Valutare Specificità di farmaci antitumorali In Vitro

L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare la specificità dei farmaci antitumorali in vitro utilizzando colture miste contenenti cellule sia tumorali e non tumorali.

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la variazione di proporzione dose-dipendente delle cellule tumorali in una coltura contenente sia cellule tumorali che non tumorali. Questo metodo fornisce uno strumento genetico per valutare l'effetto in vitro e la specificità dei farmaci antitumorali. Ha un potenziale applicativo nella scoperta di farmaci e nella cura personalizzata del cancro.

Il principale vantaggio di questo metodo è che quando il farmaco antitumorale viene testato in una coltura contenente sia cellule tumorali che non tumorali, la risposta delle cellule tumorali può essere separata da quella delle cellule non tumorali. A dimostrare questa procedura sarà Eena, un tecnico del mio laboratorio. Iniziare questa procedura coltivando sia le cellule tumorali che i fibroblasti in un terreno DMA standard a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte.

Alla subconfluenza, raccogliere le cellule con lo 0,05% di tripsina e contarle utilizzando un emocitometro. Successivamente, mescolare 400 cellule tumorali e 1.600 cellule non tumorali in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti con 0,2 mL di terreno e impostare quattro repliche per ogni concentrazione di farmaco. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica durante la notte.

Quindi, preparare le soluzioni madre di Nilotinib in DMSO a 0, 2, 4 e 20 mM. Diluire ciascuno di essi con 200 volte in 5 mL di terreno DMA dando due soluzioni farmacologiche concentrate di 0, 10, 20 e 100 uM. Quindi, rimuovere 0,1 ml di terreno da ciascun pozzetto.

Aggiungere 0,1 mL di terreno contenente il farmaco e continuare a incubare le cellule per cinque giorni. Al termine del trattamento, ispezionare le cellule attaccate utilizzando un microscopio a contrasto facciale e scattare delle foto. Aspirare il terreno e lavare una volta le cellule adesive sopravvissute con 0,2 mL di PBS.

Per lisare le cellule utilizzando il metodo HotSHOT, aggiungere 50 uL di soluzione di lisi alcalina a ciascun pozzetto. Sigillare i pozzetti con un foglio. Quindi incubare la piastra a 95 gradi Celsius in forno o su una piastra riscaldante per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, controllare al microscopio per assicurarsi che non siano rimaste più cellule intatte sulla superficie dei pozzetti. Nel caso in cui le celle non si siano lisate completamente, aumentare il tempo di riscaldamento o aggiungere detersivo. Congelarli una volta a 20 gradi Celsius migliora anche la rottura delle cellule.

Successivamente, aggiungere 50 uL della soluzione neutralizzante a ciascun pozzetto, quindi trasferire tutti i lisati nei pozzetti a forma di U di una piastra PCR e asciugarli in un ciclatore PCR a 95 gradi Celsius per 10-30 minuti. Successivamente, ricostituire i lisati con 20 uL di acqua distillata. Per desalinizzare il DNA utilizzando la dialisi a goccia, dividere un filtro a membrana di 25 mm di diametro in quattro aree e numerare le aree.

Far galleggiare i filtri su acqua distillata con il lato lucido rivolto verso l'alto in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Quindi ipotare accuratamente il lisato ricostituito da 20 uL sul filtro. Coprire il piatto e dializzare per 30-60 minuti.

Successivamente aspirare l'acqua sotto il filtro senza capovolgere il filtro o disturbare le gocce. Trasferire le gocce di lisato nei pozzetti di una nuova piastra PCR. Successivamente, asciugare le gocce di DNA riscaldando la piastra a 95 gradi Celsius per 10-30 minuti in un ciclatore PCR.

Quindi ricostituire i lisati in 10 uL di acqua. Quindi prepara la miscela master per il tuo contenente tutti i componenti tranne il DNA per la reazione PCR digitale della sonda a duello. Agitare e centrifugare la miscela master per 10 secondi alla massima forza nella centrifuga ed erogare 15 uL di miscela in ciascun pozzetto di una piastra da 96 PCR.

Aggiungere il lisato di ciascun campione ai pozzetti contenenti la miscela master. Trasferire 20 uL di ciascuna miscela di reazione nel pozzetto sul lato del campione di una cartuccia a temperatura ambiente. Quindi, erogare 70 uL di olio generatore di goccioline in ciascun pozzetto sul lato dell'olio di una cartuccia.

Chiudere la cartuccia con una guarnizione e posizionare l'intera impostazione in un generatore di goccioline prima di iniziare la generazione di goccioline. Successivamente trasferire 40 uL di soluzione di gocce in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Sigillare la piastra con un foglio di alluminio e posizionare la piastra in un ciclatore PCR.

Quindi, impostare la temperatura del coperchio a 105 gradi Celsius e la velocità di rampa a 2 gradi Celsius al secondo. Al termine, trasferire la piastra in un lettore di gocce e iniziare la lettura. In alternativa, conservare la piastra a 4 gradi Celsius per un massimo di 24 ore.

Ora carica i dati della PCR digitale ed esegui l'analisi automatica. Ispezionare manualmente i campioni per assicurarsi che le goccioline positive e negative siano ben separate. Escludere da ulteriori analisi i campioni che non presentano una netta separazione delle goccioline positive e negative.

Copiare il rapporto risultante tra NF1 e RPP30 in un foglio Excel. Quindi, calcola la proporzione delle cellule tumorali. Per ogni concentrazione di farmaco, calcolare la media e la deviazione standard dalle quattro repliche, quindi tracciare le medie e le deviazioni standard rispetto alle concentrazioni di farmaci.

Qui è mostrata la riduzione dose-dipendente delle cellule vitali visibili. La proporzione di cellule tumorali calcolata dal rapporto tra NF1 e RPP30 è diminuita nell'intervallo da 0 a 10 uM. Alla dose massima di 50 uM sono rimaste poche cellule vitali, probabilmente a causa di un effetto tossico per tutte le cellule.

La vitalità e la proliferazione delle cellule totali possono essere misurate utilizzando saggi convenzionali, ma la proporzione di cellule tumorali può essere determinata utilizzando la procedura dimostrata nel presente studio. Utilizzando i due parametri, la risposta cellulare totale a un farmaco in una coltura mista può essere suddivisa in risposta delle cellule tumorali e risposta delle cellule non tumorali. L'intera procedura di test può essere eseguita in una settimana, compreso il periodo di trattamento di cinque giorni.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che il rapporto tra il gene bersaglio e il gene di inversione varia. Stiamo assistendo a un intervallo molto ristretto, compreso tra 0 e 1, e quindi la precisione è essenziale. La valutazione tra i campioni e nella manipolazione dovrebbe essere ridotta per quanto possibile.

Seguendo questa procedura, anche le colture primarie che contengono sia cellule tumorali che cellule non tumorali possono essere utilizzate per testare l'effetto e la specificità dei farmaci antitumorali. Inoltre, l'effetto di un farmaco su una certa sottopopolazione di cellule con alterazione genetica definita può essere valutato in modo specifico. Spero che questo video ti aiuti a capire come utilizzare la funzione genetica per determinare la proporzione di cellule tumorali in un campione o in una coltura che contiene sia cellule tumorali che cellule non tumorali.