Effetti differenziali di farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della morfologia delle particelle di colesterolo

L'obiettivo generale di questo studio è valutare l'effetto dei farmaci ipolipemizzanti nella modulazione delle caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo utilizzando un metodo di array di placche e identificare potenziali biomarcatori per la diagnosi di aterosclerosi e determinare gli effetti dei farmaci. Il ruolo dei farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della formazione di particelle di colesterolo è poco compreso. Qui dimostriamo che i farmaci ipolipemizzanti svolgono un ruolo diretto nell'alterare i profili e le caratteristiche morfologiche della formazione delle particelle di colesterolo.

Il vantaggio principale del metodo di imaging in vitro basato su array di placche rispetto ad altri metodi di rilevamento delle particelle è che consente la visualizzazione delle particelle di colesterolo per valutare l'effetto dei farmaci ipolipemizzanti nel siero. Jason Lundry, tecnico di laboratorio di Plaxgen, dimostrerà come abbiamo impostato il test dell'array di placche utilizzando un analizzatore chimico. Raymond Kong, senior scientist di Millipore Sigma, dimostrerà come eseguiamo l'elaborazione dei campioni utilizzando la citometria a flusso di imaging.

Infine, David Liu, tecnico di laboratorio per Plaxgen, dimostrerà l'analisi dei dati per le immagini delle particelle di colesterolo. Utilizzare un analizzatore chimico-1 per impostare il test dell'array di placche per la formazione di particelle di colesterolo. Durante il test, mantenere il volume di reazione finale in ciascun pozzetto a 200 microlitri ed eseguire tutti i saggi in triplicato.

Innanzitutto, caricare 194 virgola cinque microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato, o PDS, su ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo a basso legame proteico. Ad ogni pozzetto, aggiungere due virgola cinque microlitri di ciascuna soluzione di farmaco ipolipemizzante, nessun farmaco viene aggiunto ai campioni di controllo negativi. Quindi, agitare la piastra per 30 secondi, posizionandola sulla piastra di reazione dell'analizzatore chimico-1 per miscelare uniformemente il farmaco in soluzione.

Infine, aggiungi due microlitri di soluzione aggregata di colesterolo marcata con fluorescenza a ciascun pozzetto. Agitare la piastra per 30 secondi posizionandola sulla piastra di reazione dell'analizzatore chimico-1 come prima. Quindi, incubare la piastra su un agitatore da laboratorio per due ore impostato a 37 gradi Celsius e 200 giri/min.

Dopo l'incubazione, acquisire le immagini delle particelle mediante citometria a flusso. Aprire il modello di acquisizione dati per caricare le impostazioni corrette dello strumento. Fare clic su File, quindi selezionare Carica modello e selezionare il file modello.

Fare clic su Carica per preparare lo strumento per il caricamento del campione. Quando si apre la finestra di dialogo Carica campione, fare clic su OK per caricare 50 microlitri di campioni nel citometro a flusso per imaging. Attendi fino a quando le particelle possono essere viste nell'area di imaging in tempo reale.

Quando le particelle nell'area di imaging sono a fuoco, fare clic su Acquisisci per acquisire immagini di ciascun oggetto contemporaneamente in modo ad alta produttività per campo scuro, campo chiaro, fluorescenza verde e fluorescenza gialla. Al termine dell'acquisizione, fare clic sul pulsante Restituisci per restituire il campione. Ripetere questi passaggi per acquisire da 5.000 a 10.000 particelle da ciascun campione.

Analizza tutti i file di immagine grezza utilizzando il software di analisi delle immagini per determinare l'intensità della fluorescenza dell'oggetto e le variazioni morfologiche, come descritto nel protocollo di testo. Preparare una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a basso contenuto proteico caricando i reagenti in modo graduale, utilizzando un volume di reazione finale di 200 microlitri per pozzetto. Per prima cosa, prepara i pozzetti di controllo.

Caricare 193 microlitri di PBS in ogni pozzetto. Aggiungere il 2,5% di siero del paziente, caricando un solo campione di siero per pozzetto. Quindi, agitare la piastra per 30 secondi posizionandola sulla piastra di reazione dell'analizzatore chimico.

Quindi, aggiungi due microlitri di soluzione aggregata di colesterolo marcata con fluorescenza in ciascun pozzetto. Ancora una volta, agitare la piastra per 30 secondi posizionandola sulla piastra di reazione dell'analizzatore chimico-1. Per preparare i pozzetti con i farmaci, caricare 191 microlitri di PBS in ciascun pozzetto.

Quindi, aggiungere il 2,5% di siero di ciascun paziente per pozzetto e agitare la piastra per 30 secondi, posizionandola su una piastra di reazione dell'analizzatore chimico-1. Aggiungere due microlitri di ezetimibe, lovastatina, simvastatina o soluzione di niacina a tutti i pozzetti tranne i pozzetti di controllo negativo. Aggiunta di un solo farmaco per pozzetto.

Procedere ad agitare la piastra per 30 secondi come prima. Quindi, aggiungi due microlitri di soluzione aggregata di colesterolo marcata con fluorescenza in ciascun pozzetto prima di agitare la piastra per 30 secondi. Quindi, incubare la piastra per due ore in un agitatore da laboratorio, impostato a 37 gradi Celsius e 200 giri/min.

Dopo l'incubazione, acquisire i campioni mediante citometria a flusso per immagini seguendo le stesse impostazioni di prima. Utilizzare il software di analisi delle immagini per l'elaborazione batch di tutti i file di immagine come descritto nel protocollo di testo. Qui sono mostrati risultati rappresentativi che mostrano l'identificazione di particelle di colesterolo globulari e lineari a forma di filamento, indotte dalle statine, con un meccanismo non enzimatico.

Viene mostrata la conferma di due distinte morfologie di formazione di particelle di colesterolo, indotte da altri farmaci ipolipemizzanti. Compresi ezetimibe, niacina, fibrato e acidi grassi omega-3. Qui sono mostrati i dot plot, in cui l'asse X mostra uno spettro di particelle di colesterolo rilevate nel canale di fluorescenza verde.

E l'asse Y mostra la dispersione laterale, il gating mostra le regioni di particelle di lipoproteine a densità molto bassa, lipoproteine a bassa densità e lipoproteine ad alta densità, rilevate nei grafici a punti di fluorescenza. Questi risultati dimostrano come l'effetto ipolipemizzante alteri i profili delle particelle di colesterolo VLDL e LDL purificate, in presenza di nessun farmaco, ezemide, lovastatina, simvastatina e niacina. Qui è mostrato uno screening di tre diversi campioni di siero per l'identificazione di un effetto differenziale di vari farmaci ipolipemizzanti, che modulano i profili di formazione di particelle di colesterolo VLDL, LDL e HDL.

Questi profili indicano che esiste anche una variazione nei livelli di risposta tra i tre diversi campioni di siero. Lo screening del primo campione di siero per particelle di colesterolo di forma globulare e lineare formate senza il farmaco e in presenza di vari farmaci ipolipemizzanti, conferma due distinte morfologie di particelle di colesterolo derivate dal siero, che mostrano forme di filamenti sia globulari che lineari. Quindi abbiamo dimostrato con successo un approccio di imaging in vitro per l'identificazione dell'effetto dei farmaci ipolipemizzanti, che modula la relazione con la formazione delle particelle di colesterolo e il loro significato clinico.

I nostri risultati preliminari sono promettenti e siamo in procinto di convalidare ulteriormente questo test di array di placche utilizzando campioni clinici su larga scala. Il pannello lipidico standard misura i livelli di colesterolo LDL e HDL nel siero. Il nostro test di array di placche spera di migliorare l'accuratezza del rischio di aterosclerosi e prevede la risposta al farmaco ipolipemizzante utilizzando il siero.