Name: Effetti differenziali di farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della morfologia delle particelle di colesterolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Scopri come i farmaci ipolipemizzanti modulano la morfologia delle particelle di colesterolo con il metodo plaque array. Questa tecnica consente di visualizzare le particelle e identificare potenziali biomarcatori per la diagnosi dell'aterosclerosi.

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Questo lavoro è stato finanziato da una ricerca Plaxgen sovvenzione conferito alla SM (PLX-1008). Ringraziamo Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute per la raccolta di campioni di siero da soggetti di aterosclerosi sotto approvazione IRB.

1. preparazione di fluorescente etichettati colesterolo e lipidi droga Nota: aggregati di colesterolo con etichetta fluorescente e le statine sono state preparate come descritto nel nostro precedente articolo 21. vedere Tabella materiali per i dettagli dei reagenti, imaging citometro a flusso, analizzatori di chimica e software di analisi di dati utilizzati in questo studio.
<ol><li>Solubilizzare il colesterolo liofilizzato con etichetta fluorescente (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) polvere in 1 mL di alcole a 100%.</li>
	<li>Centrifugare il campione per 3 min a 2.040 x g e utilizzare i sovranatante contenente aggregati solubili fluorescenza-labeled colesterolo nell'analisi di matrice della placca.</li>
	<li>Per la preparazione di farmaci, singolarmente solubilizzare le polveri (2 mg) di simvastatina, lovastatina, atorvastatina, ezetimibe e acido grasso omega-3 in 1 ml di alcole a 100%.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione per 3 min a 2.040 x g, utilizzare i surnatanti contenenti farmaci nel test.</li>
	<li>Allo stesso modo, solubilizzano individualmente le polveri (2 mg) di fluvastatina, rosuvastatina, niacina e fibrato in 1 mL di acqua deionizzata per rendere una soluzione stock di 2 mg/mL.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione per 3 min a 2.040 x g, utilizzare i surnatanti contenenti farmaci nell'analisi di matrice della placca.</li>
</ol> 2. Saggio di matrice della placca per la formazione di particelle del colesterolo In Vitro Examining <ol><li>uso analizzatore di chimica-1 (Vedi tabella materiali) per impostare il saggio di matrice della placca per la formazione di particelle di colesterolo. Eseguire l'analisi in un fondo tondo, piastra a 96 pozzetti associazione povera in proteine usando i reagenti preparati nella sezione 1. Mantenere il volume di reazione finale in ciascun pozzetto a 200 µ l e di eseguire tutte le analisi in triplice copia.
	<ol><li>In primo luogo, carico 194,5 µ l di fosfato tampone salino (PBS) in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Per ciascun pozzetto, aggiungere 2,5 µ l (5 µ g) di ogni soluzione di farmaci ipolipemizzanti e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto analyzer-1 reazione chimica per mescolare uniformemente il farmaco in soluzione. Nessun farmaco è aggiunto ai campioni di controllo negativo.</li>
		<li>Infine, aggiungere 2 µ l (2 µ g) con etichetta fluorescente colesterolo aggregazione soluzione ad ogni pozzetto e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto analyzer-1 reazione chimica.</li>
		<li>Incubare la piastra su un agitatore di laboratorio per 2 h a 37 ° C e 200 giri/min.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, acquisire le immagini delle particelle da imaging citometria a flusso.</li>
	</ol></li></ol> 3. Catturare immagini di colesterolo particelle utilizzando Imaging citometria a flusso <ol><li>aprire il modello di acquisizione dati per caricare le impostazioni dello strumento corretto. Fare clic sul " File ", quindi selezionare " Apri modello … " e selezionare il file modello.</li>
	<li>Clic " Flush, blocco, carico " a preparare lo strumento per il caricamento del campione.</li>
	<li>Quando la " esempio caricare " dialogo viene visualizzata, fare clic su " OK " per caricare 50 µ l dei campioni da ogni ben preparato nella sezione 2 in imaging citofluorimetro.</li>
	<li>Clic " eseguire | Installazione " per visualizzare le particelle nell'area di imaging in tempo reale.</li>
	<li>Quando le particelle nell'area di imaging sono in buona messa a fuoco, fare clic su " eseguire | Acquisire " di acquisire immagini di ogni oggetto simultaneamente in un modo ad alta velocità per campo scuro (side scatter/SSC), bright field (BF), fluorescenza verde e giallo fluorescenza.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.2-3.5 per acquisire 5.000-10.000 particelle da ciascun campione.</li>
	<li>Analizzare tutti i file di immagine raw utilizzando il software di analisi di immagine per determinare l'intensità di fluorescenza oggetto e variazioni morfologiche.
	<ol><li>Clic il " strumenti " pulsante nella parte superiore del software di analisi di immagine, quindi selezionare " Batch file di dati " dal menu a discesa, che aprirà il " batch " finestra.</li>
		<li>Nella " batch " finestra, fare clic il " Batch aggiungere " pulsante, che aprirà il " definire un lotto " finestra.</li>
		<li>Nel " definire un lotto " finestra, fare clic sul " Aggiungi file " pulsante e selezionare i file di immagine raw, fare clic il " modello " pulsante e selezionare il file di modello di analisi di dati appropriato, quindi selezionare " OK " e " inviare batch " per iniziare l'elaborazione e l'analisi dei file di immagine raw.</li>
	</ol></li></ol> 4. Placca matrice dosaggio basato su valutazione di farmaci effetto ipolipemizzante sulle particelle di colesterolo purificato <ol><li>come descritto al punto 2.1, eseguire l'analisi di formazione particelle di colesterolo utilizzando lipoproteine VLDL, LDL e HDL purificata/particelle. Eseguire il saggio di matrice della placca in una piastra a 96 pozzetti.
	<ol><li>In primo luogo, caricare tutti i pozzetti con PBS; utilizzare un volume finale di 200 µ l per ogni pozzo.</li>
	</ol></li> <li>Per il controllo negativo, aggiungere 4 µ g VLDL, LDL, o proteine/particelle di HDL singolarmente in ogni bene senza farmaci e scuotere la piastra per 30 s.
	<ol><li>Per esaminare l'effetto di farmaci ipolipemizzanti, aggiungere 4 µ g VLDL, LDL, o proteine/particelle di HDL individualmente a ciascun bene e scuotere la piastra per 30 s.</li>
		<li>Per pozzi aggiunti con 4 µ g VLDL, LDL o HDL, aggiungere 2,5 µ l (5 µ g) di ezetimibe, lovastatina, simvastatina o niacina soluzione e scuotere la piastra per 30 s collocandolo in chimica analyzer-1.</li>
		<li>Infine, aggiungere 2 µ l (2 µ g) colesterolo fluorescenza-labeled aggregazione soluzione a tutti i pozzetti e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto analyzer-1 reazione chimica.</li>
	</ol></li> <li>Incubare la piastra per 2 h in uno shaker di laboratorio impostato a 37 ° C e 200 giri/min.</li>
	<li>Acquisire i campioni mediante citometria a flusso imaging seguendo passaggi 3.1-3.5.</li>
	<li>Analizzare i file di immagine raw utilizzando software di analisi di immagine, come descritto al punto 3.7.</li>
	<li>Nel modello di analisi, utilizzare il seguente schema di gating per l'identificazione di sottopopolazioni di particelle di colesterolo.
	<ol><li>Su un terreno di numero di pixel del canale verde saturo (asse x) e campo scuro canale numero di pixel saturi (asse y), respingere gli oggetti con uno o più pixel saturi o canale.</li>
		<li>Stampare oggetti/particelle senza saturi pixel utilizzando intensità del canale verde (asse x) e l'intensità SSC (asse y): oggetti rientrano in una delle tre regioni (VLDL, LDL, HDL) basate sul loro canale verde e intensità di SSC. 
		Nota: Questi cancelli sono stati creati sulla base dei dati generati da esperimenti di controllo effettuati utilizzando VLDL, LDL e HDL particelle/proteine purificate senza la droga.</li>
	</ol></li> <li>Per determinare l'effetto di riduzione dei lipidi droga per ciascun campione, calcolare le concentrazioni di particelle della lipoproteina totale, come pure la percentuale di ogni sottopopolazione (VLDL, LDL, HDL) come descritto nel passo 6.5.
	<ol><li>Calcola la particella concentrazioni (particelle/mL) utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"> Nota: The VLDL, LDL e HDL gating regioni nella fluorescenza dot-trama rilevare ~ 80% di loro rispettive sottopopolazioni ed il restante ~ 20% delle particelle si sovrappongono con le altre regioni gating.</li>
	</ol></li></ol> 5. Misura delle concentrazioni nel lipido in campioni di siero <ol><li>per la determinazione delle concentrazioni di LDL, HDL, colesterolo e trigliceridi di analizzatore di chimica-2, utilizzare campioni di siero ottenuti da soggetti normali e dislipidemia di pari età.</li>
	<li>Definire anormale concentrazione di LDL, HDL, colesterolo e trigliceridi basati sulla loro concentrazione identificato oltre i valori di riferimento superiore e inferiore in campioni di siero.</li>
	<li>Seguire le raccomandazioni di valore normale di riferimentoDED dal produttore del reagente: (4-200 mg/dL) di colesterolo, HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) e trigliceridi (9-200 mg/dL).</li>
	<li>Identificare i campioni di siero che hanno un valore anormale come sia inferiore al valore di riferimento inferiore o sopra il riferimento più alto rapporto di colesterolo e trigliceridi e li usa per lo screening in presenza ed assenza di farmaci ipolipemizzanti.</li>
</ol> 6. Analizzando l'effetto delle droghe sulla formazione di particelle di colesterolo in campioni di siero <ol><li>uso la chimica analyzer-1 per impostare il saggio di matrice della placca per la formazione di particelle di colesterolo nel siero. Eseguire l'analisi in un fondo tondo, piastra a 96 pozzetti associazione povera in proteine. Utilizzare un volume di reazione finale di 200 µ l/pozzetto ed eseguire tutte le analisi in triplice copia.</li>
	<li>, Preparare la piastra caricando i reagenti in un modo graduale.
	<ol><li>Preparare i pozzetti di controllo.</li>
		<li>Carico 193 µ l di PBS in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Aggiungere 2,5% (v/v) siero del paziente (campione di sola siero per pozzetto) e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto di reazione chimica analyzer.</li>
		<li>Add 2 µ l (2 µ g) di colesterolo fluorescenza-labeled aggregare soluzione in tutti i pozzetti e scuotere la piastra per 30 s collocandolo su un piatto di analizzatore-1 reazione chimica.</li>
	</ol></li> <li>Preparare i pozzetti con droghe.
	<ol><li>Carico 191 µ l di PBS in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Aggiungere 2,5% (v/v) siero del paziente (campione di sola siero per pozzetto) e scuotere la piastra per 30 s collocandolo su un piatto di analizzatore-1 reazione chimica.</li>
		<li>Add 2 µ l ezetimibe, lovastatina, simvastatina o niacina soluzione (4 µ g) in tutti i pozzetti tranne i pozzetti di controllo negativo. Aggiungere un solo farmaco per pozzetto e scuotere la piastra per 30 s collocandolo su un piatto di analizzatore-1 reazione chimica.</li>
		<li>Add 2 µ l di fluorescenza-labeled colesterolo aggregare soluzione (2 µ g) in tutti i pozzetti e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto analyzer-1 reazione chimica.</li>
	</ol></li> <li>Caricare farmaci solo dopo tutti i pozzetti (controllo e droga trattato) sono stati caricati con i loro rispettivi sieri e aggiungere colesterolo fluorescenza-etichetta alla fine di questo passaggio.</li>
	<li>Incubare la piastra per 2 h in uno shaker di laboratorio impostato a 37 ° C e 200 giri/min.</li>
	<li>Acquisire i campioni da imaging citofluorimetro seguendo le impostazioni descritte nei passaggi 3.1-3.6.</li>
	<li>Utilizzare l'immagine analizzando il software per l'elaborazione di tutti i file di immagine utilizzando lo stesso modello come descritto nei passaggi 3,7 batch.
	<ol><li>Eseguire l'analisi dei dati di disegno gates sulla trama come descritto ai punti 4.5 e 4.6.</li>
	</ol></li> <li>Per determinare la riduzione dei lipidi droga effetto/risposta (bassa, moderata e alta) per ogni campione, calcolare la concentrazione di particelle della lipoproteina totale, come pure la percentuale del composto totale particelle di VLDL, LDL e HDL sottopopolazioni.</li>
	<li>Plot le popolazioni VLDL, LDL e HDL su un istogramma dell'oggetto ' s brillante campo immagine, larghezza sottratto dalla lunghezza (lunghezza - larghezza) e porta in regioni o globulare o lineare: oggetti con (lunghezza - larghezza) ≤ 2 µm rientrano nella regione globulare per calcolare la percentuale di globulare e lineare a forma particelle.</li>
	<li>Confrontare la percentuale di globulare e lineare a forma HDL e LDL colesterolo particelle identificate per ogni campione di siero incubato con e senza ogni droga. Tra triplici valori ottenuti per ciascun campione di siero, accettare la percentuale di globulare e lineare a forma di particelle di LDL e HDL che rientrano nell'intervallo ± 2 SD per la determinazione dell'effetto della droga.</li>
</ol>

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<li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li>
</ol>

Dr. Madasamy ha ricevuto sovvenzioni da Plaxgen, Inc e ha un interesse finanziario concorrente. Gli altri autori non hanno concorrenti finanziari interessi di divulgare.

In generale, la distribuzione e le proprietà funzionali delle particelle di colesterolo VLDL, LDL e HDL nella circolazione sanguigna sono determinata principalmente dal metaboliche, genetiche, epidemiologici, cellulari e al plasma fattori22,23. Nello studio presente, esaminando gli effetti di dimodificazione farmaci nel buffer ha rivelato che altamente lipofiliche droghe quali ezetimibe, lovastatina, simvastatina e atorvastatina ha indotto un più elevato livello di complessità sulla morfologia delle particelle di colesterolo confrontato all'effetto di livello inferiore osservato con farmaci altamente idrofili di rosuvastatina e fluvastatina. Questi risultati sono in buon accordo con il nostro studio precedente che descrive un meccanismo non-enzimatica basato effetto delle statine nella modulazione della formazione di particelle colesterolo LDL e HDL nel buffer e siero campioni21. Di conseguenza, i risultati dallo studio presente ha rivelato un non-enzimatica meccanismo d'azione di ezetimibe, niacina, fibrata e farmaci di acido grasso omega-3 che possono svolgere un ruolo diretto nella formazione di particelle del colesterolo di modulazione. È possibile che le interazioni tra farmaci e aggregati di colesterolo conduce all'Assemblea delle particelle di colesterolo di grandi dimensioni che sono 2-60 µm2, esibendo morfologie globulare e lineare del filo.
Inoltre, i risultati ottenuti utilizzando particelle della lipoproteina purificata indicano interazioni tra aggregati di colesterolo e di fattori plasmatici tra cui proteine VLDL, LDL e HDL che possono alterare le composizioni e le proprietà morfologiche del colesterolo particelle. I risultati di trattamento della droga che coinvolgono particelle della lipoproteina purificata ha indicato un effetto di droga livello superiore su formazione di particelle di VLDL rispetto al loro effetto osservato su formazione di particelle del colesterolo di LDL. La lovastatina e simvastatina ezetimibe droghe sono state usate come pro-farmaci e loro dosi nei saggi possono essere superiori a concentrazioni fisiologiche.
Interessante, lo screening di campioni di siero hanno mostrati le variazioni dell'effetto della droga su alterare i profili di formazione di particelle di colesterolo VLDL, LDL e HDL, particolarmente il loro effetto sulle formazioni di lineare a forma di particelle di LDL e HDL. Queste droghe ha indotto riduzione il lineare a forma di formazione di particelle colesterolo LDL e HDL in dislipidemia e campioni di siero normali di pari età. Gli effetti di droga osservati sulla riduzione della formazione di particelle a forma lineare era più alta in ezetimibe, simvastatina, lovastatina e la niacina. L'identificazione di particelle di colesterolo con morfologie globulare e lineare del filo in campioni di siero normale e dislipidemia suggerisce che particelle con morfologie simili possono formare in condizioni in vivo . Precedenti studi hanno identificato la presenza del disco e cristalli aghiformi di colesterolo nelle placche aterosclerotiche di umani e ApoE- / - e LDLR- / - topi modelli24,25,26 ,27,28.
Le particelle di HDL circolanti nel sangue esistano come una miscela eterogenea e il livello di particelle di HDL di piccole e grandi dimensioni con attività funzionale sono fattori importanti per esercitare il loro effetto cardio-protettivo tramite il trasporto inverso del colesterolo Via29,30. Recenti studi hanno evidenziato l'importanza dell'identificazione subfractions di particelle di HDL colesterolo per chiarire il loro ruolo nelle funzioni biologiche quali efflusso di colesterolo, anti-infiammatorio, anti-trombotica e anti-ossidativo31 . Inoltre, una serie di studi hanno riferito l'effetto della terapia di riduzione dei lipidi nell'aumento di un livello basso per moderare il livello di HDL nel plasma1,5,21. Di conseguenza, i risultati da questo studio forniscono nuove intuizioni su caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo. In particolare, la rilevazione di un livello superiore di lineare a forma particelle di colesterolo di HDL nei campioni del siero di soggetti di dislipidemia suggerisce che essi possono essere il biomarcatore affidabile per la diagnosi e la valutazione degli effetti di dimodificazione farmaci nei pazienti. Tuttavia, ulteriore indagine è richiesta utilizzando grandi campioni clinici per capire meglio le particelle di colesterolo con morfologie distinte e la loro associazione di CVD.
Nell'analisi di matrice della placca per esaminare l'effetto della droga il montaggio delle particelle di colesterolo, abbiamo usato 2 µ g di fluorescenza etichettato come aggregati di colesterolo e 5 µgof ogni droga perché: (1) farmaci modo competitivo legano entrambi fluorescenza etichettato colesterolo e lipidi endogeni presenti nei campioni del siero; (2) da ciascun campione, abbiamo acquisito da 5.000 a 10.000 particelle di colesterolo che vengono assemblate in grandi dimensioni e forme che vanno da ~ 2-60 µ2; (3) abbiamo osservato un ampie variazioni di risposta ai farmaci tra i campioni di siero incubato con le droghe (dosi 300 ng a 5 µ g) e ~ 1-5% di loro incubate con dosi elevate ha mostrate nessun cambiamento rilevabile nel profilo della formazione di particelle di colesterolo; e (4) l'interazione tra gli aggregati di colesterolo e lipidi droga è mediata da un processo non enzimatico. Quindi, le concentrazioni dei reagenti utilizzati nel test possono essere superiore al loro livello fisiologico.
In conclusione, abbiamo dimostrato con successo i vantaggi di un in vitro imaging metodo descritto in questo studio per determinare l'effetto di un ampio spettro di farmaci ipolipemizzanti sulla modulazione morfologia e composizione del colesterolo particelle. L'approccio di visualizzare e quantificare la morfologia delle particelle lipidiche impiegando una costellazione di algoritmi di analisi di immagine può aiutare sia la diagnosi di aterosclerosi e di valutare i risultati della terapia di riduzione dei lipidi in pazienti.

Numerosi studi clinici hanno dimostrato gli effetti benefici dei farmaci ipolipemizzanti nella riduzione dei livelli plasmatici di colesterolo lipoproteine a bassa densità (LDL) e un basso a moderato livello di aumento del colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL), che previene le incidenze di primarie e secondarie di eventi cardiovascolari avversi correlati aterosclerosi1,2,3,4,5. Le statine, un gruppo di inibitori di HMG-CoA reduttasi enzima, bloccano la sintesi di colesterolo endogeno nel fegato che a sua volta portare ad abbassare livelli circolanti di colesterolo LDL nel sangue6,7. Allo stesso modo, l'effetto di niacina ipolipemizzanti sono mediato da sua inibizione diretta e non competitivo dell'epatocita diacilglicerolo aciltransferasi-2, un enzima del fegato chiave coinvolti nella sintesi di trigliceride8. Comparativamente, ezetimibe riduce il livello del plasma di LDL limitando l'assorbimento del colesterolo esogeno legandosi alla proteina Niemann-Pick C1 1 (NPC1L1) si trova nelle cellule epiteliali del piccolo intestino9. Fenofibrato, un'altra droga di riduzione dei lipidi, riduce sostanzialmente le concentrazioni plasmatiche di trigliceridi e anche moderatamente fa diminuire il colesterolo LDL attraverso le via di recettori proliferator-attivato peroxisome10. Inoltre, acido grasso omega-3 è segnalato per avere l'effetto anti-aterosclerotica grazie alla sua capacità di abbassare i livelli plasmatici di LDL11.
I farmaci ipolipemizzanti, oltre al loro effetto primario sull'abbassamento del colesterolo LDL, hanno un numero di effetti pleiotropici benefici tra cui potenziare il livello di HDL, miglioramento delle funzioni endoteliali, riducendo l'infiammazione e d'inibizione della piastrina le aggregazioni12,13,14. Tuttavia, il meccanismo di fondo di queste droghe in aumento le particelle del colesterolo di HDL e modificare le loro funzioni strutturali non sono completamente capito. Poiché questi farmaci sono ampiamente prescritti per trattare malattie cardiovascolari aterosclerosi (CPV), è essenziale per analizzare ulteriormente il loro possibile ruolo nel determinare le caratteristiche morfologiche e distribuzione delle particelle lipidiche. Il lipidome di plasma umano è costituito da circa 600 lipidi distinti e 22 tipi diversi di molecolari di colesterolo che sono presenti in varie dimensioni, forme, densità e composizioni15,16,17 . Metodi analitici come ultra-centrifugazione, NMR ed elettroforesi del gel di pendenza sono utilizzati per caratterizzare le particelle di LDL e HDL e loro subfractions18,19. Tuttavia, applicazione di questi metodi è limitata agli studi volti a determinare l'effetto delle droghe nel modulare la morfologia e l'assemblaggio delle particelle del lipido. La matrice di base placca citometro a flusso è un'analisi biochimica funzionale sviluppato per rilevazione e visualizzazione del siero derivato del lipido e amiloide placca particelle20. I vantaggi di in vitro metodo descritto in questo studio di imaging consentono l'identificazione del lipido-modulazione degli effetti della droga nell'alterare la morfologia e distribuzione delle particelle di colesterolo in campioni di siero e buffer.

<table><tbody><tr><td>TopFluor colesterolo fluorescente</td><td>Avanti Polar lipidi immagazzinare</td><td></td><td>100 &micro; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>simvastatina (pro-farmaco)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 & micro; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>lovastatina (pro-farmaco)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>rosuvastatina</td><td>Cayman Negozio di prodotti chimici</td><td></td><td>100 &micro; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>atorvastatina</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 & micro; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>fluvastatina</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 & micro; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ezetimibe (pro-farmaco)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td></td><td>Niacina MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>fibrato</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>acido grasso omega-3</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l aliquote a -20 &deg; Proteine</td></tr><tr><td>/particelle VLDL purificate C Proteine/particelle LDL</td> purificate <td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteine/particelle HDL purificate</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero umano abbinato all'età</td><td>Dx Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero per aterosclerosi umana</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero normale umano</td><td>Stanford Pacchetto di</td> reagenti per la misurazione delle LDL per centri <td></td><td></td>trasfusionali</tr><tr><td></td><td>Roche Diangostics</td> Pacchetto di reagenti per la misurazione delle HDL Roche Diangostics <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misurazione del colesterolo totale</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr>Piastre <td></td><td></td><td></td>per<td>microtitolazione a 96 pozzetti</td></tr><tr><td></td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amnis Imaging Citometro a flusso</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini IDEAS</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td><td>Awarness Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effetti differenziali di farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della morfologia delle particelle di colesterolo

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Trattamento della dislipidemia pazienti con farmaci ipolipemizzanti conduce ad una riduzione significativa nel livello di lipoproteine a bassa densità (LDL) e un basso a moderato livello di aumento del colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) nel plasma. Tuttavia, un ruolo possibile di questi farmaci nell'alterare la morfologia e distribuzione delle particelle di colesterolo è capito male. Qui, descriviamo la valutazione in vitro di effetti di farmaci ipolipemizzanti nel modulare le caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo utilizzando il metodo di matrice della placca in combinazione con imaging citometria a flusso. Analisi di immagine delle particelle di colesterolo hanno indicato che la lovastatina, simvastatina ezetimibe e atorvastatina inducono la formazione di particelle a forma di filo lineare e globulare, mentre niacina, fibrati, fluvastatina e rosuvastatina indurre il Formazione di particelle solo a forma globulare. Successiva, molto purificata lipoproteina a bassa densità (VLDL) e particelle di LDL incubate con queste droghe hanno mostrato i cambiamenti nella morfologia e immagine texture di colesterolo sottopopolazioni di particelle. Inoltre, la selezione di 50 campioni di siero ha rivelato la presenza di un livello superiore di lineare a forma particelle di colesterolo di HDL nei soggetti con dislipidemia (media del 18,3%) rispetto ai campioni normali di pari età (una media di 11,1%). Abbiamo anche osservato variazioni considerevoli in effetti ipolipemizzanti di droga sulla riduzione lineare a forma di formazione di particelle colesterolo LDL e HDL in campioni di siero. Questi risultati indicano che farmaci ipolipemizzanti, oltre ai loro effetti ipolipidici cellulo-mediata, direttamente possono modulare la morfologia delle particelle di colesterolo da un meccanismo non-enzimatica dell'azione. I risultati di questi risultati hanno potenziale per informare la diagnosi di aterosclerosi e prevedere la terapia ottimale di riduzione dei lipidi.

L'obiettivo di questo studio era di valutare in vitro riduzione dei lipidi droga effetti nel modulare la morfologia delle particelle di colesterolo. Confronto di farmaci ipolipemizzanti rivelato variazioni nel loro effetto nel modulare le caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo.

Effetti differenziali di farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della morfologia delle particelle di colesterolo

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

L'obiettivo generale di questo studio è valutare l'effetto dei farmaci ipolipemizzanti nella modulazione delle caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo utilizzando un metodo di array di placche e identificare potenziali biomarcatori per la diagnosi di aterosclerosi e determinare gli effetti dei farmaci. Il ruolo dei farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della formazione di particelle di colesterolo è poco compreso. Qui dimostriamo che i farmaci ipolipemizzanti svolgono un ruolo diretto nell'alterare i profili e le caratteristiche morfologiche della formazione delle particelle di colesterolo.Il vantaggio principale del metodo di imaging in vitro basato su array di placche rispetto ad altri metodi di rilevamento delle particelle è che consente la visualizzazione delle particelle di colesterolo per valutare l'effetto dei farmaci ipolipemizzanti nel siero. Jason Lundry, tecnico di laboratorio di Plaxgen, dimostrerà come abbiamo impostato il test dell'array di placche utilizzando un analizzatore chimico. Raymond Kong, senior scientist di Millipore Sigma, dimostrerà come eseguiamo l'elaborazione dei campioni utilizzando la citometria a flusso di imaging.Infine, David Liu, tecnico di laboratorio per Plaxgen, dimostrerà l'analisi dei dati per le immagini delle particelle di colesterolo. Utilizzare un analizzatore chimico-1 per impostare il test dell'array di placche per la formazione di particelle di colesterolo. Durante il test, mantenere il volume di reazione finale in ciascun pozzetto a 200 microlitri ed eseguire tutti i saggi in triplicato.Innanzitutto, caricare 194 virgola cinque microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato, o PDS, su ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo a basso legame proteico. Ad ogni pozzetto, aggiungere due virgola cinque microlitri di ciascuna soluzione di farmaco ipolipemizzante, nessun farmaco viene aggiunto ai campioni di controllo negativi. Quindi, agitare la piastra per 30 secondi, posizionandola sulla piastra di reazione dell'analizzatore chimico-1 per miscelare uniformemente il farmaco in soluzione.Infine, aggiungi due microlitri di soluzione aggregata di colesterolo marcata con fluorescenza a ciascun pozzetto. Agitare la piastra per 30 secondi posizionandola sulla piastra di reazione dell'analizzatore chimico-1 come prima. Quindi, incubare la piastra su un agitatore da laboratorio per due ore impostato a 37 gradi Celsius e 200 giri/min.Dopo l'incubazione, acquisire le immagini delle particelle mediante citometria a flusso. Aprire il modello di acquisizione dati per caricare le impostazioni corrette dello strumento. Fare clic su File, quindi selezionare Carica modello e selezionare il file modello.Fare clic su Carica per preparare lo strumento per il caricamento del campione. Quando si apre la finestra di dialogo Carica campione, fare clic su OK per caricare 50 microlitri di campioni nel citometro a flusso per imaging. Attendi fino a quando le particelle possono essere viste nell'area di imaging in tempo reale.Quando le particelle nell'area di imaging sono a fuoco, fare clic su Acquisisci per acquisire immagini di ciascun oggetto contemporaneamente in modo ad alta produttività per campo scuro, campo chiaro, fluorescenza verde e fluorescenza gialla. Al termine dell'acquisizione, fare clic sul pulsante Restituisci per restituire il campione. Ripetere questi passaggi per acquisire da 5.000 a 10.000 particelle da ciascun campione.Analizza tutti i file di immagine grezza utilizzando il software di analisi delle immagini per determinare l'intensità della fluorescenza dell'oggetto e le variazioni morfologiche, come descritto nel protocollo di testo. Preparare una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a basso contenuto proteico caricando i reagenti in modo graduale, utilizzando un volume di reazione finale di 200 microlitri per pozzetto. Per prima cosa, prepara i pozzetti di controllo.Caricare 193 microlitri di PBS in ogni pozzetto. Aggiungere il 2,5% di siero del paziente, caricando un solo campione di siero per pozzetto. Quindi, agitare la piastra per 30 secondi posizionandola sulla piastra di reazione dell'analizzatore chimico.Quindi, aggiungi due microlitri di soluzione aggregata di colesterolo marcata con fluorescenza in ciascun pozzetto. Ancora una volta, agitare la piastra per 30 secondi posizionandola sulla piastra di reazione dell'analizzatore chimico-1. Per preparare i pozzetti con i farmaci, caricare 191 microlitri di PBS in ciascun pozzetto.Quindi, aggiungere il 2,5% di siero di ciascun paziente per pozzetto e agitare la piastra per 30 secondi, posizionandola su una piastra di reazione dell'analizzatore chimico-1. Aggiungere due microlitri di ezetimibe, lovastatina, simvastatina o soluzione di niacina a tutti i pozzetti tranne i pozzetti di controllo negativo. Aggiunta di un solo farmaco per pozzetto.Procedere ad agitare la piastra per 30 secondi come prima. Quindi, aggiungi due microlitri di soluzione aggregata di colesterolo marcata con fluorescenza in ciascun pozzetto prima di agitare la piastra per 30 secondi. Quindi, incubare la piastra per due ore in un agitatore da laboratorio, impostato a 37 gradi Celsius e 200 giri/min.Dopo l'incubazione, acquisire i campioni mediante citometria a flusso per immagini seguendo le stesse impostazioni di prima. Utilizzare il software di analisi delle immagini per l'elaborazione batch di tutti i file di immagine come descritto nel protocollo di testo. Qui sono mostrati risultati rappresentativi che mostrano l'identificazione di particelle di colesterolo globulari e lineari a forma di filamento, indotte dalle statine, con un meccanismo non enzimatico.Viene mostrata la conferma di due distinte morfologie di formazione di particelle di colesterolo, indotte da altri farmaci ipolipemizzanti. Compresi ezetimibe, niacina, fibrato e acidi grassi omega-3. Qui sono mostrati i dot plot, in cui l'asse X mostra uno spettro di particelle di colesterolo rilevate nel canale di fluorescenza verde.E l'asse Y mostra la dispersione laterale, il gating mostra le regioni di particelle di lipoproteine a densità molto bassa, lipoproteine a bassa densità e lipoproteine ad alta densità, rilevate nei grafici a punti di fluorescenza. Questi risultati dimostrano come l'effetto ipolipemizzante alteri i profili delle particelle di colesterolo VLDL e LDL purificate, in presenza di nessun farmaco, ezemide, lovastatina, simvastatina e niacina. Qui è mostrato uno screening di tre diversi campioni di siero per l'identificazione di un effetto differenziale di vari farmaci ipolipemizzanti, che modulano i profili di formazione di particelle di colesterolo VLDL, LDL e HDL.Questi profili indicano che esiste anche una variazione nei livelli di risposta tra i tre diversi campioni di siero. Lo screening del primo campione di siero per particelle di colesterolo di forma globulare e lineare formate senza il farmaco e in presenza di vari farmaci ipolipemizzanti, conferma due distinte morfologie di particelle di colesterolo derivate dal siero, che mostrano forme di filamenti sia globulari che lineari. Quindi abbiamo dimostrato con successo un approccio di imaging in vitro per l'identificazione dell'effetto dei farmaci ipolipemizzanti, che modula la relazione con la formazione delle particelle di colesterolo e il loro significato clinico.I nostri risultati preliminari sono promettenti e siamo in procinto di convalidare ulteriormente questo test di array di placche utilizzando campioni clinici su larga scala. Il pannello lipidico standard misura i livelli di colesterolo LDL e HDL nel siero. Il nostro test di array di placche spera di migliorare l'accuratezza del rischio di aterosclerosi e prevede la risposta al farmaco ipolipemizzante utilizzando il siero.

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