Un protocollo per la Computer-Based Protein Structure Prediction e Funzione

Lo scopo di questa procedura è prevedere computazionalmente le strutture tridimensionali e la funzione biologica di molecole proteiche a partire dalle loro sequenze di aminoacidi. Questo viene realizzato innanzitutto prevedendo la struttura secondaria delle proteine mediante apprendimento automatico. Le sequenze e la struttura secondaria prevista vengono quindi confrontate con le strutture risolte presenti nella libreria PDB per identificare i migliori modelli strutturali possibili.

Questa procedura è chiamata threading. Dopo la procedura di threading, il programma IT AER dividerà i modelli in frammenti in base agli allineamenti delle sequenze modello, quindi riassemblerà i frammenti in modelli completi nel terzo passaggio. I modelli atomici completi vengono costruiti mediante affinamenti a livello atomico per ottimizzare le reti di legami a idrogeno ed eliminare gli impacci sterici.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'identificare la funzione biologica delle proteine confrontando le strutture predette con quelle di proteine di funzione nota presenti nella libreria funzionale. Il principale vantaggio di ITER rispetto ai metodi esistenti di modellazione strutturale è l'approccio intrinseco di assemblaggio di frammenti strutturali, che può guidare in modo costante gli allineamenti per threading verso lo stato nativo. Questi modelli strutturali di alta qualità costituiscono inoltre la base per annotazioni funzionali accurate basate sulla struttura, favorendo l'utilizzo di ITER nella comunità scientifica.

Il nostro laboratorio ha reso disponibile un sito web su cui è possibile inviare le sequenze proteiche per ITER. Questo sito web funge da nodo centrale attraverso il quale gli utenti di tutto il mondo possono registrare un'interfaccia verso un cluster informatico, che gestisce ed esegue le simulazioni ITER. Un processo di simulazione ITER comprende più di una dozzina di sottosimulazioni più piccole.

Queste simulazioni, quando eseguite su un singolo computer con un singolo core del processore, possono richiedere oltre cento ore. Il cluster di computer del laboratorio Zang suddivide e distribuisce queste sottosimulazioni su centinaia di computer ed è in grado di eseguire oltre 2000 simulazioni. In parallelo con il nostro cluster informatico, siamo in grado di completare centinaia di simulazioni I taster ogni giorno.

Anche con questa capacità, è necessario svolgere molto lavoro per ottimizzare il sistema e ridurre al minimo i tempi di attesa per gli utenti IT AER online. Per iniziare l'esperimento di modellizzazione della struttura e della funzione, accedere alla pagina web IT AER. Gli indirizzi URL di tutte le pagine web qui discusse sono riportati nel protocollo scritto.

Copia e incolla la sequenza di aminoacidi nel modulo fornito oppure carica direttamente la sequenza facendo clic sul pulsante di navigazione. Fornisci un indirizzo email e un nome per il processo. Gli utenti possono eventualmente specificare vincoli esterni di contatto tra residui o vincoli di distanza.

Aggiungere un ulteriore modello o escludere alcune proteine modello durante il processo di modellazione della struttura. Per inviare la sequenza, fare clic sul pulsante run it taser. Verificare lo stato del lavoro inviato visitando la pagina della coda di IT taser.

Fare clic sulla scheda di ricerca e utilizzare il numero ID del lavoro o la sequenza di query per cercare il lavoro inviato. Al termine della modellizzazione della struttura e della funzione, un'e-mail di notifica contenente un'immagine delle strutture predette e un collegamento web verrà inviata all'indirizzo e-mail fornito. Fare clic su questo collegamento per visualizzare e scaricare i risultati.

Iniziare l'analisi della struttura esaminando la previsione della struttura secondaria, mostrata come H per elica alfa, S per foglietto beta o C per coil. Considerare inoltre il punteggio di confidenza della previsione per ciascun residuo. Cercare regioni con lunghe strutture di previsioni regolari di struttura secondaria per stimare la regione centrale della proteina.

La classe strutturale della proteina può essere analizzata anche in base alla distribuzione degli elementi di struttura secondaria. Visualizzare la disponibilità prevista al solvente per determinare le regioni sepolte ed esposte al solvente. Nei valori della query, la disponibilità prevista al solvente varia da un punteggio di zero per un residuo sepolto a un punteggio di nove per un residuo esposto.

Le regioni contenenti principalmente residui sepolti possono essere utilizzate per delimitare la regione centrale della proteina, mentre le regioni con residui esposti al solvente e idrofili rappresentano potenziali siti di idratazione o funzionali. Per visualizzare le strutture terziarie predette della proteina in esame, scorrere verso il basso fino all'applet interattivo JMO visualizzato a sinistra. Fare clic sull'applet per modificare l'aspetto della struttura mostrata.

Effettuare lo zoom su una regione specifica, selezionare tipi di residui specifici nel modello predetto o calcolare le distanze tra i residui. Analizzare i punteggi di confidenza della modellizzazione strutturale per stimare la qualità delle strutture predette. I valori Csco sono tipicamente compresi tra meno cinque e due, dove un punteggio più elevato indica un modello di qualità migliore.

Il TM score stimato e l'RMSD del primo modello sono mostrati come accuratezza stimata del modello uno. Fare clic sul collegamento ulteriori informazioni su csco. Per analizzare la dimensione del cluster csco e la densità del cluster di tutti i modelli, analizzare i primi 10 modelli di threading della proteina in esame identificati dai programmi di threading con bassi valori di mets.

Scorrendo verso il basso la pagina dei risultati, osservare il punteggio Z normalizzato per analizzare la qualità degli allineamenti tramite threading. Gli allineamenti con un punteggio normalizzato superiore a uno indicano un allineamento affidabile e probabilmente presentano lo stesso ripiegamento della proteina in esame. Esaminare l'identità di sequenza nella regione allineata tramite threading e per l'intera catena per valutare l'omologia tra la proteina in esame e le proteine modello.

Un'elevata identità di sequenza è un indicatore di parentela evolutiva tra le proteine bersaglio e quelle modello. Esaminare i residui allineati per il threading, mostrati in colore, per identificare visivamente residui o motivi conservati nella proteina bersaglio e nella proteina modello; un'identità di sequenza più elevata nella regione allineata per il threading, rispetto all'allineamento dell'intera catena, indica inoltre la presenza di motivi o domini strutturali conservati nella proteina bersaglio. Valutare la copertura dell'allineamento per il threading esaminando l'allineamento.

Se il livello di copertura dell'allineamento migliore è basso e limitato a una piccola regione della proteina in esame o assente per un lungo tratto della sequenza in esame, ciò indica che la proteina in esame contiene più di un dominio. In questo caso, si consiglia di suddividere la sequenza e modellare i domini singolarmente. Consultare la tabella successiva della pagina dei risultati per determinare i 10 analoghi strutturali principali del primo modello predetto, identificati dal programma di allineamento strutturale TM align.

Un punteggio TM superiore a 0,5 indica che l'analoghi rilevato e il modello possiedono una topologia simile e possono essere utilizzati per determinare la classe strutturale o la famiglia proteica della proteina in esame. Valori con un punteggio TM inferiore a 0,3 indicano una similarità strutturale casuale. Analizzare l'identità di sequenza e il RMSD nella regione allineata strutturalmente per valutare la conservazione dei motivi spaziali nel modello e nell'analoghi strutturale.

Ispezionare visivamente le coppie di residui colorati e allineati nell'allineamento per identificare questi residui e motivi strutturalmente conservati. Esaminare la tabella dei numeri EC predetti per visualizzare i cinque principali gruppi ortologhi enzimatici (OG) potenziali della proteina in analisi. Il livello di confidenza della predizione del numero EC, ottenuto mediante l'uso di questi modelli, è indicato come punteggio EC basato su un'analisi di benchmarking.

La similarità funzionale tra la proteina in esame e il modello può essere interpretata in modo affidabile utilizzando un punteggio EC superiore a 1,1. Successivamente, verificare la concordanza funzionale tra i modelli, che presentano un ripiegamento simile a quello della proteina in esame. Se più modelli condividono lo stesso numero EC e il punteggio EC è maggiore di 1,1, il livello di confidenza della previsione è molto elevato.

Tuttavia, se il punteggio EC è elevato ma non vi è un accordo tra gli allineamenti identificati, la previsione diventa meno affidabile e si consiglia agli utenti di consultare l'ontologia genica. La vista delle previsioni dei termini mostra la tabella dei termini di ontologia genica predetti per identificare i 10 omologhi principali della proteina in esame presenti nella libreria PDB, annotati con termini di ontologia genica; ogni proteina è solitamente associata a più termini di ontologia genica che ne descrivono le funzioni molecolari, i processi biologici e la localizzazione cellulare. Fare clic su ciascun termine per visitare il sito web AmiGO e analizzarne la definizione e la linea discendente.

Analizzare la colonna del punteggio di omologia funzionale per valutare la similarità funzionale tra le proteine query e quelle modello. Può essere inoltre stimato il livello di confidenza nel trasferire l'annotazione funzionale da queste proteine. Esaminare la tabella della previsione consensuale dei termini di gene ontology per analizzare la concordanza funzionale tra i modelli.

Queste funzioni comuni vengono utilizzate per prevedere i termini dell'ontologia genica della proteina in analisi e per valutare il livello di confidenza delle previsioni dei termini geo. Infine, scorrere verso il basso fino al fondo della pagina per visualizzare le prime 10 previsioni di siti di legame per ligandi; i siti di legame previsti per la proteina in analisi sono ordinati in base al numero di conferme del ligando previste che condividono una stessa tasca di legame. Il sito di legame migliore identificato è già visualizzato nell'applicazione JM OL.

Fare clic sui pulsanti radio per analizzare altre previsioni e visualizzare i residui interagenti del ligando. Il punteggio BS rivela la similarità locale tra il sito di legame del modello e quello dei modelli di riferimento. Un punteggio BS superiore a 1,1 indica una elevata similarità di sequenza e strutturale nelle vicinanze del sito di legame previsto.

Nel modello, rispetto al sito di legame noto nel template, l'IT è una pagina web principale che contiene collegamenti ad altre funzionalità utili. La funzionalità del forum consente all'utente di creare un account online e di richiedere aiuto ad altri utenti di ITER riguardo alla modellizzazione della struttura o all'interpretazione dei risultati. La funzionalità di download permette agli utenti di scaricare iter e pacchetti correlati e di installarli sul proprio computer.

Questo contribuisce a ridurre il tempo necessario per eseguire gli esperimenti di modellizzazione. La funzione di coda consente di visualizzare lo stato di tutti i lavori inviati nella pagina IT a Q. Gli utenti possono inoltre esaminare visivamente l'immagine delle strutture modellizzate per i lavori completati.

In questa pagina, mostrata anche la punteggio TM atteso e la RMSD attesa del primo modello da CSCO e la data di invio qui riportata è un estratto della pagina dei risultati IT AER che mostra la sequenza della query formattata più rapidamente, la struttura secondaria predetta e i punteggi di confidenza associati e l'accessibilità predetta al solvente dei residui. La regione centrale analizzata e il sito di idratazione potenziale nella query sono evidenziati rispettivamente con rettangoli ciano e rossi. Qui vengono mostrate le predizioni della struttura terziaria per le proteine in analisi.

I modelli predetti vengono visualizzati in un'interfaccia interattiva JML, che consente all'utente di modificare la rappresentazione della molecola. I modelli possono anche essere scaricati cliccando sui link di download; il punteggio di confidenza per stimare la qualità del modello è riportato come csco. Viene presentato un esempio della pagina dei risultati di itta A, che mostra i primi 10 modelli di threading identificati e i relativi allineamenti ottenuti con i programmi di threading di Loomis.

La qualità degli allineamenti di threading viene valutata in base al punteggio Z normalizzato, in cui un valore superiore a uno indica un allineamento affidabile. I residui allineati nel modello che sono identici ai corrispondenti residui della sequenza in esame vengono evidenziati in colore per indicare la presenza di un residuo o di un motivo conservato. Al contrario, l'assenza di allineamento nella maggior parte dei modelli migliori indica la presenza di più domini nella proteina in esame e i residui non allineati corrispondono alle regioni di collegamento tra domini.

Questa tabella mostra i primi 10 analoghi strutturali e allineamenti strutturali identificati dal programma TM-Align per l'allineamento strutturale. La classificazione degli analoghi si basa sul punteggio TM dell'allineamento strutturale. Un punteggio TM superiore a 0,5 indica che le due strutture confrontate hanno una topologia simile.

Un punteggio TM inferiore a 0,3 indica una similarità tra due strutture casuali. Le coppie di residui allineati strutturalmente sono evidenziate in colore in base alla loro proprietà aminoacidica, mentre le regioni non allineate sono indicate da un trattino. Di seguito è riportato un esempio della pagina dei risultati ITR che mostra gli omologhi enzimatici identificati della proteina interrogata nel database PDB.

Il livello di confidenza della previsione del numero EC è analizzato in base al punteggio EC, dove un punteggio EC superiore a 1,1 indica una similarità funzionale tra la proteina in esame e la proteina modello. La tabella di previsione dei termini della gene ontology per la proteina in esame include gli omologhi funzionali della proteina in esame presenti nella libreria di modelli di gene ontology, ordinati in base al loro punteggio di omologia funzionale. Le caratteristiche funzionali comuni di questi riscontri con i punteggi più elevati vengono analizzate per generare le previsioni finali dei termini della gene ontology per la proteina in esame.

La qualità dei termini previsti per l'ontologia genica è stimata in base al punteggio geo, dove un punteggio geo superiore a 0,5 indica una previsione affidabile, mostrata qui come esempio della pagina dei risultati IT AZA che riporta le prime 10 previsioni di siti di legame per ligandi proteici ottenute mediante l'algoritmo del cofattore. Il posizionamento in classifica dei siti di legame previsti si basa sul numero di conferme del ligando previste che condividono una stessa tasca di legame. Nel query, il punteggio BS è una misura della similarità locale nella sequenza e nella struttura tra il sito di legame previsto e quelli dei modelli (template) ed è utile per analizzare la conservazione delle tasche dei siti di legame.

Sebbene ISER sia uno degli algoritmi più efficienti per la previsione della struttura e della funzione delle proteine, è importante ricordare che si tratta comunque di una previsione ottenuta mediante algoritmi informatici. Eventuali dati sperimentali o informazioni sulla funzione, ad esempio contatti tra residui o informazioni sul legame, saranno estremamente utili per aumentare l'accuratezza delle previsioni. Il server IT AER dispone di un portale per includere tali informazioni durante la procedura di modellizzazione, per rispondere al crescente interesse in merito.

Aer, il laboratorio Zang ha rilasciato il software IT AER gratuitamente per la ricerca non commerciale. Stiamo attivamente sviluppando e migliorando IT AER e il sistema eye taster, nella speranza che la sua disponibilità porti a un'utilizzazione su larga scala al di fuori del laboratorio Zang e che possa giovare e stimolare ulteriori ricerche nella comunità scientifica.