Un metodo di analisi cellulare per condilo mandibolare murino e morfometrica

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare gli effetti del carico compressivo nella cartilagine condilare mandibolare dei topi utilizzando misurazioni morfometriche in radiografie e analisi istologiche. Queste metriche possono aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti i cambiamenti strutturali e cellulari all'interno del condilo mandibolare dei roditori. Il vantaggio principale della tecnica qui mostrata è che potrebbero essere utilizzate per analizzare altri piccoli animali nati o partecipati.

Per questo protocollo, avere mandibole di topo isolate e sezionate pronte per l'uso. Su una capsula di Petri, trasferire le mandibole in un sistema di cabine radiografiche. Quindi, eseguire radiografie a 26 kilovolt per cinque secondi.

Ora, apri le immagini nel software di analisi per effettuare misurazioni morfometriche. Innanzitutto, utilizzare il pulsante dell'unità per impostare la barra della scala. Quindi, selezionare sei punti anatomici utilizzando lo stile del pennarello 2.

Innanzitutto, seleziona i punti più posteriori del condilo mandibolare come punto uno. Quindi, seleziona il processo incisivo per il punto due. Quindi, selezionare il punto più profondo in corrispondenza della tacca sigmoidea per il punto tre.

Quindi, selezionare il punto più profondo nella concavità del ramo mandibolare, il punto quattro e quindi selezionare il punto più anteriore della superficie articolare condilare, il punto cinque. Ora, seleziona il punto più posteriore della superficie articolare condilare come punto sei e procedi con l'esecuzione delle misurazioni della lunghezza utilizzando lo strumento della lunghezza. Quindi, utilizzare lo strumento linea perpendicolare dai punti tre a quattro per misurare la lunghezza della testa del condilo, che è la lunghezza della perpendicolare, dal punto uno alla linea tra i punti tre e quattro.

Quindi, misurare la lunghezza mandibolare, tra i punti uno e due. Infine, misura la larghezza della testa del condilo, che è compresa tra i punti cinque e sei. Per salvare i dati, copiare l'elenco delle misurazioni sul lato destro dello schermo.

Prima di incorporare le mandibole fisse, ma non decalcificate, immergerle per una notte nel saccarosio al 30% in PBS. Il giorno successivo, sezionare i tessuti molli in eccesso e tagliare con cura il condilo mandibolare. Ora, posiziona i campioni in stampi di plastica, con la superficie mediale del condilo contro la base dello stampo e il campione parallelo al fondo dello stampo.

Quindi, immergili nella resina da incasso e raffredda la resina con un pezzo di ghiaccio secco. Quindi, completare gli stampi con altra resina da incasso. Trasferitele in due metilbutano freddo, raffreddate in freezer o con ghiaccio secco.

Una volta raffreddati, conservare i campioni a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius o a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per il sezionamento. Per quantificare l'espressione di Col10a1 nella MCC delle sezioni sagittali dei condili, aprire le immagini istologiche in un pacchetto software di analisi delle immagini e selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento lazo. In questo caso, viene selezionata la regione MCC.

Prendi nota del numero di pixel nell'area, che è riportato nella casella dell'istogramma. Quindi, seleziona i pixel rossi Col10a1 regolando la gamma di colori. Utilizzare lo strumento contagocce per selezionare un pixel rosso dall'immagine e fare clic su OK. Quindi, registra il numero di pixel rossi nell'area, come riportato nella casella dell'istogramma.

La frazione di pixel rossi nell'area rappresenta la quantità di espressione Col10a1. Ora, utilizzando la stessa tecnica di base, quantifica l'attività di TRAP nell'MCC e nell'osso subcondrale. Innanzitutto, seleziona la cartilagine nelle regioni ossee subcondrali come aree da analizzare e prendi nota dei pixel totali.

Quindi, selezionare i pixel gialli generati dal substrato ELF97. Prendi nota del numero di pixel positivi e calcola la frazione di pixel positivi TRAP. Ora, quantifica le cellule EDU positive che vengono controcolorate in blu da DEPI.

Ancora una volta, seleziona l'area di interesse e quindi quantifica i pixel blu al suo interno. Utilizzare questo metodo anche per determinare il numero di pixel positivi EDU nella stessa regione. Le misurazioni morfometriche dei topi, sottoposti a carico compressivo dell'ATM, hanno mostrato che il carico aumentava significativamente la lunghezza della testa della mandibola e del condilo.

Tuttavia, il carico non ha comportato un cambiamento significativo nella larghezza del condilo. La quantificazione della distribuzione del collagene ha rivelato un aumento significativo dell'espressione di Col10a1 e dell'MCC dei condili degli animali caricati. D'altra parte, l'espressione di Col2a1 non era molto diversa dal controllo.

L'attività di TRAP è aumentata nella regione subcondrale dei condili e dei topi carichi, così come la subproliferazione. La colorazione EDU denota il numero di cellule proliferative. La distribuzione dei proteoglicani nel MCC è stata quantificata valutando l'area colorata di blu di toluidina e la mappa delle distanze.

C'è stato un aumento significativo della mappatura della distanza nel MCC dei condili del gruppo caricato. Tuttavia, l'area colorata con proteoglicani non era statisticamente diversa tra i gruppi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare i cambiamenti cellulari e strutturali nel condilo mandibolare dei roditori.