Name: Un metodo di analisi cellulare per condilo mandibolare murino e morfometrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Scopri l'analisi cellulare e morfometrica del condilo mandibolare murino per studiare gli effetti del carico compressivo sulla cartilagine. Questo metodo combina radiografia e istologia per valutare i cambiamenti strutturali.

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Gli autori vorrei ringraziare il Dr. David Rowe per gentilmente fornire i topi transgenici e Li Chen per l'assistenza istologico.
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental & Craniofacial Research del National Institutes of Health, sotto Premio numero K08DE025914 e dalla associazione americana di Fondazione ortodontico per Sumit Yadav.

<ol><li>LeResche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Temporomandibular+Disorders%3A+Implications+for+the+Investigation+of+Etiologic+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+functional+loading+causes+differential+effects+in+the+subchondral+bone+and+condylar+cartilage+in+the+temporomandibular+joint+from+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice.</a> Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).</li>
<li>Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+decreased+loading+on+the+metabolic+activity+of+the+mandibular+condylar+cartilage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Orthod%22%5BJournal%5D)">Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat.</a> Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).</li>
<li>Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+temporomandibular+joint+changes+in+Twin+Block+and+Bionator+appliance+therapy%3A+a+magnetic+resonance+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Orthod%22%5BJournal%5D)">Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study.</a> Prog Orthod. 15 (57), (2014).</li>
<li>Dutra, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Matrix+Response+of+the+Mandibular+Condylar+Cartilage+to+Botulinum+Toxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin.</a> PLoS ONE. 11 (10), 0164599(2016).</li>
<li>Benjamin, M., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+fibrocartilage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Biology of fibrocartilage cells.</a> Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).</li>
<li>Shen, G., Darendeliler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adaptive+Remodeling+of+Condylar+Cartilage-+A+Transition+from+Chondrogenesis+to+Osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis.</a> J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Altered+Loading+on+Mandibular+Condylar+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0160121(2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+Multi-Image+Cryohistology+of+Mineralized+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues.</a> J Vis Exp. , e54468(2016).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
<li>Hayman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+%28TRAP%29+and+the+osteoclast%2Fimmune+cell+dichotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy.</a> Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Questo manoscritto descritto metodi per la misurazione di morfometrica e analisi cellulare del murini condili mandibolari e mandibole. Le misure morfometriche radiografica è utilizzabile anche per analizzare altre ossa da piccoli animali da esperimento. Inoltre, l'analisi cellulare (cellule quantificazione e mappatura di distanza di cartilagine) non sono limitati al condilo mandibola roditore, ma può essere utilizzato per quantificare le sezioni istologiche di numerosi tessuti.
Modelli di topi...

TMJ è un unico giunto portante che si trova nella regione craniofacial ed è costituito di fibrocartilagine. Il MCC del TMJ è essenziale per la funzione articolare, compreso movimento della mascella senza ostacoli mentre parlando e masticare, ma esso è influenzato dalle malattie degeneranti, compreso l'osteoartrite1. L'ATM ha la capacità di adattarsi a stimoli esterni e le alterazioni di carico, portando a cambiamenti strutturali e cellulari ai componenti del MCC2,3,4,5. Le proprietà portanti di MCC possono essere spiegate dalle interazioni tra i suoi costituenti, compresa l'acqua, la rete di collagene e densamente proteoglicani. Il MCC ha quattro distinte zone cellulari che esprimono diversi tipi di proteine di collagene e non-collagene: 1) l'area superficiale o articolare; 2) la zona proliferativa, composta di cellule mesenchimali indifferenziate e che risponde al carico di richieste; 3) la zona di prehypertrophic, composto da condrociti maturi esprimendo il collagene di tipo 2; e 4) l'ipertrofica di zona, la regione dove i condrociti ipertrofici esprimendo collagene tipo 10 die e sottoposti a calcificazione. La regione non mineralizzato è ricca di proteoglicani che offrono resistenza alle forze di compressione6.
C'è la mineralizzazione continua alla zona ipertrofica del MCC, dove si verifica la transizione da Condrogenesi ad osteogenesi, garantendo la robusta struttura minerale dell'osso subcondrale del condilo mandibolare7. Cambiamenti cellulari nelle regioni unmineralized e mineralizzate in ultima analisi, portano a cambiamenti morfologici e strutturali nel condilo mandibolare e mandibola. Mantenimento dell'omeostasi cellulare tutte le regioni di MCC e la mineralizzazione della porzione subchondral sono essenziali per la salute, capacità di carico e l'integrità dell'ATM.
Il modello di topo transgenico collagene multipli (come descritto da Utreja et al.) 8 è un ottimo strumento da utilizzare per comprendere i cambiamenti nell'espressione di collagene poiché tutti i transgeni sono espressi in MCC. Per un'approfondita valutazione istologica, macchie istologiche sono utilizzate per studiare la deposizione di matrice, mineralizzazione, proliferazione delle cellule e apoptosi, come pure l'espressione della proteina presso gli strati differenti delle cellule del MCC.
In questo manoscritto, istologico e le analisi morfometriche vengono utilizzate per valutare i cambiamenti strutturali e cellulari nell'osso MCC e subcondrale del condilo mandibola di topi. Inoltre, un metodo di quantificazione delle cellule, per analizzare le immagini istologiche fluorescente e per il mapping di vetrini da microscopio chiaro, è descritto. Compressione statica TMJ caricamento metodo che causa cambiamenti cellulari e morfologiche al MCC e subchondral dell'osso9, è illustrata anche per convalidare i nostri metodi.
I metodi descritti qui possono essere utilizzati per determinare morfometriche e cambiamenti istologici nel condilo mandibolare e mandibola di roditori o di analizzare altre regioni di ossificazione endochondral e la morfologia dei tessuti mineralizzati aggiuntive.

<table><tbody><tr><td>Sistema di radiografia MX20</td><td>Faxitron X-Ray LLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di immagine Digimizer&nbsp;</td><td>MedCalc Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryomatrix resina per inclusione</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio manuale Axio Imager Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>208562</td><td></td></tr><tr><td>filtro proteico fluorescente giallo - EYFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>filtro proteico fluorescente ciano - ECFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>filtro proteico fluorescente rosso - Cy5</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>acetato di sodio anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>sodio L-tartrato bibasico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>nitrito di sodio&nbsp;</td><td>Substrato Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ELF97</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E6600</td><td></td></tr><tr><td>ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10339&nbsp;</td><td>include EdU (5-etinil-2'-deossiuridina)&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Blu di toluidina O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Systems Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compresse saline tamponate con fosfato (PBS)</td><td>Research Products International</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>CNA Beta III Archwire Ortho</td><td>Organizers, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp;</td><td>Software GraphPad, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di analisi cellulare per condilo mandibolare murino e morfometrica

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

Il giunto temporomandibular (TMJ) ha la capacità di adattarsi agli stimoli esterni, e cambiamenti di carico possa influenzare la posizione dei condili, così come i componenti strutturali e cellulari della cartilagine del condilo mandibola (MCC). Questo manoscritto descrive metodi per l'analisi di questi cambiamenti e un metodo per alterare il caricamento dell'ATM in topi (cioè, alla compressione statica TMJ caricamento). La valutazione strutturale qui illustrata è un approccio semplice morfometriche che utilizza il software Digimizer e viene eseguito nelle radiografie di piccole ossa. Inoltre, l'analisi del cellulare cambia leader alle alterazioni nell'espressione del collagene, rimodellamento osseo, divisione cellulare, e distribuzione di proteoglycan in MCC è descritto. La quantificazione di questi cambiamenti nelle sezioni istologiche - contando i pixel fluorescenti positivi utilizzando software e il mapping di distanza di misurazione di immagine e zona macchiata con Digimizer - è dimostrato anche. I metodi qui illustrati non sono limitati a TMJ murino, ma ha potuto essere usati su altre ossa di piccoli animali da esperimento e in altre regioni di ossificazione endochondral.

Statistiche descrittive sono state effettuate per esaminare la distribuzione delle misure morfometriche (lunghezza mandibular, condylar lunghezza, larghezza condylar) e le analisi istologiche. I risultati sono stati confrontati fra il gruppo caricato (cioè, i topi sottoposti a carico di compressione con la molla in titanio beta) e il gruppo di controllo (cioè, i topi di controllo che non hanno ricevuto alcuna procedura di corrispondenza). Differenze statisticamente signi...

Questo manoscritto presenta metodi per l'analisi morfometrica e cambiamenti cellulari all'interno del condilo mandibolare di roditori.

Un metodo di analisi cellulare per condilo mandibolare murino e morfometrica

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare gli effetti del carico compressivo nella cartilagine condilare mandibolare di topi, utilizzando misurazioni morfometriche su radiografie e analisi istologica. Queste metriche possono contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo i cambiamenti strutturali e cellulari all'interno del condilo mandibolare nei roditori. Il principale vantaggio della tecnica qui mostrata è che può essere utilizzata per analizzare altri animali di piccole dimensioni, neonati o partecipanti.Per questo protocollo, avere pronti per l'uso mandibole di topo isolate e dissezionate. In una piastra di Petri, trasferire le mandibole in un sistema a raggi X. Successivamente, acquisire radiografie a 26 kilovolts per cinque secondi.Ora, aprire le immagini nel software di analisi per effettuare misurazioni morfometriche. Per prima cosa, utilizzare il pulsante dell'unità per impostare la barra di scala. Successivamente, selezionare sei punti anatomici utilizzando lo stile di marcatura 2.Per prima cosa, selezionare i punti più posteriori del condilo mandibolare come punto uno. Successivamente, selezionare il processo incisivo come punto due. Quindi, selezionare il punto più profondo della scissura sigmoidea come punto tre.Successivamente, selezionare il punto più profondo della concavità del ramo mandibolare, punto quattro, quindi selezionare il punto più anteriore della superficie articolare condilare, punto cinque. Ora, selezionare il punto più posteriore della superficie articolare condilare come punto sei e procedere effettuando le misurazioni della lunghezza utilizzando lo strumento di misura della lunghezza. Successivamente, utilizzare lo strumento della linea perpendicolare dal punto tre al punto quattro per misurare la lunghezza della testa del condilo, ovvero la lunghezza della perpendicolare dal punto uno alla linea tra i punti tre e quattro.Quindi, misurare la lunghezza mandibolare tra i punti uno e due. Infine, misurare la larghezza della testa del condilo, che si trova tra i punti cinque e sei. Per salvare i dati, copiare l'elenco delle misurazioni situato sul lato destro dello schermo.Prima di includere le mandibole fissate, ma non decalcificate, immergerle per tutta la notte in una soluzione di saccarosio al 30 percento in PBS. Il giorno successivo, asportare con dissezione qualsiasi tessuto molle in eccesso e tagliare con cura il condilo mandibolare. A questo punto, posizionare i campioni in stampi di plastica, con la superficie mediale del condilo a contatto con la base dello stampo e il campione parallelo al fondo dello stampo.Successivamente, immergerli nella resina inclusa e raffreddare la resina con un pezzo di ghiaccio secco. Poi, completare il riempimento degli stampi con altra resina inclusa. Trasferirli in due metilbutano freddo, raffreddato con congelatore o con ghiaccio secco.Dopo averli raffreddati, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius o a meno 80 gradi Celsius per la sezionatura. Per quantificare l'espressione di Col10a1 nella MCC di sezioni sagittali dei condili, aprire le immagini istologiche in un software di analisi dell'immagine e selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento lazo. In questo caso, viene selezionata la regione MCC.Prendere nota del numero di pixel nell'area, riportato nella finestra dell'istogramma. Successivamente, selezionare i pixel rossi di Col10a1 regolando l'intervallo di colore. Utilizzare lo strumento contagocce per selezionare un pixel rosso dall'immagine e fare clic su OK. Quindi, registrare il numero di pixel rossi nell'area, come riportato nella finestra dell'istogramma.La frazione di pixel rossi nell'area rappresenta la quantità di espressione di Col10a1. Ora, utilizzando la stessa tecnica di base, quantificare l'attività TRAP nella MCC e nell'osso subcondrale. Per prima cosa, selezionare la cartilagine nelle regioni dell'osso subcondrale come aree da analizzare e annotare il numero totale di pixel.Quindi, selezionare i pixel gialli generati dal substrato ELF97. Prendere nota del numero di pixel positivi e calcolare la frazione di pixel positivi per TRAP. Ora, quantificare le cellule positive per EDU che sono controstainate in blu da DEPI.Anche in questo caso, selezionare l'area di interesse e quindi quantificare i pixel blu all'interno di essa. Utilizzare anche questo metodo per determinare il numero di pixel positivi per EDU nella stessa regione. Le misurazioni morfometriche effettuate sui topi sottoposti a carico compressivo dell'ATM hanno mostrato che il carico aumentava in modo significativo la lunghezza della mandibola e della testa della condiloide.Tuttavia, il carico non ha determinato un cambiamento significativo nella larghezza del condilo. La quantificazione della distribuzione del collagene ha rivelato un aumento significativo dell'espressione di Col10a1 e della MCC dei condili negli animali sottoposti a carico. D'altro canto, l'espressione di Col2a1 non differiva molto dal controllo.L'attività TRAP è aumentata nella regione sottocartilaginea dei condili e nei topi sottoposti a carico, così come la proliferazione subcondrale. La colorazione EDU indica il numero di cellule proliferative. La distribuzione dei proteoglicani nel condilo mandibolare è stata quantificata valutando l'area colorata con blu di toluidina e la mappa delle distanze.È stato osservato un aumento significativo della mappatura della distanza nella MCC dei condili del gruppo sottoposto a carico. Tuttavia, l'area colorata per i proteoglicani non ha mostrato differenze statisticamente significative tra i gruppi. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare i cambiamenti cellulari e strutturali nel condilo mandibolare dei roditori.

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