Biosintesi di un flavonolo da un Flavanone stabilendo una cascata bienzimatica a un vaso

Utilizzando questo protocollo, possiamo facilmente produrre un bel numero di flavonoli da flavanone in un unico vaso. Questa tecnica consente di risparmiare manodopera e tempo, è altamente economica e facile da controllare, quindi ha un enorme potenziale di industrializzazione. Sì, questo metodo può fornire informazioni sulla produzione economica di altri metaboliti secondari, ma ha bisogno di alcune modifiche se applicato ad esso.

Di solito non otteniamo nulla o un rendimento molto basso. Il mio consiglio è di gestire gli enzimi ricombinanti sul ghiaccio e aggiungere il 10% di glicerina alla soluzione stock di enzimi. Questo perché solo attraverso la dimostrazione visiva una nuova mano può comprendere i dettagli importanti e la verità che influenzano l'esecuzione riuscita dell'esperimento.

Preparare innanzitutto i buffer. Fare due volte tampone sintetico sciogliendo la quantità appropriata di base TRIS, ascorbato di sodio, acido chetoglutarico alfa in acqua deionizzata e pipetta quantità appropriata di glicerolo alla soluzione. Utilizzare una pipetta per aggiungere acido cloridrico per regolare il pH a 7,2 e regolare il volume aggiungendo acqua deionizzata.

Conservare il buffer due volte sintetico a quattro gradi Celsius per un uso futuro. Quindi fare una soluzione 100 volte stock sciogliendo l'eptaidrato di solfato ferroso in acqua deionizzata. Fare una soluzione stock di flavonoide millimolare sciogliendo il flavonoide nel metanolo e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius.

Il passo più critico è quello di creare un sistema sintetico. Per impostare un sistema sintetico per produrre un flavanolo da un flavanone, preparare prima il sistema sintetico in un tubo a due millilitri secondo i reagenti elencati in questa tabella. Posizionare il tubo aperto in un blocco di calore tremante a 40 gradi Celsius, a 600 giri/min per quaranta minuti.

Successivamente, terminare la reazione aggiungendo 10 microlitri di acido acetico e 100 microlitri di acetato di etile. Due ore dopo, utilizzare una pipetta per trasferare la fase organica superiore a un tubo da 1,5 millilitri e posizionare il tubo in una cappa per l'asciugatura ad aria a temperatura ambiente. Per eseguire l'analisi TLC, recuperare prima i tubi dalla cappa e riassolvere la polvere flavanoide in 160 microlitri di metanolo in un tubo.

Preparare autentici campioni di flavonoidi con concentrazioni seriali, diluire la soluzione di 25 millimolare di materiale flavonoide in metanolo. Caricare un microlitro del campione di reazione riassociato e un microlitro dell'autentico campione di flavonoide su una piastra di poliammide. Fare lo stesso per le altre concentrazioni di flavonoide autentico sulla stessa piastra.

Quindi, in una cappa aspirante, mettere la piastra caricata nel campione in un cilindro di cromatografia riempito con un sistema a solvente. Attaccare la piastra sul fondo del cilindro e far funzionare la piastra nel sistema solvente per 20 minuti. Asciugare all'aria le piastre a temperatura ambiente.

Con un flacone spruzzatore, spruzzare le piastre con soluzione etanolalica all'1% di cloruro di alluminio, seguita da asciugatura ad aria di nuovo a temperatura ambiente per 30 minuti. Visualizza le macchie sulle piastre sotto una luce UV a 254 nanometri e scatta immagini, quindi sul computer, apri il software ImageJ. Fare clic su file, apri, per aprire l'immagine da analizzare.

Fare clic nello strumento di selezione più rettangolare a sinistra nell'interfaccia utente ImageJ. Delineare il ROI nell'immagine con il mouse e premerne uno per etichettare il primo ROI. Spostare la selezione rettangolare con il mouse a destra sul ROI successivo e premere due per etichettare il secondo ROI.

Ripetere l'etichetta per etichettare tutte le altre ROM premendo due. Premere tre per generare grafici di profili per tutte le ROM, in una finestra popup. Quindi, utilizzare lo strumento di selezione della linea retta per rilasciare le linee di base in modo da definire un'area chiusa per ogni picco di interesse.

Attivare lo strumento bacchetta, facendo clic sull'icona corrispondente nell'interfaccia utente imagej. Fare clic all'interno del picco per visualizzare i risultati per tutti i picchi in una finestra popup. Successivamente, in Excel, tracciare i valori grigi dalla finestra pop-up rispetto alle corrispondenti concentrazioni flavonoidi, per creare una curva standard basata su TLC del flavonoide autentico.

Quindi calcolare la resa del flavonoide di interesse prodotto in questo protocollo, secondo la formula risultante. Utilizzare una siringa per elaborare ogni campione in sequenza attraverso filtri da 0,45 micrometri e 0,22 micrometri. Caricare i campioni in un sistema HPLC-MS tramite ugello di aspirazione e separare i campioni a 30 gradi Celsius utilizzando una colonna C18.

Elute la colonna a un millilitro al minuto con un gradiente di 10-85 volume per cento di nitrile di acetile in acqua, e monitorare l'assorbanza dell'eluato da 200 a 800 nanometri. Eseguire l'analisi LC-MS in modalità ionica negativa, con un flusso di azoto essiccante di 10 litri al minuto a 300 gradi Celsius, in un flusso di gas di focaia di sette litri al minuto a 250 gradi Celsius, e raccogliere dati utilizzando un software integrato. Per estrarre cromatografi a lunghezza d'onda singola, aprire il programma di analisi qualitativa e fare clic su file, aprire datafile.

Selezionare il file da analizzare nella finestra del file di dati aperto e fare clic su apri per aprire il file. Fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra dei risultati del cromatogramma, quindi estrarre i cromatogrammi in un menu a comparsa. Nell'elenco dei tipi fare clic su altri cromatogrammi.

Nella casella combinata rilevatore selezionare DAD1, quindi fare clic su OK per visualizzare i risultati HPLC nella finestra dei risultati del cromatogramma. Fare clic sull'icona di integrazione manuale ancorata nella parte superiore della finestra dei risultati del cromatogramma. Disegnare la linea di base per il picco richiesto per l'analisi manuale dell'integrazione con il mouse.

Fare clic su visualizza, elenco picchi di integrazione, per visualizzare i risultati. Copiare i risultati delle aree di picco in Excel e tracciare una curva standard basata su HPLC del flavonoide autentico rispetto alle corrispondenti concentrazioni flavonoidi, quindi calcolare la resa del flavonoide di interesse prodotto in questo protocollo secondo la formula risultante. Quindi ripetere le stesse procedure per estrarre cromatogrammi a lunghezza d'onda singola per analizzare i dati MS per la massa esatta dei composti flavonoidi.

Fare clic sull'icona di selezione dell'intervallo sulla barra degli strumenti dei risultati del cromatogramma. Selezionare il picco di interesse. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell'intervallo selezionato e scegliere lo spettro MS estratto nel menu a comparsa per visualizzare i risultati nella finestra dei risultati dello spettro MS.

Per determinare se questo sistema in vitro può essere utilizzato per la conversione di un flavanone in un flavonolo, la RRN è stata aggiunta al sistema. Ci sono stati due nuovi punti emersi su una piastra TLC poliammide. Un punto mostrava una distanza di migrazione simile a quella della DHK, e gli altri simili a quella del KMF.

Ulteriori analisi di HPLC e LC-MS hanno dimostrato che la nuova sostanza chimica ha mostrato un tempo di ritenzione rispettivamente di 12 minuti e 20 minuti, in un picco ionico quasi molecolare M su Z a 287 e 285 che erano identici a quelli di DHK e KMF. Per determinare se il sistema può essere utilizzato per la conversione di altri flavanoni nei loro flavonoli corrispondenti, l'ERD è stato aggiunto al sistema. Due nuovi punti su una piastra TLC poliammide mostrava una distanza di migrazione simile a quella di DHQ e QRC rispettivamente.

Le analisi HPLC e LC-MS hanno dimostrato che queste nuove sostanze chimiche hanno rivelato rispettivamente un tempo di ritenzione di 10 minuti e 16 minuti, e un picco ionico quasi molecolare M su Z a 303 e 301, che corrispondeva esattamente a quelli del DHQ e del QRC. Quando si prepara il sistema sintetico, è necessario aggiungere l'enzima infine e aggiungere il solfato ferroso dal secondo all'ultimo. Sì, fornisce una guida per la produzione economica di altri metaboliti secondari.