Ottimizzato colorazione negativa: un protocollo ad alta velocità per l'esame di piccole e asimmetrica Protein Structure da microscopia elettronica

Più della metà delle proteine ​​sono piccole proteine ​​(massa molecolare <200 kDa) che stanno sfidando per entrambi microscopio elettronico di immagini e ricostruzioni tridimensionali. Ottimizzato colorazione negativa è un protocollo robusto e high-throughput per ottenere un elevato contrasto e immagini di piccole proteine ​​o complessi asimmetrici in diverse condizioni fisiologiche relativamente alta risoluzione (~ 1 nm).

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare proteine piccole e asimmetriche utilizzando un protocollo ottimizzato ad alto rendimento di microscopia elettronica a colorazione negativa. Ciò si ottiene incubando prima la proteina in una stazione di incubazione preparata mentre si prepara una stazione di lavoro con colorazione negativa. Il secondo passo della procedura consiste nel lavare rapidamente il campione su tre goccioline d'acqua in sequenza.

Il terzo passaggio consiste nel colorare accuratamente il campione su tre goccioline di colorazione in sequenza. Il passaggio finale consiste nel rimuovere la soluzione in eccesso tamponando dal retro della griglia EM e quindi asciugando delicatamente sotto azoto gassoso. In definitiva, i risultati possono mostrare immagini ad alta risoluzione di piccole proteine attraverso l'imaging TEM in una condizione di bassa sfocatura.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla criomicroscopica è impostato. Può consentire un esame ad alto rendimento e l'imaging ad alto contrasto di strutture proteiche piccole e asimmetriche, riducendo al contempo gli artefatti strutturali derivanti dalla colorazione negativa convenzionale. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla base strutturale di piccoli meccanismi proteici come la proteina di trasferimento dell'estere del colesterolo.

Può anche essere applicato ad altre proteine come IgG, un anticorpo, una lipoproteina ad alta densità e il proteasoma, che variano ampiamente in dimensioni. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di lavaggio e colorazione sono difficili da imparare a causa della variazione dei tempi e anche il blotting del campione può causare effetti drammatici nella proteina colorata finita La dimostrazione della procedura mancherà tra i ricercatori Z.A del mio laboratorio. Quando ci si prepara per questo protocollo, è necessario preparare una soluzione all'1% di orinatoio forma otto con la massima attenzione a ridurre al minimo la sua esposizione alla luce.

Ciò include l'avvolgimento della siringa N 0,2 micron delle parti del filtro in un foglio quando è il momento di filtrare per la prima volta la soluzione. Dopo il filtraggio, conservare due aliquote di fiale avvolte in un foglio di alluminio da un millilitro a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius il giorno dell'esperimento. Scongelare un'aliquota in un bagnomaria a temperatura ambiente una volta completamente scongelata.

Filtrarlo nuovamente attraverso un filtro da 0,02 micron con parti avvolte in un foglio. Anche il flaconcino di raccolta deve essere avvolto in un foglio di alluminio. Trasferisci la macchia negativa in una ghiacciaia fino a quando non viene utilizzata.

Creare un foglio di tenuta per goccioline premendo un param di otto pollici su un supporto per la punta della pipetta. Questo crea rientranze stradali che fungono da pozzi di cinque millimetri di diametro. Dopo aver realizzato sei file di pozzetti, appiattisci il ghiaccio sulla superficie di un vassoio di polistirolo, quindi posiziona il foglio sul ghiaccio.

Quindi, aggiungi 35 microlitri di acqua deionizzata nei primi tre pozzetti del foglio sul lato sinistro. Quindi caricare i tre pozzetti destri nel foglio con 35 microlitri della soluzione di colorazione negativa preparata. Coprire il vassoio per ridurre al minimo l'esposizione alla luce della soluzione.

Questo servirà come stazione di colorazione. Ora prepara una stazione di incubazione a griglia EM da una scatola di puntali per pipette vuota con un attacco su cui possono essere montate le pinzette. Riempi la scatola a metà con il ghiaccio in modo che la superficie del ghiaccio sia vicina alla punta delle pinzette quando sono montate.

Il primo bagliore scarica le sottili griglie EM in rame da 300 maglie rivestite di carbonio per circa 10 secondi. Successivamente, raccogli una griglia con una pinzetta che si aggancia alla stazione di incubazione della griglia EM. Appendere le pinzette con la griglia, in modo che la griglia sia inclinata di 45 gradi mezzo pollice sopra il ghiaccio.

Ora diluire il campione di proteine in DPBS a 50-100 microgrammi di proteine per millilitro di soluzione. Applicare immediatamente circa quattro microlitri di diluizione alla griglia EM. Lasciare incubare il campione per circa un minuto.

Dopo un minuto, tamponare rapidamente la rete con carta da filtro per rimuovere la soluzione in eccesso. E poi alla stazione di colorazione, toccare la rete con la prima goccia d'acqua sulla pellicola para. Ripetere rapidamente il processo di asciugatura del filtro e di macerazione con la goccia successiva.

Usa un totale di tre gocce d'acqua e fallo il più rapidamente possibile. Il lavaggio della griglia con acqua deve essere effettuato rapidamente per evitare effetti negativi del cambio del tampone sulla proteina. Dopo aver tamponato l'ultimo lavaggio entro tre secondi, inizia a far galleggiare la griglia sulla prima goccia di soluzione colorante negativa.

Lascialo galleggiare lì per 10 secondi. Nel frattempo, pulisci le pinzette premendo le punte sulla carta da filtro. Un paio di volte dopo i dieci secondi di galleggiamento, tamponare la soluzione con carta da filtro e iniziare un altro galleggiante nella successiva goccia di macchia per due secondi.

Pulisci le pinzette durante i due secondi. Quindi, asciuga la griglia e mettila sulla terza gocciolina. Per un minuto intero, coprire la stazione di colorazione durante questa fase.

La rimozione della macchia deve essere effettuata toccando la parte posteriore della griglia EM per un periodo di tempo preciso per garantire che la griglia si asciughi in modo uniforme. Se la carta da filtro tocca la macchia troppo a lungo, potrebbe essere rimossa troppa macchia portando a un'immagine scadente. Successivamente, procedere con l'asciugatura della griglia.

Per prima cosa, tocca l'intero lato non carbonico con la carta da filtro fino a quando la soluzione non si trasferisce. In secondo luogo, applicare un flusso delicato di azoto gassoso. Ora trasferisci la griglia su una pirofila foderata con carta da filtro e copri parzialmente la pirofila.

Lasciare asciugare la griglia nella pirofila per 30 minuti a temperatura ambiente. In alternativa, i campioni contenenti lipidi possono essere cotti a 40 gradi Celsius per un'ora. Una volta completamente asciugata, trasferire la griglia EM in una scatola di stoccaggio della rete EM prima di iniziare ad allineare il TEM.

Controllare la risoluzione dell'anello di disgelo visibile più alto con lo spettro di potenza di un'area del film di carbonio della griglia colorata negativamente, che dovrebbe essere migliore della risoluzione prevista. Quindi, per regolare l'allineamento, controllare attentamente lo spettro di potenza sull'area del film di carbonio del campione. In una condizione correttamente allineata, è possibile visualizzare più di 20 anelli a T, il che corrisponde a una visualizzazione migliore di cinque angstrom.

Gli anelli sono stati realizzati mediante trasferimento di un'immagine di carbonio amorfo sotto una sfocatura di 1,6 micron e una dose di 20,4 elettroni per quadrato. Angstrom. Ora riportare la messa a fuoco su una condizione di messa a fuoco vicina a quella di Scherzer, circa 0,1 micrometri per l'imaging di piccole proteine, durante l'esame della griglia EM. Idealmente, le aree colorate sono solitamente vicino al bordo di aree nuvolose macchiate più spesse a basso ingrandimento.

La struttura dei campioni di lipoproteine è stata osservata con OPNS. Gli esempi includono HDL ricombinante, plasma umano, LDL, IDL plasmatico umano e VLDL plasmatico umano. Sono state osservate anche strutture più piccole come 53 kilodalton, CETP.

Questa è una delle proteine più piccole riprodotte con successo da eem. La sovrapposizione della struttura cristallina CETP si abbina molto bene all'immagine, molto dinamica. Proteine eterogenee sono state osservate anche in 160 anticorpi immunoglobuline G kilodalton.

Tre sottodomini erano chiaramente visibili. Un esame più attento dell'anticorpo IgG one è stato utilizzato per fare un confronto con la sua struttura cristallina. La struttura cristallina dell'anticorpo IgG one corrisponde alla visione EM di questi anticorpi in molti modi, ad esempio nelle posizioni del dominio e nelle loro forme.

Altre molecole visualizzate includono 28 kilodalton, lipoproteina A a crescita EL senza lipidi e proteasomi. In sostanza, il metodo OPNS fa avanzare in modo significativo il limite dell'imaging EM per piccole strutture asimmetriche e per gli studi meccanicistici associati durante il tentativo della procedura. È importante ridurre il più possibile l'esposizione alla luce al reagente colorante per lavare rapidamente il campione e utilizzare la messa a fuoco del tesoro per l'imaging Dopo questa procedura, è importante ridurre il più possibile l'esposizione alla luce del reagente per la colorazione.

Altri metodi, come la tomografia elettronica, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come le strutture di risoluzione nanometrica delle singole molecole e i cambiamenti di conferma tra di esse. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale per esplorare i magneti di un trasferimento di esteri a grappolo tra le lipoproteine plasmatiche umane.