Un protocollo per la Computer-Based Protein Structure Prediction e Funzione

Lo scopo di questa procedura è quello di prevedere computazionalmente le strutture tridimensionali e la funzione biologica delle molecole proteiche a partire dalle loro sequenze amminoacidiche. Ciò si ottiene prevedendo prima la struttura secondaria delle proteine mediante l'apprendimento automatico. Le sequenze e la struttura secondaria prevista vengono quindi confrontate con le strutture risolte nella libreria PDB per identificare i migliori modelli di struttura possibili.

Questa procedura è denominata threading. Seguendo la procedura di threading, il programma IT AER dividerà i modelli in frammenti in base agli allineamenti dei modelli di sequenza, quindi riassemblerà i frammenti in modelli a lunghezza intera nel terzo passaggio. I modelli atomici completi sono costruiti mediante raffinamenti a livello atomico per ottimizzare le reti di legame idrogeno e rimuovere le sovrapposizioni.

L'ultimo passo della procedura consiste nell'identificare la funzione biologica delle proteine abbinando le strutture di previsione con le proteine di funzione nota nella libreria di funzioni. Il vantaggio principale di ITER rispetto al metodo di modellazione della struttura esistente è l'approccio intrinseco all'assemblaggio dei frammenti di struttura, che può portare costantemente gli allineamenti di filettatura più vicini allo stato nativo. Questi modelli di struttura di alta qualità costituiscono anche la base di annotazioni funzionali accurate basate sulla struttura per promuovere l'uso di ITER nella comunità scientifica.

Il nostro laboratorio ha messo a disposizione un sito web dove le sequenze proteiche possono essere inviate a iter. Questo sito web funge da nesso con il quale gli utenti di tutto il mondo possono registrare un'interfaccia per un cluster di computer, che gestisce ed esegue simulazioni ITER. Un processo di simulazione ITER consiste in oltre una dozzina di sottosimulazioni più piccole.

Queste simulazioni, se eseguite su un singolo computer con un singolo core del processore, possono richiedere più di cento ore. Il cluster di computer del laboratorio Zang prende e distribuisce queste sottosimulazioni su centinaia di computer ed è in grado di eseguire oltre 2000 simulazioni. In concomitanza con il nostro cluster di computer, siamo in grado di completare centinaia di simulazioni di prova ogni giorno.

Anche con questa capacità, c'è molto lavoro da fare per ottimizzare il sistema e ridurre al minimo i tempi di attesa per i nostri utenti IT AER online. Per iniziare con l'esperimento di modellazione della struttura e della funzione, accedere alla pagina Web IT AER. Gli indirizzi URL di tutte le pagine web rilevanti qui discusse sono riportati nel protocollo scritto.

Copia e incolla la sequenza di amminoacidi nel modulo fornito o carica direttamente la sequenza facendo clic sul pulsante Sfoglia. Fornisci un indirizzo e-mail e un nome per il lavoro. Gli utenti possono opzionalmente specificare i vincoli di contatto esterno in residuo o di distanza.

Aggiungere un modello aggiuntivo o escludere alcune proteine modello durante il processo di modellazione della struttura. Per inviare la sequenza, fare clic sul pulsante esegui il taser. Controlla lo stato del lavoro inviato visitando la pagina della coda del taser IT.

Fare clic sulla scheda di ricerca e utilizzare il numero ID del lavoro o la sequenza di query per cercare il lavoro inviato. Al termine della modellazione della struttura e della funzione, verrà inviata un'e-mail di notifica contenente un'immagine delle strutture previste e un collegamento Web all'indirizzo e-mail fornito. Clicca su questo link per visualizzare e scaricare i risultati.

Iniziare l'analisi della struttura esaminando la previsione della struttura secondaria, che viene visualizzata come H per l'alfa elica, S per il trefolo beta o C per la bobina. Inoltre, considera il punteggio di affidabilità della previsione per ogni residuo. Cerca regioni con strutture lunghe di previsioni di struttura secondaria regolari per stimare la regione centrale della proteina.

La classe strutturale della proteina può anche essere analizzata in base alla distribuzione degli elementi della struttura secondaria. Visualizza l'accessibilità prevista del solvente per accertare le regioni sepolte ed esposte al solvente. Nella query, i valori di accessibilità del solvente previsto variano da un punteggio pari a zero per un residuo sepolto a un punteggio pari a nove per un residuo esposto.

Le regioni contenenti per lo più residui sepolti possono essere utilizzate per delineare la regione centrale della proteina, mentre le regioni con solventi esposti e residui idrofili sono potenziali siti di idratazione o funzionali. Per visualizzare le strutture terziarie previste della proteina query, scorrere verso il basso fino all'app JMO interattiva visualizzata a sinistra. Fare clic sull'applet per modificare l'aspetto della struttura visualizzata.

Ingrandisci una regione specifica, seleziona tipi di residui specifici nel modello previsto o calcola le distanze dei residui. Analizzare i punteggi di confidenza della modellazione strutturale per stimare la qualità delle strutture previste. I valori Csco sono in genere compresi tra cinque e due negativi, in cui un punteggio più alto riflette un modello di migliore qualità.

Il punteggio TM stimato e l'RMSD del primo modello sono mostrati come accuratezza stimata del modello uno. Clicca sul link di più su csco. Per analizzare la dimensione del cluster csco e la densità del cluster di tutti i modelli, analizzare i primi 10 modelli di threading della proteina di query identificati dai programmi di threading a basso mets.

Scorrendo verso il basso la pagina dei risultati, visualizzare lo Z-score normalizzato per analizzare la qualità degli allineamenti di threading. Gli allineamenti con un csco normalizzato maggiore di uno, riflettono un allineamento sicuro e hanno maggiori probabilità di avere lo stesso ripiegamento della proteina query. Esaminare l'identità della sequenza nella regione allineata al threading e per l'intera catena per valutare l'omologia tra la query e le proteine stampo.

Un'elevata identità di sequenza è un indicatore della correlazione evolutiva tra la query e le proteine stampo. Visualizzare il residuo allineato alla filettatura visualizzato a colori per identificare visivamente i residui o i motivi conservati nella query e le proteine modello Un'identità di sequenza più elevata nella regione allineata alla filettatura rispetto all'allineamento dell'intera catena indica anche la presenza di motivi strutturali o domini conservati nella query. Valutare la copertura dell'allineamento della filettatura ispezionando l'allineamento.

Se la copertura dell'allineamento superiore è bassa e confinata solo a una piccola regione della proteina di interrogazione o assente per un lungo segmento della sequenza di interrogazione, indica che la proteina di interrogazione contiene più di un dominio. In questo caso, si consiglia di suddividere la sequenza e modellare i domini singolarmente. Visualizza la tabella successiva della pagina dei risultati per determinare i primi 10 analoghi strutturali del primo modello previsto come identificato dal programma di allineamento strutturale, TM align.

Un punteggio TM superiore a 0,5 indica che l'analogo e il modello rilevati hanno una topologia simile e possono essere utilizzati per determinare la classe strutturale o la famiglia di proteine della proteina query. Quelli con un punteggio TM inferiore a 0,3 significano una somiglianza di struttura casuale. Analizzare l'identità della sequenza e l'RMSD nella regione strutturalmente allineata per valutare la conservazione dei motivi spaziali nel modello e nell'analogo strutturale.

Ispezionare visivamente le coppie di residui colorati e allineati nell'allineamento per identificare questi residui e motivi strutturalmente conservati. Osserva la tabella dei numeri EC previsti per visualizzare i primi cinque potenziali OG enzimatici della proteina query. Il livello di confidenza della previsione del numero EC utilizzando questi modelli è mostrato come punteggio EC basato sull'analisi di benchmarking.

La somiglianza funzionale tra la proteina query e la proteina stampo può essere interpretata in modo affidabile utilizzando un punteggio EC superiore a 1,1. Quindi, cerca il consenso sulla funzione tra i modelli, che hanno una piega simile alla proteina di query. Se più modelli hanno lo stesso numero EC e il punteggio EC è maggiore di 1,1, il livello di confidenza della previsione è molto alto.

Tuttavia, se il punteggio EC è alto, ma c'è una mancanza di consenso tra i risultati identificati, la previsione diventa meno affidabile e si consiglia agli utenti di consultare l'ontologia genica. Visualizza la tabella dei termini di ontologia genica prevista per identificare i primi 10 omologhi della proteina di query nella libreria PDB annotata con termini di ontologia genica, ogni proteina è solitamente associata a più termini di ontologia genica che descrivono le sue funzioni molecolari, i processi biologici e la posizione cellulare. Fare clic su ciascun termine per visitare il sito Web di amigo e analizzarne la definizione e il lignaggio.

Analizza la colonna del punteggio di omologia funzionale per accedere alla somiglianza funzionale tra la query e le proteine stampo. È possibile stimare anche il livello di confidenza nel trasferimento dell'annotazione funzionale da queste proteine. Visualizza la tabella dei termini di previsione di consenso dell'ontologia genica per analizzare la concomitanza di funzione tra i modelli.

Queste funzioni comuni vengono utilizzate per prevedere i termini di ontologia genica della proteina query e per valutare il livello di confidenza delle previsioni a termine geografico. Infine, scorri verso il basso fino alla fine della pagina per visualizzare le prime 10 previsioni del sito di legame del ligando per la query I siti di legame previsti per la proteina sono classificati in base al numero di conferme di ligandi previsti che condividono una tasca di legame comune. Il sito di collegamento meglio identificato è già visualizzato nell'app JM OL.

Fare clic sui pulsanti di opzione per analizzare altre previsioni e visualizzare i residui che interagiscono con il ligando. Il punteggio BS rivela una somiglianza locale tra il modello e il sito di associazione dei modelli. Un punteggio BS superiore a 1,1 indica un'elevata somiglianza strutturale e di sequenza vicino al sito di legame previsto.

Nel modello rispetto al sito di associazione noto nel modello, l'IT è una pagina Web principale che contiene collegamenti per altre funzioni utili. La funzione forum consente all'utente di creare un account online e chiedere aiuto ad altri utenti di ITER per quanto riguarda la modellazione della struttura o per l'interpretazione dei risultati. La funzione di download consente agli utenti di scaricare iter e pacchetti correlati e installarli sul proprio computer.

Ciò consente di ridurre il tempo necessario per eseguire gli esperimenti di modellazione. La funzione di coda consente di visualizzare lo stato di tutti i lavori inviati nella pagina IT a Q. Gli utenti possono anche ispezionare visivamente l'immagine delle strutture modellate per i lavori finiti.

In questa pagina, mostrata anche il punteggio TM previsto CSCO e l'RMSD atteso del primo modello e la data di presentazione mostrata qui, è mostrato un estratto della pagina dei risultati IT AER che mostra la sequenza di query formattata più veloce, la struttura secondaria prevista e i punteggi di confidenza associati e l'accessibilità al solvente prevista dei residui. La regione centrale analizzata e il potenziale sito di idratazione nella query sono evidenziati rispettivamente in rettangoli ciano e rosso. Qui vengono mostrate le previsioni della struttura terziaria per le proteine query.

I modelli previsti vengono visualizzati in un'app JML interattiva, consentendo all'utente di modificare la visualizzazione della molecola. I modelli possono essere scaricati anche cliccando sui link per il download, il punteggio di affidabilità per stimare la qualità del modello è riportato come csco. Viene presentato un esempio della pagina dei risultati itta A che mostra i primi 10 modelli di filettatura identificati e gli allineamenti dei programmi di filettatura Loomis.

La qualità degli allineamenti di filettatura viene valutata in base allo Z-score normalizzato, dove un valore maggiore di uno riflette un allineamento sicuro. I residui allineati nel modello che sono identici ai residui di query corrispondenti vengono evidenziati a colori per indicare la presenza di un residuo o di un motivo conservato. Al contrario, una mancanza di allineamento nella maggior parte dei modelli principali indica la presenza di più domini nella proteina query e i residui non allineati corrispondono alle regioni del linker di dominio.

Questa tabella mostra i primi 10 analoghi strutturali identificati e gli allineamenti strutturali identificati dal programma di allineamento strutturale allineato TM. La classificazione degli analoghi si basa sul punteggio TM dell'allineamento strutturale. Un punteggio TM superiore a 0,5 indica che le due strutture confrontate hanno una topologia simile.

Mentre un punteggio TM inferiore a 0,3 significa una somiglianza tra due strutture casuali. Le coppie di residui strutturalmente allineate sono evidenziate a colori in base alla loro proprietà amminoacidica, mentre le regioni non allineate sono indicate da un trattino. Ecco un esempio della pagina dei risultati ITR che mostra gli omologhi enzimatici identificati della proteina query nella libreria PDB.

Il livello di confidenza della previsione del numero EC viene analizzato in base al punteggio EC, dove un punteggio EC superiore a 1,1 indica una somiglianza funzionale tra la proteina query e la proteina stampo. La tabella di previsione dei termini di ontologia genica per la proteina query include omologhi funzionali per la proteina query nella libreria di modelli di ontologia genica classificati in base al loro punteggio di omologia funzionale. Le caratteristiche funzionali comuni di questi risultati con il punteggio più alto sono derivate per generare le previsioni finali del termine di ontologia genica per la proteina query.

La qualità dei termini di ontologia genica previsti è stimata in base al punteggio geografico, dove un punteggio geografico superiore a 0,5 indica una previsione affidabile mostrata qui come esempio della pagina dei risultati IT AZA che mostra le prime 10 previsioni del sito di legame del ligando proteico utilizzando l'algoritmo del cofattore. La classificazione dei siti di legame previsti si basa sul numero di conferme di ligandi previste che condividono una tasca di legame comune. Nella query il punteggio BS è una misura della sequenza locale e della somiglianza della struttura tra il sito di legame previsto e quello dei modelli ed è utile per analizzare la conservazione delle tasche del sito di legame.

Sebbene l'ISER sia uno degli algoritmi più efficienti per la previsione della struttura e della funzione delle proteine, è importante ricordare che si tratta solo di una previsione proveniente da algoritmi informatici. Qualsiasi dato sperimentale o intuizione di funzione, ad esempio le informazioni sul legame dei contatti dei residui, sarà estremamente utile per aumentare l'accuratezza delle previsioni. Il server IT AER dispone di un portale per includere queste informazioni durante la procedura di modellazione per soddisfare il crescente interesse nei suoi confronti.

Aer, il laboratorio di Zang ha rilasciato gratuitamente il software IT AER per la ricerca non commerciale. Stiamo sviluppando attivamente un AER IT e un assaggio oculare migliorato, e nella speranza che la sua disponibilità porti a un'applicazione su larga scala al di fuori del laboratorio Zang e possa beneficiare e stimolare ulteriori ricerche nella comunità scientifica.