Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente
25 luglio 2020
Qui presentiamo un protocollo per testare l'efficacia delle terapie mirate selezionate in base alla trucco genomico di un tumore. Il protocollo descrive l'identificazione e la convalida dei riarrangiamenti strutturali del DNA, l'innesto dei tumori dei pazienti nei topi e il test delle risposte ai farmaci corrispondenti.
Il protocollo qui descritto ha lo scopo di dimostrare un algoritmo per testare l'efficacia del trattamento utilizzando modelli di cancro in vivo. Il protocollo consiste in una combinazione di diverse tecniche. Il bio-sequenziamento dell'intero genoma dei campioni di tumore umano viene utilizzato per identificare le alterazioni genomiche.
Questi includono sia riarrangiamenti genico che cambiamenti del numero di copia genica. Quindi l'analisi delle alterazioni identificate viene eseguita al fine di selezionare cambiamenti potenzialmente drogabili. I farmaci selezionati sulla base dell'analisi genomica vengono quindi utilizzati per il trattamento in vivo di tumori corrispondenti coltivati in topi immunocompro compromessi.
L'algoritmo sviluppato rappresenta un approccio promettente per aiutare le decisioni di trattamento per la cura dei pazienti oncologici. Utilizzare lo strumento Panda o un software analogo per identificare le alterazioni indirizzabili. Possiamo elencare i geni identificati dal microsequenza risultanti come un semplice file delineato a schede usando simboli genetici accettati standard.
Aggiungere il cancello alla riga di intestazione dell'elenco per assicurarsi che l'intestazione della tabella venga trasferita al livello di percorso U del software. Caricare il file facendo clic sulla scheda di spostamento corrispondente. Assegnare una singola icona per rappresentare i dati sottostanti facendo clic sull'icona di scelta e quindi facendo clic sulla scheda finalizza.
Una volta caricati i file di un paziente, visualizzare in anteprima la pagina per identificare una colonna che visualizza il numero di geni annotati per percorso. Questa è l'ultima colonna a destra. Utilizzare un filtro percorso in alto a sinistra della finestra principale per limitare il numero di percorsi visualizzati a quelli che contengono i geni di interesse.
Per identificare le vie con più geni annotati di quanto ci si aspetterebbe per caso, utilizzare una funzione situata sotto la scheda di arricchimento. Una colonna viene quindi aggiunta alla tabella principale che mostra il valore p corrispondente dal test esatto di un Fisher. Selezionare il database per visualizzare potenziali geni drogabili dall'annotazione preimpostata controllando un'icona appropriata a sinistra della finestra principale.
Per selezionare un percorso per la visualizzazione, fare clic sul relativo nome visualizzato nella pagina visualizzatore percorsi. Le icone che rappresentano ogni gruppo di annotazioni vengono visualizzate accanto al gene associato. Cliccando su qualsiasi gene nel percorso si aprirà la corrispondente pagina delle schede geniche.
Selezionare le vie che hanno mostrato geni di interesse annotati e colpi per potenziali farmaci per ulteriori analisi. Eseguire il lavoro tissutale in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni sterili. Posare il tessuto tumorale in un piatto contenente PBS freddo o mezzi di coltura tissutale, come RPMI, DMEM, contenenti antibiotici.
Identificare e isolare materiale tumorale vitale dal tessuto normale e necrotico adiacente con l'aiuto di un patologo. Utilizzare forcep sterili e bisturi per rimuovere il materiale necrotico sottolineato da un patologo. Per eseguire l'innesto sottocutaneo, tagliare il tessuto tumorale con forcelle sterili, bisturi o forbici chirurgiche in piccoli frammenti, di dimensioni di circa 2 x 2 x 2 millimetri.
Trasferire il tessuto frammentato in una piastra di petri pre-refrigerata sul ghiaccio. Lasciare il matrigel freddo nel piatto con il tessuto frammentato, circa 200 microlitri per 10 pezzi di tessuto. Mescolare bene e lasciare che i frammenti di tessuto ammollo nel matrigel per 10 minuti.
Usa forbici chirurgiche sterili e forcep per fare un'incisione verticale della pelle di 5-10 millimetri su entrambi i fianchi di un topo. Inserire delicatamente le forcette dritte nello spazio sottocutaneo per creare una tasca abbastanza grande da poter posizionare un frammento di tumore sotto il cuscinetto grasso. Utilizzare forcep dritte sterili per inserire frammenti di tumore nella tasca precedentemente preparata in ciascuno dei cinque topi.
Chiudere l'incisione cutanea usando la colla tissutale. Dopo l'impianto, per inibire la proliferazione dei linfociti, iniettare ogni topo con 100 microlitri di rituximab. Preparare il topo per il gavage orale pizzicando la pelle della schiena e piegarla all'indietro in modo che la testa e le labbra del mouse siano immobilizzate.
Inserire la sonda di gavage nella parte posteriore della gola del mouse fino a quando la sonda raggiunge l'esofago. Assicurarsi che la sonda non sia inserita troppo lontano in quanto i polmoni del topo possono perforare causando la morte. Il galleggiante rappresentativo del genoma illustra il paesaggio dei cambiamenti genomici in un tumore.
Tipici dei tumori sierosotipi di alto livello, delle linee blu a plusvalenze e delle perdite di linee rosse, sono stati identificati indicando alti livelli di instabilità genomica. La principale alterazione di tendenza per l'intervento terapeutico nel tumore OC101 è stata un'amplificazione al cromosoma 17, che ha coinvolto ERBB2, un gene che codifica per il recettore HER2. Per convalidare i risultati a livello di DNA, diversi set di primer specifici sono stati progettati per i bordi della regione amplificata.
E la PCR è stata effettuata. Nessun prodotto di amplificazione è stato assorbito quando è stato utilizzato il DNA umano di controllo. Sono state identificate bande specifiche per il DNA tumorale OC101.
In un'altra variante tumorale, T14, sono stati osservati numerosi guadagni di DNA. Questi includevano AKT2 nei geni RICTOR. La convalida effettuata a livello proteico, utilizzando l'immunoblotting, ha mostrato alti livelli di AKT in RICTOR.
Una significativa riduzione del carico tumorale è stata osservata nel gruppo trattato con chemioterapia entro la fine della settimana sei. C'è stato un vantaggio in più rispetto alla sola chemioterapia nei gruppi che hanno ricevuto un trattamento combinato. Il tessuto tumorale è stato raccolto per l'analisi molecolare della risposta al trattamento alla fine dello studio di trattamento.
I livelli totali e fosforilati di S6, AKT e mTOR sono stati determinati utilizzando l'immunoblotting. Il confronto dei livelli di queste proteine in inibitori non trattati, trattati con chemioterapia e trattati con AKT o mTOR inhibitor ha mostrato una marcata diminuzione per gli ultimi due. L'approccio presentato è molto utile per condurre lo studio clinico nei modelli PDX.
Sfrutta le caratteristiche molecolari del tumore ottenute dalla profilazione genomica per determinare la scelta migliore dei farmaci per i test.
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Panoramica
Questo protocollo illustra un algoritmo per testare l'efficacia di terapie mirate in base alla composizione genomica dei tumori. Include l'identificazione di riarrangiamenti strutturali del DNA e l'impianto di tumori del paziente in topi per testare la risposta ai farmaci.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Oncoologia
- Genomica
- Farmacologia
Sfondo
- Le terapie mirate vengono selezionate in base alle alterazioni genomiche.
- La comprensione delle riorganizzazioni del DNA può orientare le opzioni terapeutiche.
- I modelli in vivo sono essenziali per testare l'efficacia dei farmaci.
- I topi immunocompromessi vengono utilizzati per l'innesto tumorale.
Scopo dello studio
- Verificare l'efficacia dei farmaci selezionati mediante analisi genomiche.
- Stabilire un protocollo per la sperimentazione in vivo di terapie mirate.
- Migliorare la comprensione delle risposte tumorali a trattamenti specifici.
Metodi Utilizzati
- Sequenziamento bioinformatico del genoma completo di campioni tumorali umani.
- Identificazione di alterazioni genomiche, inclusi riarrangiamenti genici.
- Selezione di alterazioni potenzialmente sensibili a farmaci sulla base dell'analisi.
- Trattamento in vivo di tumori in topi immunocompromessi.
Risultati principali
- Identificazione riuscita di riarrangiamenti strutturali del DNA.
- Convalida dei farmaci selezionati in modelli murini.
- Dimostrazione dell'efficacia del trattamento basata sull'analisi genomica.
- Informazioni sul comportamento del tumore in risposta a terapie mirate.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un quadro per la sperimentazione di terapie mirate.
- L'analisi genomica è fondamentale per selezionare trattamenti efficaci.
- I modelli in vivo sono preziosi per comprendere le risposte ai farmaci.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo protocollo consente ai team di ricerca e sviluppo biotecnologico di valutare terapie mirate utilizzando modelli di xeno innesto derivati da pazienti, guidati dal profilo genomico, sostenendo la selezione ipotesi-dipendente dei farmaci e la riduzione dei rischi meccanicistici nello sviluppo preclinico. Collegando alterazioni strutturali del DNA alla risposta funzionale ai farmaci, aumenta l'affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi terapeutici e orienta le decisioni di proseguimento o interruzione per terapie combinate. L'approccio è particolarmente rilevante per tumori con elevata instabilità genomica in cui le terapie standard falliscono e si considera l'uso fuori indicazione di farmaci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando alterazioni strutturali del DNA, come amplificazioni geniche e riarrangiamenti, a bersagli farmacologicamente trattabili come ERBB2/HER2 e AKT2.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio in vivo mediante modelli PDX, riducendo l'ambiguità meccanicistica prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Valore predittivo: Mostra una correlazione tra le previsioni genomiche e le risposte tumorali osservate, facilitando la selezione del portafoglio sulla base della fiducia nel bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati (modelli PDX) con profili genomici caratterizzati per una valutazione affidabile dei composti nei test successivi.
- Valore operativo: Standardizza i protocolli di innesto tumorale e di trattamento, migliorando la riproducibilità tra gli studi e consentendo test preclinici su larga scala.
- Prontezza del saggio: Genera letture molecolari quantitative (ad esempio, S6 fosforilata, AKT, mTOR) mediante immunoblotting per valutare l'inibizione della via metabolica e la risposta al trattamento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Utilizza tumori derivati da pazienti per mantenere la rilevanza della malattia, collegando i risultati genomici ottenuti da campioni umani a modelli in vivo.
- Validazione preclinica: Supporta decisioni di avanzamento basate sul rischio, dimostrando la riduzione del carico tumorale e gli effetti farmacologici specifici per via in vivo.
- Riduzione del rischio meccanicistica: Chiarisce se l'efficacia osservata sia attribuibile a una terapia monodrug o a un trattamento combinato, fornendo indicazioni per la progettazione di studi clinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo integra l'analisi genomica con test di efficacia in vivo, posizionandosi tra l'identificazione del bersaglio e l'ottimizzazione del composto leader nel percorso di scoperta, per consentire un avanzamento basato sui dati verso lo sviluppo preclinico.
- Biologia della scoperta Supporta il test delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici mediante la verifica se geni strutturalmente alterati siano farmacologicamente bersagliabili in vivo.
- Screening: Crea modelli PDX pronti per saggi con driver genomici noti, consentendo screening affidabili di composti e valutazione di terapie combinate.
- Analitica: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (carico tumorale, fosforilazione delle proteine) che consentono ai gruppi di confrontare gli effetti dei farmaci e valutare l'interazione con il bersaglio.
- Ricerca traslazionale Mantiene la continuità dal tumore del paziente al modello preclinico, supportando l'allineamento dei biomarcatori e la modellizzazione predittiva della risposta clinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per testare terapie mirate in diversi tipi di tumore, riducendo lo sviluppo ridondante di modelli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del bersaglio confermando che le alterazioni a livello di DNA si traducono in una sensibilità funzionale al farmaco in vivo.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di elaborazione dei tessuti, innesto e somministrazione dei farmaci.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale prioritizzando bersagli con efficacia dimostrata in vivo, riducendo il rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una prioritizzazione dei candidati farmaceutici aggiustata per il rischio, basata sulla concordanza tra la previsione genomica e la risposta nei modelli PDX.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in genomica del cancro, patologia e modellizzazione in vivo per isolare con precisione tessuto tumorale vitale e interpretare le alterazioni genomiche.
- Dipende da infrastrutture per il sequenziamento di nuova generazione e strumenti di bioinformatica (ad esempio, strumento Panda) per l'analisi delle alterazioni strutturali e l'arricchimento dei percorsi biologici.
- Necessita di procedure standardizzate per la frammentazione sterile del tumore, la miscelazione con Matrigel e l'innesto sottocutaneo, al fine di garantire il successo dell'attecchimento.
- Richiede capacità di immunoblotting per valutare la modulazione dei percorsi a valle (ad esempio, AKT/mTOR/S6) come letture farmacodinamiche.
- È limitato dal tempo e dall'intensità di risorse richiesti per la generazione di modelli PDX, il che potrebbe limitare la capacità di elaborazione in campagne di screening su larga scala.
