Ottimizzato colorazione negativa: un protocollo ad alta velocità per l'esame di piccole e asimmetrica Protein Structure da microscopia elettronica

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini di proteine piccole e asimmetriche mediante un protocollo ottimizzato ad alto rendimento di microscopia elettronica con colorazione negativa. Ciò si ottiene innanzitutto incubando la proteina in una stazione di incubazione preparata, mentre si allestisce una postazione per la colorazione negativa. Il secondo passaggio della procedura consiste nel lavare rapidamente il campione su tre gocce d'acqua in sequenza.

Il terzo passaggio consiste nel colorare attentamente il campione su tre gocce di colorante in sequenza. L'ultimo passaggio prevede la rimozione della soluzione in eccesso tamponando dal lato posteriore della griglia per microscopia elettronica e successivamente asciugando delicatamente sotto flusso di gas azoto. Alla fine, i risultati possono mostrare immagini ad alta risoluzione di proteine piccole mediante imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) in condizioni di basso defuoco.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla microscopia elettronica criogenica è che consente un'analisi ad alto rendimento e un'immagine ad alto contrasto di strutture proteiche piccole e asimmetriche, riducendo al contempo gli artefatti strutturali tipici della colorazione negativa convenzionale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla base strutturale dei meccanismi di proteine piccole, come la proteina trasferitrice di esteri del colesterolo.

È inoltre applicabile ad altre proteine, come l'IgG, un anticorpo, la lipoproteina ad alta densità e il proteasoma, che variano notevolmente per dimensioni. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di lavaggio e colorazione sono difficili da apprendere a causa delle variazioni nei tempi e anche la rimozione del campione con carta da filtro può provocare effetti notevoli sulla proteina colorata finale. La procedura sarà illustrata da Z.A., ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Quando si prepara questo protocollo, è necessario preparare una soluzione al 1% di formalina con la massima attenzione a ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

Questo include l'avvolgimento delle parti del filtro da 0,2 micron per siringa in foglio di alluminio quando è il momento di filtrare per la prima volta la soluzione. Dopo la filtrazione, conservare aliquote da due millilitri in vial avvolti in alluminio a meno 80 gradi Celsius nel giorno dell'esperimento. Scongelare un'aliquote in un bagno d'acqua a temperatura ambiente una volta completamente scongelata.

Filtrare nuovamente attraverso un filtro da 0,02 micron con le parti avvolte nella stagnola. Anche il contenitore per la raccolta dovrebbe essere avvolto nella stagnola. Trasferire la colorazione negativa in un contenitore con ghiaccio fino al momento dell'utilizzo.

Preparare un foglio portagocce premendo un tratto lungo otto pollici di param su un supporto per punte di pipetta. Questo crea delle ammaccature che fungono da pozzetti di diametro pari a cinque millimetri. Dopo aver realizzato sei file di pozzetti, appiattire il ghiaccio sulla superficie di un vassoio in polistirolo, quindi posizionare il foglio sul ghiaccio.

Successivamente, aggiungere 35 microlitri di acqua deionizzata nelle prime tre pozzette del foglio sul lato sinistro. Poi caricare le tre pozzette a destra del foglio con 35 microlitri della soluzione di colorazione negativa preparata. Coprire il vassoio per ridurre al minimo l'esposizione della soluzione alla luce.

Questo servirà come stazione di colorazione. Preparare ora una stazione di incubazione per griglie EM utilizzando una scatola vuota di punte di pipetta, dotata di un supporto su cui possono essere montate delle pinzette. Riempire la scatola fino a metà con del ghiaccio, in modo che la superficie del ghiaccio sia vicina alla punta delle pinzette quando queste sono montate.

Prima eseguire una scarica al plasma sulle griglie di microscopia elettronica in rame da 300 mesh rivestite con uno strato sottile di carbonio per circa 10 secondi. Successivamente, prendere una griglia con una pinzetta che si aggancia alla stazione di incubazione per griglie di microscopia elettronica. Appendere la pinzetta con la griglia in modo che la griglia sia inclinata di 45 gradi e posta a mezzo pollice sopra il ghiaccio.

Ora diluire il campione proteico in DPBS a 50-100 microgrammi di proteina per millilitro di soluzione. Applicare immediatamente circa quattro microlitri della diluizione sulla griglia per microscopia elettronica (EM). Lasciare incubare il campione per circa un minuto.

Dopo un minuto, tamponare rapidamente la griglia con carta da filtro per rimuovere la soluzione in eccesso. Quindi, alla stazione di colorazione, toccare la griglia con la prima goccia d'acqua sul film para. Ripetere rapidamente il processo di asciugatura del filtro e di applicazione con la goccia successiva.

Utilizzare un totale di tre gocce d'acqua e procedere il più rapidamente possibile. Il lavaggio della griglia con acqua deve essere eseguito rapidamente per evitare effetti avversi derivanti dal cambiamento di tampone sulla proteina. Dopo aver asciugato l'ultima fase di lavaggio entro tre secondi, iniziare a far galleggiare la griglia sulla prima goccia di soluzione per la colorazione negativa.

Lasciarlo galleggiare per 10 secondi. Nel frattempo, pulire le pinzette premendo le punte sulla carta filtro. Dopo circa dieci secondi, asciugare la soluzione con la carta filtro alcune volte e iniziare un nuovo galleggiamento nella successiva goccia di colorante per due secondi.

Pulire le pinzette durante i due secondi. Successivamente, asciugare delicatamente la griglia e posizionarla sulla terza goccia. Coprire la stazione di colorazione per un minuto intero durante questo passaggio.

La rimozione del colorante deve essere eseguita toccando il retro della griglia EM per un tempo preciso, al fine di garantire un'essiccazione uniforme della griglia. Se la carta filtrante tocca il colorante per troppo tempo, potrebbe essere rimosso troppo colorante, compromettendo la qualità dell'immagine. Successivamente, procedere con l'essiccazione della griglia.

Prima, appoggiare tutta la superficie non carbonata sulla carta da filtro finché la soluzione non viene trasferita. In secondo luogo, applicare un flusso delicato di gas azoto. Ora trasferire la griglia in una capsula contenente carta da filtro e coprire parzialmente la capsula.

Lasciare asciugare la griglia nella piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. In alternativa, i campioni contenenti lipidi possono essere essiccati a 40 gradi Celsius per un'ora. Una volta completamente asciutti, trasferire la griglia per microscopia elettronica (EM) in una scatola per il suo stoccaggio, quindi procedere innanzitutto all'allineamento del microscopio elettronico a trasmissione (TEM).

Verificare la risoluzione dell'anello di disgelo più esterno visibile mediante lo spettro di potenza di un'area del film di carbonio della griglia colorata negativamente, che dovrebbe essere migliore della risoluzione target. Quindi, per regolare l'allineamento, controllare attentamente lo spettro di potenza sull'area del film di carbonio del campione. In condizioni di allineamento corretto, è possibile visualizzare più di 20 anelli T tho, il che corrisponde a una risoluzione migliore di cinque angstrom.

Gli anelli sono stati realizzati mediante trasferimento da pelliccia di un'immagine in carbonio amorfo in condizioni di fuori fuoco di 1,6 micron e con una dose di 20,4 elettroni per Ångström quadrato. Ora riportare il fuoco a una condizione prossima al fuoco di Scherzer, pari a circa 0,1 micron, per l'immagine di proteine piccole durante l'esame della griglia al microscopio elettronico. Idealmente, le aree colorate si trovano di solito vicino al bordo di aree nuvolose più spesse e colorate, a basso ingrandimento.

La struttura di campioni di lipoproteine è stata osservata mediante OPNS. Esempi includono HDL ricombinante, plasma umano, LDL, IDL del plasma umano e VLDL del plasma umano. Sono state osservate anche strutture più piccole, come CETP da 53 chilodalton.

Questa è una delle più piccole proteine mai visualizzate con successo mediante eem. La sovrapposizione della struttura cristallina del CETP corrisponde molto bene all'immagine, estremamente dinamica. Sono state inoltre osservate proteine eterogenee negli anticorpi di immunoglobulina G di 160 chilodalton.

Tre sottodomini erano chiaramente visibili. Un esame più ravvicinato dell'anticorpo IgG uno è stato effettuato per confrontarlo con la sua struttura cristallina. La struttura cristallina dell'anticorpo IgG uno corrisponde alla vista ottenuta tramite microscopia elettronica di questi anticorpi in molti aspetti, come nelle posizioni dei domini e nelle loro forme.

Le altre molecole osservate includono l'apolipoproteina A1 libera da lipidi di 28 kilodalton, l'EL e i proteasomi. In sostanza, il metodo OPNS migliora notevolmente i limiti dell'imaging in microscopia elettronica per strutture asimmetriche di piccole dimensioni, nonché per gli studi meccanicistici associati. Durante l'esecuzione della procedura, è fondamentale ridurre al minimo l'esposizione alla luce del reagente di contrasto, lavare rapidamente il campione ed utilizzare una messa a fuoco vicina al fuoco di diffrazione per l'acquisizione delle immagini.

Altri metodi, come la tomografia elettronica, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio le strutture di singole molecole a risoluzione nanometrica e i cambiamenti conformazionali tra esse. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale per esplorare i trasferimenti di esteri all'interno dei cluster tra le lipoproteine plasmatiche umane.