Creazione e applicazione di riferimento per facilitare la discussione e la classificazione delle proteine in un gruppo eterogeneo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un software standard per fogli di calcolo per sviluppare un riferimento per le proteine divergenti in un gruppo che manca di criteri coerenti per la nomenclatura e la classificazione. Questo metodo può aiutare a chiarire le relazioni tra proteine correlate che hanno una nomenclatura confusa o incoerente, come la superfamiglia di peptidi difensivi alfa-beta stabilizzata con cisteina che include le difese degli invertebrati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una semplice rappresentazione visiva delle proteine di interesse.

Per iniziare, identifica le caratteristiche distintive del gruppo proteico di interesse. Ad esempio, il ripiegamento CS alfa-beta nella struttura della soluzione di difesa degli insetti e l'aiuto da phormia terraenovae definisce la superfamiglia CS alfa-beta. Questa piega include anche un motivo più piccolo chiamato elica stabilizzata con cisteina, che è identificato da CXXXC a monte di un CXC.

Le quattro cisteine formano due legami disolfuro. Per completare il motivo alfa-beta CS, un terzo legame disolfuro è formato da un'ulteriore coppia di cisteine. In definitiva, è fondamentale conoscere almeno alcune caratteristiche importanti relative alla struttura o alla funzione della proteina.

Senza questo, non c'è alcuna base per generare un riferimento. Ora, inserisci queste caratteristiche distintive in un foglio di calcolo. Utilizzare le colonne per le entità geografiche conservate e per rappresentare gli spazi tra queste entità geografiche.

Mantieni le colonne abbastanza larghe da contenere i numeri e assegna loro una larghezza coerente. Nelle righe, descrivi le sequenze. Per indicare una sequenza come una caratteristica, riempire la casella della funzione con il colore, utilizzando la funzione di riempimento.

Quindi, per indicare la spaziatura tra le caratteristiche, inserisci il numero di amminoacidi nella casella intermedia. Ora, aggiungi sequenze rappresentative che sono state precedentemente stabilite come membri del gruppo sulla base di database strutturali e risultati pubblicati. Se necessario, aggiungere caratteristiche che potrebbero definire un sottogruppo di sequenze, come una cisteina extra.

Se mancano caratteristiche in una data sequenza, lasciare la casella vuota e combinarla con le caselle che rappresentano gli amminoacidi intermedi. Per fare ciò, utilizza la funzione Unisci e Centra. Una volta inserite le sequenze rappresentative, identificare i gruppi di sequenze chiaramente correlate.

Quindi, riassumi le caratteristiche di questi gruppi. Quando il numero di amminoacidi tra le caratteristiche varia, utilizzare un trattino per indicare un intervallo o barre per indicare alcuni numeri specifici. Se necessario, annota in modo creativo le funzionalità che potrebbero essere rilevanti o non sono abbastanza comuni da essere incluse nel riferimento.

Ad esempio, poiché le cisteine sono importanti nella superfamiglia, la presenza di cisteine aggiuntive può essere etichettata. A volte, quando si aggiungono sequenze appena identificate al foglio di calcolo, le sequenze di una specie rientrano in diversi gruppi della superfamiglia, come per i tardigradi. Una volta completato, le righe del foglio di calcolo possono essere ordinate per evidenziare la variazione all'interno di una specie o la variazione tra i gruppi tassonomici.

Questa dimostrazione utilizza il software MEGA 6 disponibile gratuitamente. Tuttavia, altri software possono essere utilizzati in modo simile. Per iniziare un nuovo allineamento, selezionare Modifica/Crea allineamento nella scheda Allinea.

Quindi seleziona Crea un nuovo allineamento, nella casella che appare e fai clic su OK. Quindi seleziona Proteine. A questo punto, selezionate Inserisci sequenza da file, nel menu Modifica, per importare le sequenze. Le sequenze devono essere in formato FASTA.

I colori di sfondo che riflettono diversi tipi di amminoacidi sono mostrati per impostazione predefinita e possono essere disattivati con un interruttore, nel menu Display. Una volta inserite tutte le sequenze, fare clic sull'icona del braccio flessibile e quindi su Allinea proteina per allineare le sequenze utilizzando l'algoritmo muscolare. Se il messaggio è stato selezionato Nulla per l'allineamento.

Seleziona tutto?, scegliere OK. Alcuni parametri possono essere modificati nella finestra pop-up, ma per questa dimostrazione saranno sufficienti le impostazioni predefinite. Ora, controlla l'allineamento in base alle caratteristiche importanti della superfamiglia delle proteine.

La barra superiore mostra un asterisco in qualsiasi posizione in cui l'amminoacido è completamente conservato. L'allineamento iniziale identifica tre delle quattro cisteine conservate. Una sequenza è chiaramente disallineata.

Per correggere una sequenza disallineata, evidenziare i trattini e premere il tasto Canc senza eliminare accidentalmente gli amminoacidi. Quindi, sposta gli amminoacidi nel loro corretto allineamento aggiungendo spazi. Dopo aver allineato manualmente la sequenza, si noti che l'ultima cisteina del motivo CXXXC viene conservata per tutto l'allineamento.

regolazione manuale è spesso necessaria per dare priorità alle caratteristiche più importanti delle sequenze. L'allineamento del foglio di calcolo della superfamiglia alfa-beta CS precedentemente stabilita ha rivelato cinque modelli di base per la formazione dei legami. Le sequenze di tardigradi appena identificate rientrano nello spettro completo di questi modelli.

Successivamente, sono state utilizzate analisi filogenetiche per esaminare come questo gruppo di proteine potrebbe essersi evoluto. Tuttavia, le sequenze sono generalmente brevi e altamente divergenti. Pertanto, gli alberi risultanti erano scarsamente risolti e offrivano poche informazioni.

L'allineamento di sequenze multiple è stato ottimizzato utilizzando il riferimento, ma c'era ancora una scarsa risoluzione nell'analisi di massima verosimiglianza e nell'analisi filogenetica bayesiana. La maggior parte dei cladi aveva solo bassi livelli di supporto. Tuttavia, cinque piccoli gruppi sono stati supportati in almeno uno dei due alberi.

Le sequenze con numeri di cisteina diversi all'interno di un gruppo tassonomico possono essere più strettamente correlate rispetto alle sequenze con lo stesso modello di gruppi diversi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il software per fogli di calcolo per generare una semplice visualizzazione di importanti caratteristiche proteiche. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che determinare le caratteristiche più rilevanti per il gruppo di proteine è spesso un processo iterativo e probabilmente sarà necessaria una revisione del riferimento.

È sempre possibile aggiungere nuove sequenze a un foglio di calcolo ed è facile avere più versioni che consentono di aggiungere nuove funzionalità che possono essere utili per la classificazione e l'analisi. Sebbene l'allineamento del foglio di calcolo consenta una facile visualizzazione delle caratteristiche strutturali e funzionali, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi filogenetica per fornire ulteriori informazioni sulle relazioni evolutive.