Un metodo di analisi cellulare per condilo mandibolare murino e morfometrica

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare gli effetti del carico compressivo nella cartilagine condilare mandibolare di topi, utilizzando misurazioni morfometriche su radiografie e analisi istologica. Queste metriche possono contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo i cambiamenti strutturali e cellulari all'interno del condilo mandibolare nei roditori. Il principale vantaggio della tecnica qui mostrata è che può essere utilizzata per analizzare altri animali di piccole dimensioni, neonati o partecipanti.

Per questo protocollo, avere pronti per l'uso mandibole di topo isolate e dissezionate. In una piastra di Petri, trasferire le mandibole in un sistema a raggi X. Successivamente, acquisire radiografie a 26 kilovolts per cinque secondi.

Ora, aprire le immagini nel software di analisi per effettuare misurazioni morfometriche. Per prima cosa, utilizzare il pulsante dell'unità per impostare la barra di scala. Successivamente, selezionare sei punti anatomici utilizzando lo stile di marcatura 2.

Per prima cosa, selezionare i punti più posteriori del condilo mandibolare come punto uno. Successivamente, selezionare il processo incisivo come punto due. Quindi, selezionare il punto più profondo della scissura sigmoidea come punto tre.

Successivamente, selezionare il punto più profondo della concavità del ramo mandibolare, punto quattro, quindi selezionare il punto più anteriore della superficie articolare condilare, punto cinque. Ora, selezionare il punto più posteriore della superficie articolare condilare come punto sei e procedere effettuando le misurazioni della lunghezza utilizzando lo strumento di misura della lunghezza. Successivamente, utilizzare lo strumento della linea perpendicolare dal punto tre al punto quattro per misurare la lunghezza della testa del condilo, ovvero la lunghezza della perpendicolare dal punto uno alla linea tra i punti tre e quattro.

Quindi, misurare la lunghezza mandibolare tra i punti uno e due. Infine, misurare la larghezza della testa del condilo, che si trova tra i punti cinque e sei. Per salvare i dati, copiare l'elenco delle misurazioni situato sul lato destro dello schermo.

Prima di includere le mandibole fissate, ma non decalcificate, immergerle per tutta la notte in una soluzione di saccarosio al 30 percento in PBS. Il giorno successivo, asportare con dissezione qualsiasi tessuto molle in eccesso e tagliare con cura il condilo mandibolare. A questo punto, posizionare i campioni in stampi di plastica, con la superficie mediale del condilo a contatto con la base dello stampo e il campione parallelo al fondo dello stampo.

Successivamente, immergerli nella resina inclusa e raffreddare la resina con un pezzo di ghiaccio secco. Poi, completare il riempimento degli stampi con altra resina inclusa. Trasferirli in due metilbutano freddo, raffreddato con congelatore o con ghiaccio secco.

Dopo averli raffreddati, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius o a meno 80 gradi Celsius per la sezionatura. Per quantificare l'espressione di Col10a1 nella MCC di sezioni sagittali dei condili, aprire le immagini istologiche in un software di analisi dell'immagine e selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento lazo. In questo caso, viene selezionata la regione MCC.

Prendere nota del numero di pixel nell'area, riportato nella finestra dell'istogramma. Successivamente, selezionare i pixel rossi di Col10a1 regolando l'intervallo di colore. Utilizzare lo strumento contagocce per selezionare un pixel rosso dall'immagine e fare clic su OK. Quindi, registrare il numero di pixel rossi nell'area, come riportato nella finestra dell'istogramma.

La frazione di pixel rossi nell'area rappresenta la quantità di espressione di Col10a1. Ora, utilizzando la stessa tecnica di base, quantificare l'attività TRAP nella MCC e nell'osso subcondrale. Per prima cosa, selezionare la cartilagine nelle regioni dell'osso subcondrale come aree da analizzare e annotare il numero totale di pixel.

Quindi, selezionare i pixel gialli generati dal substrato ELF97. Prendere nota del numero di pixel positivi e calcolare la frazione di pixel positivi per TRAP. Ora, quantificare le cellule positive per EDU che sono controstainate in blu da DEPI.

Anche in questo caso, selezionare l'area di interesse e quindi quantificare i pixel blu all'interno di essa. Utilizzare anche questo metodo per determinare il numero di pixel positivi per EDU nella stessa regione. Le misurazioni morfometriche effettuate sui topi sottoposti a carico compressivo dell'ATM hanno mostrato che il carico aumentava in modo significativo la lunghezza della mandibola e della testa della condiloide.

Tuttavia, il carico non ha determinato un cambiamento significativo nella larghezza del condilo. La quantificazione della distribuzione del collagene ha rivelato un aumento significativo dell'espressione di Col10a1 e della MCC dei condili negli animali sottoposti a carico. D'altro canto, l'espressione di Col2a1 non differiva molto dal controllo.

L'attività TRAP è aumentata nella regione sottocartilaginea dei condili e nei topi sottoposti a carico, così come la proliferazione subcondrale. La colorazione EDU indica il numero di cellule proliferative. La distribuzione dei proteoglicani nel condilo mandibolare è stata quantificata valutando l'area colorata con blu di toluidina e la mappa delle distanze.

È stato osservato un aumento significativo della mappatura della distanza nella MCC dei condili del gruppo sottoposto a carico. Tuttavia, l'area colorata per i proteoglicani non ha mostrato differenze statisticamente significative tra i gruppi. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare i cambiamenti cellulari e strutturali nel condilo mandibolare dei roditori.