alta risoluzione della tibia. Il risultato è immagini di alta qualità che possono essere elaborate per quantificare con precisione micro-architettura dell'osso.

Corretto posizionamento e trattenuta di un ratto dell'arto per l'Imaging mirato ad alta risoluzione dell'osso utilizzando Micro-architettura In Vivo Micro-tomografia computerizzata

Vi presentiamo un flusso di lavoro per segmentare e quantificare le ossa trabecular per immagini 2D e 3D basate sul contorno esterno di osso utilizzando un plugin di ImageJ. Questo approccio è più efficiente e preciso rispetto l'attuale approccio manuale mano-contornatura e fornisce a strati quantificazioni, che non sono disponibili nel software commerciale corrente.

Contorno esterno assistita segmentazione e quantificazione delle ossa Trabecular da un Plugin di Imagej

La microtomografia computerizzata (μCT) è uno strumento di imaging non distruttivo che è fondamentale per valutare la struttura ossea negli studi preclinici, tuttavia c'è una mancanza di consenso sulle procedure μCT per l'analisi del callo di guarigione ossea. Questo studio fornisce un protocollo μCT passo-passo che consente il monitoraggio della guarigione delle fratture.

Valutazione della guarigione delle fratture ossee mediante tomografia microcomputerizzata

Questo protocollo presenta un metodo economico ed efficiente per la valutazione quantitativa della microarchitettura ossea in un modello murino di osteoporosi combinando tecniche di colorazione ematossilina-eosina (HE) e micro-tomografia computerizzata (Micro-CT).

Valutazione della microarchitettura dell'osso trabecolare in un modello murino di osteoporosi

Il protocollo mostra la costruzione di un modello di allenamento con carico nel ratto semplice ed economico per l'osteonecrosi indotta da steroidi della testa del femore utilizzando un nastro terapeutico elastico.

Modello portante senza tensione dell'osteonecrosi indotta da steroidi della testa del femore nei ratti

Questo protocollo utilizza la micro-tomografia computerizzata per consentire la quantificazione economica della massa magra, compresi il muscolo scheletrico e il tessuto viscerale, il tessuto adiposo e il tessuto scheletrico nei piccoli animali. Distingue tra tessuto magro e adiposo, il che offre vantaggi significativi per la ricerca biomedica, in particolare nella ricerca traslazionale nei piccoli animali.

Quantificazione non invasiva del muscolo scheletrico in piccoli animali mediante microtomografia computerizzata

Presentiamo un metodo per analizzare una regione di interesse (ROI) definita dall'utente in un modello longitudinale in vivo di difetto radiale di ratto. Questo metodo consente l'analisi comparativa tra diversi scaffold precedentemente limitati da variazioni nel campo visivo della scansione con tomografia microcomputerizzata (μCT), nell'orientamento del campione e nella presenza basale di scaffold.

Analisi delle immagini con tomografia computerizzata longitudinale per regioni di interesse definite dall'utente in difetti ossei di dimensioni critiche

Proponiamo un protocollo per valutare la rigenerazione ossea a vari livelli gerarchici. Questo approccio multimodale consente un'analisi strutturale su diverse scale di lunghezza, affrontando efficacemente le sfide nella preparazione del campione. Fornisce inoltre un flusso di lavoro affidabile per valutare l'efficacia dei biomateriali nel promuovere la rigenerazione ossea.

Approccio multimodale per valutare la rigenerazione ossea e le prestazioni dell'impalcatura

Microdisegni adesivo che normalizzano architettura cellulare può essere utilizzato per aumentare la sensibilità nella rilevazione degli effetti dei farmaci, migliorare la riproducibilità e semplificare l'acquisizione automatica delle immagini e analisi. Tale tecnologia andrà a beneficio della droga / siRNA test di screening, eseguite su supporti convenzionali coltura cellulare e quindi soffrono di un eccessivo cellula-cellula variabilità.

Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

Scopri un metodo semiautomatizzato di micro-tomografia computerizzata per analizzare fratture vertebrali da osteoporosi nel ratto nudo. Questa tecnica permette di valutare in vivo la rigenerazione ossea e testare nuovi trattamenti.

Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con losteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo (Video) | JoVE Journal

Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo

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